Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Mantener los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Los mosquitos Aedes aegypti infectados con Wolbachia están siendo liberados en las poblaciones naturales para suprimir la transmisión de arbovirus. Se describen métodos para posterior Ae. aegypti con Wolbachia infecciones en el laboratorio para los experimentos y la liberación del campo, tomar precauciones para reducir al mínimo la selección y adaptación de laboratorio.

Abstract

Los mosquitos Aedes aegypti infectados experimentalmente con Wolbachia se están utilizando en los programas para controlar la propagación de arbovirus como el dengue, el chikungunya y Zika. Wolbachia-mosquitos infectados pueden ser lanzados en el campo o bien reducir el tamaño de la población a través de cruzamientos incompatibles o transformar las poblaciones de mosquitos que son refractarios a la transmisión del virus. Para que estas estrategias tener éxito, los mosquitos liberados en el campo del laboratorio deben ser competitivos con los mosquitos nativos. Sin embargo, mantener los mosquitos en el laboratorio resulta en endogamia, deriva genética y adaptación de laboratorio que puede reducir su aptitud en el campo y puede confundir los resultados de experimentos. Para probar la idoneidad de diferentes infecciones de Wolbachia para el despliegue en el campo, es necesario mantener los mosquitos en un entorno de laboratorio controlado a través de múltiples generaciones. Se describe un protocolo simple para mantener los mosquitos Ae. aegypti en el laboratorio, que es conveniente para ambos Wolbachia-mosquitos infectados y tipo salvaje. Los métodos minimizan la adaptación de laboratorio y aplicación exogamia para aumentar la relevancia de los experimentos a los mosquitos de campo. Además, las colonias se mantienen en condiciones óptimas para maximizar su aptitud para los lanzamientos de campo abierto.

Introduction

Los mosquitos Aedes aegypti son responsables para la transmisión de los arbovirus más importantes del mundo, incluyendo dengue, Zika y chikungunya1. Estos virus se están convirtiendo en una amenaza creciente para la salud global, como la distribución generalizada de Ae. aegypti en las zonas tropicales continúa ampliando2,3,4. Hembra de Ae. aegypti preferentemente se alimentan de sangre humana5 y así tienden a vivir en proximidad cercana a los seres humanos, particularmente en las zonas urbanas donde las poblaciones son más densas. A través de esta asociación cercana con los seres humanos también se han adaptado para reproducirse en ambientes artificiales, como neumáticos, macetas, canaletas y tanques de agua6,7. AE. aegypti también fácilmente adaptarse a entornos de laboratorio donde se puede mantener sin cualquier requisito especial después de ser recogido directamente en el campo, a diferencia de algunas otras especies de Aedes género8, 9,10. Su facilidad de mantenimiento ha visto ampliamente estudiado en el laboratorio en una amplia gama de campos, en última instancia, con el objetivo de controlar los mosquitos de enfermedades puede transmitir.

Tradicionalmente, control por arbovirus depende en gran medida el uso de insecticidas para reducir poblaciones de mosquitos. Sin embargo, hay creciente interés en los enfoques donde los mosquitos modificados son criados en el laboratorio y luego liberados en las poblaciones naturales. Los mosquitos liberados pueden modificarse genéticamente11,12,13, biológicamente14,15, a través de irradiación16, tratamiento químico17,18, o combinación de técnicas19 para suprimir las poblaciones de mosquitos o reemplazarlos con los mosquitos que son refractarios a transmisión arboviral20.

Wolbachia son bacterias que se utilizan actualmente como un agente de control biológico para arbovirus. Varias cepas de Wolbachia se introdujeron recientemente en Ae. aegypti experimentalmente usando microinjection embrionario21,22,23,24. Estas cepas reducen la capacidad de arbovirus a difundir y replicar en el mosquito, disminuyendo su transmisión potencial23,25,26,27,28 . Wolbachia infecciones se transmiten de madre a hijos, sin embargo algunas cepas inducen esterilidad cuando los machos infectados aparean con las hembras no infectadas22. Wolbachia-varones infectados por lo tanto pueden ser lanzados en grandes cantidades para suprimir las poblaciones de mosquitos naturales, recientemente demostradas en otras especies de Aedes 15,29. Sin embargo, puesto que Wolbachia también inhiben la transmisión arboviral en Ae. aegypti, mosquitos pueden también lanzar para reemplazar las poblaciones nativas con vectores más pobres. Ae. aegypti infectado experimentalmente con Wolbachia ahora están siendo liberados en el campo en varios países con este último enfoque14,30,31.

