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Biology

Pflege, Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infizierte

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Aedes Aegypti Moskitos mit Wolbachia infiziert werden in natürlichen Populationen zu unterdrücken, die Übertragung von Arboviren freigesetzt. Wir beschreiben Methoden nach hinten Ae. Aegypti mit Wolbachia Infektionen im Labor für Experimente und Feld Freigabe, Vorsichtsmaßnahmen zum Labor Anpassung und Auswahl zu minimieren.

Abstract

Aedes Aegypti Moskitos experimentell infiziert mit Wolbachia sind in Programme, um die Ausbreitung von Arboviren wie Dengue-Fieber, Chikungunya und Zika genutzt. Wolbachia-infizierte Mücken ins Feld, entweder Populationsgrössen durch inkompatible Paarungen zu reduzieren oder Populationen mit Mücken zu verwandeln, die refraktär gegenüber Übertragung des Virus sind freigegeben werden können. Für diese Strategien, um erfolgreich zu sein müssen die Mücken, die in das Feld aus dem Labor entlassen mit einheimischen Mücken wettbewerbsfähig sein. Jedoch kann Pflege Mücken im Labor führen Inzucht, genetische Drift und Labor-Anpassung, die kann ihre Fitness im Bereich reduzieren und kann die Ergebnisse von Experimenten verwirren. Um die Eignung der verschiedenen Wolbachia Infektionen für den Einsatz im Feld zu testen, ist es notwendig, die Mücken in einer kontrollierten Laborumgebung über mehrere Generationen hinweg zu erhalten. Wir beschreiben ein einfaches Protokoll für die Aufrechterhaltung der Ae. Aegypti Moskitos in das Labor, das für beide Wolbachiaeignet-infizierten und Wildtyp Mücken. Die Methoden minimieren Labor Anpassung und Umsetzung Auskreuzung um die Bedeutung der Experimente für Feld Mücken zu erhöhen. Darüber hinaus werden Kolonien unter optimalen Bedingungen zu maximieren Sie ihre Fitness für Freiland Versionen beibehalten.

Introduction

Aedes Aegypti Moskitos sind verantwortlich für die Übertragung von einigen der wichtigsten Arboviren in der Welt, einschließlich Zika, Dengue-Fieber und Chikungunya1. Diese Viren sind eine zunehmende Bedrohung für die globale Gesundheit immer, da die weite Verbreitung von Ae. Aegypti in den Tropen weiterhin2,3,4zu erweitern. Weibliche Ae. Aegypti bevorzugt ernähren sich von menschlichem Blut5 und somit Leben in unmittelbarer Nähe zu den Menschen, insbesondere in städtischen Gebieten, wo die Populationen dichteste sind, tendenziell. Durch diese enge Verbindung mit den Menschen haben sie auch angepasst, um in künstlichen Lebensräumen, einschließlich Reifen, Töpfe, Dachrinnen und Wasser Behälter6,7zu züchten. AE. Aegypti anpassen auch leicht, Laborumgebungen, wo sie ohne spezielle Anforderungen beibehalten werden kann, nachdem er direkt aus der Praxis, im Gegensatz zu einigen anderen Arten in der Aedes Gattung8gesammelt, 9,10. Ihre Mühelosigkeit der Wartung hat gesehen, wie sie weit in das Labor in den unterschiedlichsten Bereichen studiert, letztlich mit dem Ziel, die Moskitos Krankheiten zu steuern übertragen kann.

Traditionell, stützt arbovirale Kontrolle sich auf den Einsatz von Insektiziden, Moskito-Populationen zu reduzieren. Allerdings gibt es zunehmende Interesse an Ansätze wo modifizierte Mücken im Labor gezüchtet und dann in natürlichen Populationen freigegeben sind. Freigegebene Mücken können gentechnisch11,12,13, biologisch14,15, durch Bestrahlung16, chemische Behandlung17,18, oder in Kombination mit Techniken19 um Populationen von Moskitos zu unterdrücken oder ersetzen Sie sie durch Mücken, die refraktär gegenüber arbovirale Getriebe20sind.

Wolbachia sind Bakterien, die derzeit als eine biologische Schädlingsbekämpfungsmittel für Arboviren. verwendet werden Mehrere Stämme von Wolbachia worden in Ae. Aegypti experimentell mit embryonalen Mikroinjektion21,22,23,24vor kurzem eingeführt. Diese Belastungen reduzieren die Fähigkeit von Arboviren zu verbreiten und zu replizieren im Moskito, verringern ihre Übertragung potenzielle23,25,26,27,28 . Wolbachia Infektionen sind von Mutter auf Kind, übertragen, jedoch bestimmte Stämme Sterilität verursachen, wenn infizierte Männchen paaren sich mit nicht infizierten Frauen22. Wolbachia-infizierte Männer daher in großen Mengen nach natürlichen Moskito Populationen, wie kürzlich in anderen Aedes -Arten15,29demonstriert unterdrücken freigegeben werden können. Jedoch da Wolbachia auch hemmen arbovirale Übertragung in Ae. Aegypti, können Mücken auch freigegeben, um heimische Populationen mit ärmeren Vektoren zu ersetzen. Ae. Aegypti mit Wolbachia experimentell infiziert werden jetzt in das Feld in mehrere Länder, in denen dieser letzteren Ansatz14,30,31veröffentlicht.

Wolbachia-basierte Ansätze zur arbovirale Steuerung verlassen Sie sich auf ein fundiertes Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wolbachia, die Mücke und der Umwelt. Wolbachia kommen natürlicherweise in ein breites Spektrum von Insekten, und die Stämme in Mücken eingeführt sind vielfältig in ihren Auswirkungen32. Da neue Wolbachia Infektionstypen in Ae. Aegypti24eingeführt sind, ist es notwendig, jede Belastung auf ihre Auswirkungen auf Moskito Fitness, Reproduktion und arbovirale Eingriffe unter einer Reihe von Bedingungen zu charakterisieren. Rigorose Experimente im Labor muss deshalb das Potenzial für Wolbachia Belastungen im Bereich erfolgreich zu bewerten.

Freiland-Versionen von Ae. Aegypti mit Wolbachia Infektionen können erfordern oft, dass Tausende bis Zehntausende von Mücken pro Freigabe Zone werden jede Woche14,30,31aufgezogen. Der Erfolg der ersten Releases kann verbessert werden, durch die Freigabe von Mücken von einer großen Größe ihre Fruchtbarkeit33 und Paarung Erfolg34,35maximieren. Mücken sollten auch die Gegebenheiten angepasst werden, die sie erleben werden, im Feld, aber langfristige Labor Aufzucht verursachen Veränderungen im Verhalten und Physiologie die Bereich Leistung36,37auswirken könnte, 38.

Wir beschreiben ein einfaches Protokoll für die Aufzucht von Ae. Aegypti im Labor mit Grundausstattung. Dieses Protokoll eignet sich für beide Wildtyp und Wolbachia-infizierten Mücken, von denen die letztere erfordern besondere Aufmerksamkeit, können da einige Wolbachia Stämme erhebliche Auswirkungen auf Moskito Lebensgeschichte Eigenschaften39, haben 40. die Aufzucht Bedingungen zu vermeiden, Überbelegung und Nahrungskonkurrenz Mücken eine einheitliche Größe zu produzieren, die ist entscheidend für Vektorkompetenz und Fitness Experimente und sorgt dafür, dass die Mücken gesund für Feld Release41 sind . Wir auch Vorkehrungen treffen, um Labor Anpassung und Inzucht durch Verringerung der selektiven Druck zu minimieren und sicherzustellen, dass die nächste Generation wird aus einem großen, zufällige Pool gesampelt. Jedoch Laborumgebungen unterscheiden sich deutlich von Feldbedingungen und langfristige Wartung unter ausgeruhten Bedingungen reduzieren könnte die Fitness der Mücken nach Freigabe in das Feld37,42,43 . Daher überqueren wir Frauen von Labor-Linien bis Feld gesammelt Männchen in regelmäßigen Abständen, was in Kolonien, die genetisch ähnlich für experimentelle Vergleiche sind und das Ziel Bereich Bevölkerung39angepasst sind. Die Methoden erfordern spezielle Ausrüstung und können nach hinten zig Tausenden von Individuen pro Woche für Freisetzungen hochskaliert werden. Das Protokoll priorisiert auch die Fitness der Moskitos innerhalb und zwischen den Generationen, ein wichtiger Aspekt für Insekten, die für die Einrichtung in natürlichen Populationen bestimmt. Das Protokoll ist geeignet für die meisten Labors, die erfordern Wartung von Ae. Aegypti, besonders für experimentelle Vergleiche, wo eine gleichbleibende Qualität der Mücken und Beziehbarkeit zum Feld sind wichtig.