Wolbachia-basada en enfoques de control arboviral dependen de una sólida comprensión de las interacciones entre Wolbachia, el mosquito y el medio ambiente. Wolbachia ocurre naturalmente en una amplia gama de insectos, y las tensiones que introducen los mosquitos son diversas en sus efectos32. Como se introducen nuevos tipos de infección por Wolbachia en Ae. aegypti24, es necesario caracterizar cada cepa por sus efectos en la aptitud de mosquito, reproducción y arboviral interferencia en una variedad de condiciones. Experimentación rigurosa en el laboratorio, por tanto, es necesaria para evaluar el potencial de las cepas de Wolbachia tener éxito en el campo.

Notas de campo abierto de Ae. aegypti con Wolbachia infecciones a menudo pueden requerir miles a decenas de miles de mosquitos por la zona de lanzamiento para ser criaban cada semana14,30,31. El éxito de los lanzamientos iniciales puede mejorarse liberando mosquitos de gran tamaño para maximizar su fecundidad33 y acoplamiento éxito34,35. Los mosquitos también deben ser adaptados a las condiciones que se experimentan en el campo, cría de laboratorio sin embargo a largo plazo puede causar cambios en comportamiento y fisiología que podría afectar el campo rendimiento36,37, 38.

Se describe un protocolo simple para la cría de Ae. aegypti en el laboratorio utilizando equipamiento básico. Este protocolo es conveniente para ambos tipo de salvaje y Wolbachia-infectados por mosquitos, que puede requerir especial atención ya que algunas cepas de Wolbachia tienen efectos sustanciales sobre la historia de la vida rasgos de mosquito39, 40. las condiciones de cría evitar el hacinamiento y la competencia por el alimento producir mosquitos de tamaño constante, que es crítica para la competencia de vector y los experimentos de fitness y asegura que los mosquitos son saludables para el lanzamiento de campo41 . También tomamos precauciones para minimizar la adaptación del laboratorio y la endogamia mediante la reducción de presiones selectivas y asegurándose de que la próxima generación se muestrea de una piscina grande, al azar. Sin embargo, los entornos de laboratorio son claramente diferentes de las condiciones de campo, y mantenimiento a largo plazo en condiciones relajadas podría reducir la capacidad de los mosquitos al soltar en el campo37,42,43 . Por lo tanto cruzamos las hembras de líneas de laboratorio al campo los hombres periódicamente, dando lugar a colonias que son genéticamente similares comparaciones experimentales y que se adaptan a la meta de población campo39. Los métodos no requieren de ningún equipo especializado y pueden ampliarse a posterior decenas de miles de personas por semana para los lanzamientos de campo. El protocolo también da prioridad a la aptitud de mosquitos dentro y a través de generaciones, una consideración importante para los insectos destinados al establecimiento de las poblaciones naturales. El protocolo es conveniente para la mayoría de los laboratorios que requieren mantenimiento de Ae. aegypti, especialmente para las comparaciones experimentales donde una calidad constante de los mosquitos y relatability al campo son importantes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Sangre alimentación de los mosquitos en seres humanos fue aprobada por la Universidad de Melbourne Comité de ética humana (aprobación #: 0723847). Todos los voluntarios siempre informaron consentimiento.

1. larvas de crianza

Nota: Los mosquitos se llevan a cabo en 26 ± 0,5 ° C y 50-70% de humedad relativa, con un fotoperiodo de 12:12 h (luz: obscuridad) para este protocolo de mantenimiento de la Colonia. Estas condiciones son similares a las condiciones climáticas promedio en Cairns, Australia y dentro del rango térmico óptimo para la supervivencia de Ae. aegypti y desarrollo44,45,46. Altas temperaturas pueden resultar en la pérdida de colonias de mosquitos Wolbachia infecciones y deben ser evitada47. Mantener a por lo menos 500 individuos por población para minimizar la endogamia; mantenimiento de colonias de un tamaño más pequeño puede tener consecuencias de fitness [Ross et al. no publicado]. Bajo estas condiciones y suponiendo que una nutrición adecuada, el tiempo de generación promedio es de 28 días (ver tabla 1).

  1. Sumergir los huevos en el sustrato en bandejas (figura 1A) que contiene 3 L de agua (agua de ósmosis inversa de agua, generado por dejar agua en bandejas para 24 h antes de su uso), ~ 300 mg de alimento para peces (uno aplastado comprimidos, véase Tabla de materiales) y un pocos granos de levadura seca activa para inducir incubar48.
  2. Un día después de la eclosión, utilice una pipeta de vidrio para transferir aproximadamente 500 larvas a bandejas que contiene 4 L de agua (figura 1B), cuenta con un contador de clicker. Añadir dos tabletas de alimento de pescado picado a cada bandeja. Si es necesario, utilizar recipientes de diferentes tamaños para la cría de las larvas (figura 1A), pero mantener densidades larvales por debajo de 0.5 larvas/mL para evitar el hacinamiento.
  3. Verifique las bandejas diariamente para asegurar que las larvas tengan alimento suficiente; Añadir aproximadamente dos tabletas de alimento a las bandejas cada dos días. Proporciona alimento ad libitum pero asegurar que 0.5 mg/larva/día está disponible durante este período para asegurar desarrollo es sincrónico y tamaño del cuerpo es constante, de lo contrario se pueden confundir los resultados de experimentos (ver resultados de representante).
  4. Tenga cuidado para evitar la sobrealimentación de larvas, particularmente en recipientes más pequeños cría con agua menos volumen y superficie. Si el agua se ve turbio o si existe significativa mortalidad larvaria, reemplazarlo con agua fresca; la mortalidad debe ser despreciable si las larvas se alimentan de forma óptima.

2. adulto aparición

Nota: Larvas empiezan a pupar de cinco días después de la eclosión si bien alimentados y la mayoría debe pupate por siete días después de la eclosión. Adultos comenzará a emerger aproximadamente dos días después de la pupación si mantiene óptimo en 26 º C (ver Resultados de representante). Desarrollo larvario está normalmente afectado por infecciones de Wolbachia cuando se proporciona abundante comida23,39,49.

  1. Siete días después de la eclosión vierta todo el contenido de la bandeja a través de una malla fina (0,4 mm de tamaño de poro). Guardar el agua filtrada de larvas para su uso posterior en ovicups (vea la sección "Alimentación y oviposición de la sangre"). Invierta la malla y sumergirla en un recipiente de plástico con 200 mL de agua para transferir las pupas. Proporcionar alimento adicional si cualquier larvas permanecen.
  2. Suministro de dos tazas de solución de sacarosa al 10% (Figura 1F) y dos tazas de algodón húmedo para evitar la desecación (Figura 1E) para preparar las jaulas de aparición adulta (figura 1).
  3. Si no necesita las pupas clasificar por sexo, coloque los envases con tapa de pupas en la jaula y deje la tapa ligeramente abierta para permitir que los adultos que emergen en la jaula. Como alternativa, colocar un embudo invertido sobre el recipiente para minimizar el ahogamiento. Asegúrese de que todos los adultos han surgido antes de retirar el recipiente de la jaula para evitar la selección contra desarrolladores lento.

3. pupa de sexado para cruzamiento exogámico

  1. Si las pupas tienen que clasificar por sexo (p. ej., para la exogamia), pipetear las pupas de bandejas de larvas y separar los sexos (figura 2) en envases de plástico (figura 1A) con 200 mL de agua cada 24 h hasta el número deseado de cada sexo se ha llegado. Coloque las tapas de los envases y dejarlos cerrados.
  2. Adultos surgirán en los envases; confirmar su sexo antes de soltar en jaulas (figura 2). Retire a cualquier adultos sexuados incorrectamente con un aspirador dentro de 24 h de aparición antes de que alcancen la madurez sexual. Una vez estén confirmados los sexos, liberar a los adultos en jaulas cada 24 h.
  3. Para obtener la Wolbachia-outcross colonias infectadas de un fondo genético similar a un natural de la población, mediante la adición de Wolbachia-infectados hembras de colonias de laboratorio a las jaulas de los machos no infectadas derivados de huevos recogidos por ovitraps en el campo39, manteniendo la densidad prescrita de 500 individuos por población.
    1. Repita la exogamia para que por lo menos tres generaciones consecutivas producir colonias que son similar genéticamente a la población de campo39menos de 87.5%. Crítica: Asegurarse de que los sexos son correctos en esta etapa (ver paso 3.1).
  4. Hembra de Ae. aegypti son generalmente refractarios a otra inseminación dentro de horas del apareamiento50. Cuando exogamia colonias, permitir que las hembras y machos maduran en jaulas separadas durante dos días y luego aspirar las hembras en la jaula del macho proporcionar igualdad de oportunidades a todos los varones.