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Protocol

Blut Fütterung der Moskitos am Menschen wurde von der University of Melbourne menschliche Ethik-Kommission genehmigt (Genehmigung Nr.: 0723847). Alle Freiwilligen zur Verfügung gestellt Einwilligung schriftliche.

1. Larvenstadium Aufzucht

Hinweis: Die Mücken sind in 26 ± 0,5 ° C und 50-70 % Relative Luftfeuchtigkeit, mit einem 12:12 h (Licht: dunkel) Photoperiode für diese Kolonie Wartungsprotokoll statt. Diese Bedingungen sind ähnlich wie die durchschnittlichen klimatischen Bedingungen in Cairns, Australien und im optimalen thermischen Bereich für Ae. Aegypti überleben und Entwicklung44,45,46. Hohe Temperaturen sollte können zum Verlust von Wolbachia Infektionen von Moskito Kolonien führen und vermieden werden47. Wir halten mindestens 500 Personen pro Einwohner um Inzucht zu minimieren; Aufrechterhaltung der Kolonien von einer kleineren Größe kann Fitness folgen [Ross Et Al. unveröffentlicht] haben. Unter diesen Bedingungen und unter der Annahme angemessener Ernährung beträgt die durchschnittliche Generationszeit 28 Tage (siehe Tabelle 1).

  1. Tauchen Sie die Eiern auf Substrat in Schalen (Abbildung 1A) mit 3 L Wasser (Umkehr-Osmose-Wasser oder im Alter von Leitungswasser, erzeugt indem man Leitungswasser in Trays für 24 Stunden vor Gebrauch), ~ 300 mg von Fischfutter (man zerdrückt tablet, siehe Tabelle der Materialien) und eine einige Körner von Trockenhefe, Schlupf48zu induzieren.
  2. Verwenden Sie einen Tag nach dem Schlupf, eine Glaspipette um ca. 500 Larven auf Tabletts mit 4 L Wasser (Abbildung 1 b) übertragen, rechnen mit einem Clicker-Zähler. Jedes Fach zwei zerkleinerten Fisch essen Tabletten hinzufügen. Bei Bedarf verwenden Sie Container in verschiedenen Größen für die Aufzucht der Larven (Abbildung 1A), aber halten Sie Larven dichten unterhalb von 0,5 Larven/mL, Überbelegung zu vermeiden.
  3. Überprüfen Sie die Schalen täglich um sicherzustellen, dass die Larven genügend Nahrung haben; Fügen Sie hinzu, etwa zwei Essen Tabletten die Fächer alle zwei Tage. Essen Ad Libitum bieten aber sicherstellen, dass 0,5 mg/Larve/Tag gibt es in diesem Zeitraum, damit Entwicklung ist synchron und Körpergröße entspricht, sonst können die Ergebnisse von Experimenten verwechselt werden (siehe Vertreter Ergebnisse).
  4. Achten Sie darauf, die Überfütterung der Larven, vor allem in kleineren Aufzucht Container mit weniger Wasser, Fläche und Volumen. Ersetzen Sie wenn das Wasser trüb aussieht oder gibt es erhebliche larval Sterblichkeit, es mit frischem Wasser; Mortalität sollte vernachlässigbar, wenn Larven optimal gefüttert werden.

(2) Erwachsene Entstehung

Hinweis: Larven fangen an, aus fünf Tage nach dem Schlupf verpuppen sich, wenn gut gefüttert und die Mehrheit sollte durch sieben Tage nach dem Schlupf verpuppen. Erwachsene beginnt etwa zwei Tage nach der Verpuppung entstehen, wenn optimal auf 26 ° C gehalten (siehe Vertreter Ergebnisse). Larvalentwicklung ist von Wolbachia Infektionen in der Regel nicht betroffen, wenn ausreichend Nahrung23,39,49vorgesehen ist.

  1. Sieben Tage nach dem Schlupf Gießen Sie den gesamten Inhalt des Behälters durch ein feines Netz (Pore Größe 0,4 mm). Halten Sie die Larven gefilterte Wasser für die spätere Verwendung im Ovicups (siehe Abschnitt "Blut füttern und Eiablage"). Drehen Sie das Netz und Tauchen sie in einen Kunststoffbehälter mit 200 mL Wasser, die Puppen zu übertragen. Geben Sie zusätzliche Nahrung, wenn Larven bleiben.
  2. Bereiten Sie die Erwachsenen Entstehung Käfige (Abbildung 1) indem Sie zwei Tassen 10 % Saccharoselösung (Abb. 1F) und zwei Tassen feuchter Watte, Austrocknung (Abbildung 1E) zu verhindern.
  3. Wenn die Puppen nicht nach Geschlecht sortiert werden müssen, legen Sie die geschlossenen Behälter der Puppen in den Käfig und lassen Sie den Deckel leicht geöffnet, die Erwachsenen in den Käfig entstehen zu lassen. Alternativ legen Sie eine umgekehrte Trichter über den Container zu ertrinken zu minimieren. Stellen Sie sicher, dass alle Erwachsenen entstanden sind, vor dem Entfernen des Containers aus dem Käfig um zu verhindern, gegen langsame Entwickler auswählen.

(3) pupal Geschlechtsbestimmung für Auskreuzung

  1. Wenn die Puppen nach Geschlecht (z.B.für Auskreuzung) sortiert werden müssen, pipette die Puppen von Larven Tabletts und trennen die Geschlechter (Abbildung 2) in Kunststoffbehälter (Abbildung 1A) mit 200 mL Wasser alle 24 h bis die gewünschte Anzahl von Geschlechterquote wurde erreicht. Deckel auf den Behälter und lassen Sie sie geschlossen.
  2. Erwachsene werden in die Behälter entstehen; bestätigen Sie ihr Geschlecht vor der Freigabe in Käfige (Abbildung 2). Entfernen Sie alle Erwachsenen sexed fälschlicherweise mit einer Absauganlage innerhalb von 24 Stunden nach der Entstehung, bevor sie sexuelle Reife erreichen. Sobald die Geschlechter bestätigt worden sind, lassen Sie die Erwachsenen in Käfige alle 24 h.
  3. Wolbachiazu erhalten-infizierten Kolonien einen ähnlichen genetischen Hintergrund einer natürlichen Bevölkerung, durch Zugabe von Wolbachiaoutcross-infizierten Weibchen aus Labor Kolonien in Käfige von nicht infizierten Männer abgeleitet aus Eiern von Ovitraps in gesammelt das Feld39, Erhaltung der vorgeschriebenen Dichte an 500 Personen pro Einwohner.
    1. Wiederholen Sie die Auskreuzung für mindestens drei aufeinander folgenden Generationen, Kolonien zu produzieren, die mindestens 87,5 % der Bereich Bevölkerung39genetisch ähnlich sind. Kritisch: Sicherzustellen, dass die Geschlechter zu diesem Zeitpunkt korrekt sind (siehe Punkt 3.1).
  4. Weiblichen Aegypti Ae. sind in der Regel refraktär gegenüber weiteren Befruchtung innerhalb von Stunden nach der Paarung50. Wenn Kolonien Auskreuzung, lassen Sie die Weibchen und Männchen in getrennten Käfigen für zwei Tage Reifen und aspirieren Sie die Weibchen in den männlichen Käfig, alle Männer die gleichen Chancen anzubieten.

(4) Blut zu füttern und Eiablage

  1. Warten Sie mindestens drei Tage nachdem das letzte Weibchen vor Blut füttern entstanden, damit um genügend Zeit, um Reifen zu können. Blut ernähren sich die Weibchen innerhalb von zwei Wochen der Entstehung, übermäßige Sterblichkeit, besonders für Moskitos mit Wolbachia Infektionen zu verhindern, die Langlebigkeit22,24,49beeinträchtigen. Entfernen Sie die Zucker Tassen am Tag vor der Fütterung um Fütterung-Raten zu verbessern.
    1. Bitten Sie einen Teilnehmer zu ihren Unterarm legen in den Käfig, die weiblichen Mücken ernähren zu können. Die meisten Weibchen sollten feed zu Übersättigung innerhalb von 5 Minuten, sondern um Auswahl gegen langsame Feeder reduzieren lassen den Unterarm in den Käfig für 15 Minuten, oder bis alle Weibchen sichtbar gestaut sind; ein Latex-Handschuh zum Schutz der Hand vor Bissen ist optional, aber empfohlen.
    2. Zwei Tage nach der Fütterung Blut, legen zwei Plastikbecher Larven Aufzucht wasserhaltige und ausgekleidet mit einem Streifen Sandpapier (Abbildung 1) (oder Filterpapier (Abbildung 1 H)) für Weibchen zur Eiablage in den Käfig. Tauchen Sie teilweise Schleifpapier Streifen im Wasser um es feucht zu halten. Entfernen Sie andere Quellen von Wasser zu verhindern, dass die Weibchen ihre Eiablage außerhalb der Eiablage-Cup.
      Hinweis: Leitungswasser verwendet werden, in den Tassen, sondern Larven Aufzucht Wasser fördert die Eiablage51,52 und Weibchen wird Eiablage mehr synchron.

5. die Eizellentnahme und Konditionierung

  1. Die Weibchen werden auf das Schleifpapier knapp oberhalb der Wasserlinie Eiablage; sammeln Sie und ersetzen Sie die Streifen Sandpapier täglich, bis keine weitere Eiablage. Beachten Sie, dass die Eiablage bis zu einer Woche dauern kann.
  2. Teilweise trocken das Schleifpapier Streifen durch beflecken sie sanft auf einem Papiertuch für 30 s, kümmert sich nicht um die Eizellen zu verdrängen. Dann wickeln Sie die Streifen in einem Blatt Küchenpapier trocken und legen Sie sie in einen verschließbaren Plastikbeutel (Abbildung 1I).
  3. Überprüfen Sie den Zustand der Eier unter dem sezierenden Mikroskop (Abbildung 3). Wenn das Schleifpapier Streifen sind zu nass, schlüpfen kann vor wird unter Wasser (Abb. 3 b), aber wenn zu hart getrocknet, Eiern können einstürzen (Abbildung 3).
  4. Die Eizellen können jederzeit über drei Tage Post-Sammlung schraffiert werden sollen; schlüpfen Sie alle Eizellen von jeder Kolonie, gesammelt über alle Tage in einem Behälter des Wassers zu gewährleisten, dass die nächste Generation aus einem großen, zufällige Pool von Einzelpersonen gesampelt wird.
  5. Halten Sie für die langfristige Lagerung die Eizellen in einem verschlossenen Behälter bei einer Luftfeuchtigkeit hoch (> 80 %) bei etwa 20 ° C. Unter diesen Bedingungen können mehrere Monate unter Beibehaltung hoher Luke Preise53,54Eiern ohne Wolbachia aufbewahrt werden.
  6. Da einige Wolbachia Infektionen erheblich die Lebensfähigkeit von Eiern mit Alter49,55 reduzieren, schlüpfen die Eizellen von Wolbachia-infizierten Linien innerhalb einer Woche Sammlung gegen übermäßige Sterblichkeit für die relevanten Stämme. Blut ernähren die Weibchen nach einer Woche wieder, wenn mehr Eiern benötigt werden.
Tag Schritt
0 Luke Eiern
1 Anzahl Larven in trays
7 Larven und Puppen in Kolonie Käfige zu übertragen
17 Blut ernähren weibliche Erwachsene
21 Beginnen, sammeln von Eiern
25 Sammeln von Eiern zu beenden
28 Luke Eiern

Tabelle 1: Übersicht über die Ae. Aegypti Kolonie Wartungsplan bei 26 ° c Das Timing der weiblichen Blut-Fütterung und das Ausbrüten von Eiern ist flexibel, aber lange Laufzeiten auf diesen Stufen sollte vermieden werden, insbesondere für Mücken infiziert mit Wolbachia, um Sterblichkeit zu minimieren. Nach diesem Zeitplan minimiert Selektion gegen Mücken, die schnell oder langsam zu entwickeln und zu Reifen in allen Lebensphasen, vorausgesetzt, dass Larven optimal gefüttert werden.

Figure 1
Abbildung 1: Ausrüstung für die Aufzucht von Ae. Aegypti im Labor. (A) Kunststoffbehälter verwendet für Bruteier oder zur Aufzucht von Larven mit einem Volumen von 500, 750 und 5.000 mL (von links nach rechts). (B) Tabletts für die Aufzucht der Larven bei einer kontrollierten Dichte, in der Regel 500 Larven in 4 L Wasser verwendet. (C) (D) 3 L Käfige verwendet für Gehäuse Erwachsene und 19,7 L. Einer Dichte von 25 Erwachsenen oder weniger pro Liter sollten beibehalten werden, um ausreichend Platz zu bieten. (E) 35 mL Tasse mit feuchter Watte als eine Quelle des Wassers für Erwachsene zur Verfügung gestellt. (F) 35 mL Tasse mit Saccharoselösung durch eine Schnur oder zahnärztliche Docht als eine Quelle des Zuckers zur Verfügung gestellt. (G–H) Tassen mit Larven Aufzucht Wasser gefüllt und mit einer Eiablage Substrat aus Sandpapier oder Filterpapier ausgekleidet (G und H, beziehungsweise). (ich) Zip-Lock Beutel zur Aufbewahrung von Schleifpapier Streifen oder Filterpapier verwendet. Schwarze Flecken auf Sandpapier sind Moskito Eiern. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Lateral (A) und dorsalen (B) Blick auf Puppen und Erwachsenen Ae. Aegypti (C) zeigen ihre sexuellen Dimorphismus. Männchen sind Weibchen in jedes Panel rechts und links positioniert. Wenn optimal gefüttert, unterscheiden sich männliche und weibliche Puppen Größe; die Weibchen sind größer als die Männchen (A) und haben eine relativ bauchigen Cephalothorax im Vergleich zu Männern die flachere Seiten (B) haben. Männlichen Erwachsenen unterscheiden sich leicht von Frauen unter allen Aufzucht Bedingungen, vor allem durch ihre federen Antennen und langen Palpen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3. Vier Tage alten Ae. Aegypti Eiern unter verschiedenen Bedingungen. (A) Intact Eiern auf Schleifpapier Streifen bei Luftfeuchtigkeit hoch (> 80 %), aber ohne jede sichtbare Feuchtigkeit gepflegt. Schlüpfraten sollte über 90 % für Wildtyp Ae. Aegypti , wenn richtig gepflegt. (B) Eiern, die schlüpfen vor wird unter Wasser (frühreif Schraffur) zeichnen sich durch eine freistehende Ei-Kappe und sichtbar Larve. Dies bedeutet, dass der Streifen Sandpapier zu feucht gehalten wurde. (C) Eiern, die zu hart getrocknet werden können zusammenbrechen, und sind gut sichtbar durch ihre konkave auftreten. Wenn das Schleifpapier steif wird bedeutet dies auch, dass die Eizellen zu trocken sein können. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Representative Results

Abbildung 4 zeigt die Auswirkungen der suboptimale Ernährung auf die Entwicklung von Ae. Aegypti Larven. Wenn Container verfügen über 0,25 mg Futter pro Larve pro Tag oder weniger, die Entwicklungszeit erhöht für Männer und Frauen, und ist weniger synchron als im Container mit 0,5 mg von Lebensmitteln versehen. Wenn angemessener Nahrung nicht während der gesamten Dauer der Larvalentwicklung erfolgt, hätte dies negative Auswirkungen auf den Zeitpunkt der Wartung. Langsam entwickeln Individuen sind gefährdet, gegen ausgewählt, Blut zu füttern kann verzögert werden und gibt es ein höheres Risiko für Erwachsenensterblichkeit Vergehen Reproduktion.

Abbildung 5 zeigt die Flügellänge (eine Schätzung der Körpergröße) von Ae. Aegypti Erwachsene unter einer Vielzahl von Ernährung Regime aufgezogen. Flügel Längen von Männchen und Weibchen deutlich verringern und variabler geworden, wenn die Ernährung suboptimal ist. Einheitliche Körpergrößen sind wichtig für experimentelle Vergleiche als Körpergröße positiv assoziiert mit Fruchtbarkeit ist und große Mücken sollen größere Fitness unter Feld Bedingungen33,34,35 ausstellen .

Die Auswirkungen von Wolbachia Infektionen auf die oben genannten Merkmale sind in anderen Studien beschrieben, aber im Allgemeinen gibt es wenig bis keine Wirkung23,39,49.

Figure 4
Abbildung 4: Kumulierte Anteil der Ae.aegypti (A) Weibchen und (B) Männchen entwickeln bis zum Erwachsenenalter unter verschiedenen Speisen Regimen bei 26 ° C. 100 Larven aufgezogen wurden, in Behältnissen mit 500 mL Wasser (Larven Dichte von 0,2 Larven pro mL), mit verschiedenen Ebenen von Lebensmitteln zur Verfügung gestellt (siehe Table of Materials) für ihre Entwicklungszeit und erzielte. Nur die Larven, die überlebten, wurden berücksichtigt. Fehlerbalken sind Standardfehler mit n = 4 Wiederholungen pro Behandlung. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Flügellänge von Ae.aegypti (A) Weibchen und (B) Männchen entwickeln unter verschiedenen Speisen Regimen bei 26 ° C. 100 Larven wurden in 500 mL Wasser (Larven Dichte von 0,2 Larven pro mL) aufgezogen und mit verschiedenen Ebenen von Lebensmitteln zur Verfügung gestellt. Eine Teilmenge der Erwachsenen wurde dann für ihre Flügellänge mit oben beschriebenen Methoden56gemessen. Fehlerbalken sind Standardabweichungen. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

Nach dem Protokoll hier vorgestellten für die Wartung von Wolbachia-infizierten Ae. Aegypti sollten sicherstellen, dass gesunde Mücken eine gleich bleibende Qualität für Experimente entstehen und Freisetzungen zu öffnen. Im Gegensatz zu anderen Protokollen, die die Produktion von großen Mengen von Mücken priorisieren (siehe Referenz-57), sind die Methoden konzentriert sich auf die Maximierung ihrer Fitness, sowohl innerhalb der Generationen durch entspannte Aufzucht Durchführungsbedingungen und über Generationen von Inzucht, Auswahl und Labor Anpassung zu minimieren. Dieses Protokoll sollte eignet sich auch speziell für Ae. Aegypti mit Wolbachia Infektionen jedoch für jede Art von Ae. Aegyptigeeignet. Es ist jedoch nicht geeignet für die Aufzucht von großen Mengen (in der Größenordnung von Millionen pro Woche), die was für sterile oder inkompatible Insekt Versionen erforderlich, die hohe Zahl sein können an Bevölkerung Unterdrückung57,58zu erreichen benötigen.

Es gibt einige wichtige Schritte, die sorgfältig befolgt werden sollten. Es ist wichtig, die Larven optimal zu ernähren und für die Dauer ihrer Entwicklung Überbelegung zu vermeiden. Dadurch wird sichergestellt, dass die Mücken synchron entwickeln und eine einheitliche Größe haben. Auch sollte die besondere Vorsicht geboten, wenn die Eizellen Klimaanlage; Larven können sehr leicht zu früh schlüpfen oder Eiern können auszutrocknen, wenn die Eiablage Substrate zu nass oder trocken, bzw. sind. Alle Schritte im Protokoll empfiehlt es sich, so dass genügend Zeit für so viele Menschen in der Kolonie möglichst jede Etappe zu bewältigen. Selektion gegen Einzelpersonen, die sind langsam zu entwickeln, Reifen, Blut-Futter, oviposit oder schlüpfen führt wahrscheinlich zum Verlust der genetischen Variation.

Wir beachten Sie einige weitere Überlegungen für die Wartung von Wolbachia-infizierten Mücken, die nicht in das obige Protokoll beschrieben werden. Es ist möglich, dass Wolbachia Infektionen aus Labor Kolonien verloren, und wir empfehlen daher, dass die Kolonien für ihre Wolbachia Infektionsstatus routinemäßig überwacht werden. Wir verwenden quantitative Polymerase-Kettenreaktion (qPCR)49,59 , um mindestens 30 Personen aus jeder Wolbachiazu testen-Linie jede Generation infiziert. Wenn andere Personen für die entsprechenden Wolbachia -Infektion negativ testen, können Kolonien gereinigt werden, indem so viele Frauen wie möglich aus der betroffenen Kolonie zu isolieren und dann mit Nachkommen von infizierten Müttern nur, die nächste Generation zu finden. Die Ursache für den Verlust von etwas Wolbachia Belastungen aus Labor Kolonien ist weitgehend unbekannt, aber durch den Ausfall von Temperaturregelungen, erklärt werden konnten, wie hohe Temperaturen Wolbachia Infektionen47verloren gehen können, 60.

Kolonien und Experimente können auch mit Personen aus verschiedenen Linien kontaminiert werden, wenn nicht geachtet wird bei der Aufzucht. Verunreinigungen kann resultieren aus unvorsichtige Pipettieren der Larven, mischen Sie Chargen von Eiern, Etikettenschwindel Käfige oder nicht falsch Geschlechtsbestimmung Puppen in kreuzt. Besondere sollte daher Vorsicht beim Umgang mit Kolonien mit verschiedenen Wolbachia -Infektion. Gründlich reinigen Eiablage Tassen, Schalen und Käfige vor wiederverwenden, Aufzucht, Pipetten vor dem Umgang mit jeder neuen Tablett mit Larven und reinigen Sie das Netz jedes Mal beim übertragen von Larven und Puppen in anderen Behältern. Darüber hinaus untersuchen Sie Finger Eier beim Umgang mit Schleifpapier Streifen und frisches Papierhandtücher verwenden, beim Trocknen jeder Streifen sorgen dafür, dass Erwachsene das richtige Geschlecht sind vor der Freigabe in Käfige und Ausreißer schnell bearbeiten. Diese Vorsichtsmaßnahmen sollten die meisten Verunreinigungen vermeiden, aber Kolonien sollten noch routinemäßig überwacht werden mit diagnostischen Tests59.

Weiblichen Aegypti Ae. erfordern eine Blutmahlzeit, um Eier und Labors auf der ganzen Welt bieten ihnen in einer Vielzahl von Möglichkeiten, aus Membran Fütterung Systeme57, zurückhaltende Tiere61 und, in geringerem Maße, künstliches Blut62 . Jedoch Moskitos mit experimentellen Wolbachia Infektionen oft schlecht auf nicht-menschliche Blut durchführen und können aufweisen, reduzierte Fruchtbarkeit und Schlüpfraten und unvollständige Übertragung von Wolbachia auf ihre Nachkommen63, 64 , 65. Pflege der Aufgeschlossenheit der Weibchen auf menschliche Gerüche ist auch wichtig für Mücken in das Feld freigegeben werden, und durch Membranen oder andere Tiere füttern kann diese Fähigkeit37beeinträchtigen. Wir entscheiden uns deshalb um den Unterarm des Freiwilligen für diese Kolonie Wartungsprotokoll verwenden obwohl andere Methoden unter bestimmten Umständen erforderlich sind. Blut sollte durch andere Mittel zugeführt werden, bei der Arbeit direkt mit Arboviren, und Vorsicht geboten, wenn Kolonien von Feld-Populationen mit hoher Viruslast stammen, wie Transovarial Übertragung von Arboviren66auftreten kann. Probanden sollten auch nicht Blut Futter, wenn sie vor kurzem arbovirale endemische Ländern besucht haben, da möglicherweise ein Risiko der Übertragung.

Unsere Wartung Protokoll zielt darauf ab, Labor-Anpassung und selektiven Druck zu minimieren, aber es gibt Raum für Verbesserungen. Leftwich Et al. 42 Empfehlungen weitere zur Erhaltung der Fitness von Mücken für Freiland-Versionen, einschließlich der Verwendung von vielfältiger und natürlicher Larven Diäten reduzieren die Dichte der Erwachsenen in Käfigen und eine komplexe Umgebung. Diese Überlegungen können die Fitness der Ae. Aegypti auf eine höhere Ebene verbessern, obwohl es keine Hinweise auf Veränderungen der Fitness durch Labor-Anpassung unter den hier beschriebenen Wartungsprotokoll [Ross Et Al. unveröffentlicht derzeit]. Einige zusätzlichen Maßnahmen darf nicht für Labore mit wenig Platz und Ressourcen möglich sein, aber sind dennoch lohnt. Erhalt der großen Bevölkerung Größen, Vermeidung von großen selektiven Druck durch Aufzucht Protokolle und Umsetzung sollte bei der Sicherstellung hohen Fitness von Ae. Aegypti für Freiland-Releases periodische Auskreuzung auf Feld Mücken helfen. Die Prinzipien der Ansatz können auf andere Krankheit Vektor-Arten für die Freigabe zu manipulieren oder zu unterdrücken natürliche Populationen Aufzucht angewendet werden.

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Disclosures

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Acknowledgments

Wir erkennen Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson und Clare Doig für ihre Beiträge zur Entwicklung unserer Kolonie Wartung Methoden und drei anonymen Gutachtern für ihre Vorschläge, die dazu beigetragen, um das Manuskript zu verbessern. Unsere Forschung stützt sich auf ein Programm Grant und Kameradschaft, AAH von den National Health und Medical Research Council und eine Übersetzung vom Wellcome Trust zu gewähren. PAR ist ein Empfänger von einem australischen Regierung Training Programm Forschungsstipendium.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

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