4. sangre de alimentación y oviposición

  1. Espere por lo menos tres días después de la última hembra surgió antes de sangre alimentación para permitir suficiente tiempo madurar. Sangre alimenta a las hembras dentro de dos semanas de emergencia para prevenir la mortalidad excesiva, particularmente para los mosquitos con infecciones de Wolbachia que afectar longevidad22,24,49. Retirar las tazas de azúcar el día antes de la alimentación para mejorar las tasas de alimentación.
    1. Pedir un voluntario para insertar su antebrazo en la jaula para permitir que los mosquitos femeninos alimentar. Mayoría de las hembras debe alimentar a saciedad dentro de 5 minutos, pero para reducir la selección contra alimentadores lento, dejar el antebrazo en la jaula durante 15 min, o hasta que todas las hembras están visiblemente engorged; un guante de látex para proteger la mano de las mordeduras es opcional pero recomendado.
    2. Dos días después de alimentarse de la sangre, colocar dos vasos de plástico que contiene agua de cría larval y forrado con una tira de papel de lija (figura 1) (o papel de filtro (figura 1 H)) en la jaula de las hembras a desovar. Parcialmente se sumerja la tira de papel de lija en el agua para mantenerlo húmedo. Eliminar otras fuentes de agua para evitar que las hembras pongan sus huevos fuera de la Copa de la oviposición.
      Nota: agua del grifo se puede utilizar en las tazas, pero fomenta la cría de larvas agua oviposición51,52 y las hembras pondrán sus huevos más síncrono.

5. huevo recogida y acondicionamiento

  1. Las hembras desovan en el papel de lija por encima de la línea de agua; recoger y reemplazar las tiras de papel de lija diariamente hasta que no se colocan más huevos. Tenga en cuenta que oviposición puede continuar por hasta una semana.
  2. Tiras de lija parcialmente seca frotando suavemente los sobre una toalla de papel para 30 s, teniendo cuidado de no para desalojar los huevos. Luego, envuelva las tiras en una hoja de toalla de papel y colóquelo en una bolsa de plástico sellable (figura 1I).
  3. Compruebe el estado de los huevos con un microscopio de disección (figura 3). Si tiras el papel de lija está demasiado húmedo, pueden eclosión de los huevos antes de ser sumergida en agua (figura 3B), pero si seca demasiado duramente, huevos pueden colapsar (figura 3).
  4. Los huevos pueden ser rayitas en cualquier momento más allá de la colección después de tres días; eclosionan todos los huevos de cada colonia, recogidos a través de todos los días, en el mismo contenedor de agua para asegurar que la próxima generación se muestrea de una piscina grande, al azar de los individuos.
  5. Para el almacenamiento a largo plazo, mantener los huevos en un recipiente cerrado a una humedad alta (> 80%) en alrededor de 20 ° C. En estas condiciones, huevos sin Wolbachia pueden almacenarse durante varios meses manteniendo alta Portilla tarifas53,54.
  6. Como algunas infecciones de Wolbachia reducen enormemente la viabilidad de huevos de edad49,55, eclosionan los huevos de Wolbachia-infectados líneas dentro de una semana de la colección para evitar la mortalidad excesiva de los cepas. Sangre alimenta a las hembras otra vez después de una semana si se necesitan huevos.
Día Paso
0 Huevos de Portilla
1 Conteo de larvas en las bandejas
7 Transferencia de larvas y pupas a jaulas de Colonia
17 Alimentación de hembras adultas de la sangre
21 Comenzar a colectar huevos
25 Final, recolección de huevos
28 Huevos de Portilla

Tabla 1: Resumen del programa de mantenimiento de Ae. aegypti Colonia a 26 ° C. La sincronización de la hembra alimentan de sangre y la eclosión de los huevos es flexible, pero deben evitarse largas duraciones en estas etapas, particularmente para los mosquitos infectados con Wolbachia, con el fin de minimizar la mortalidad. Siguiendo este esquema minimiza la selección contra los mosquitos que son rápidos o lentos para desarrollar y madurar en todas las etapas de la vida, siempre y cuando las larvas se alimentan de óptimo.

Figure 1
Figura 1: Equipo utilizado para la cría de Ae. aegypti en el laboratorio. (A) envases de plástico utilizados para huevos para incubar o criar larvas con cantidades de 500, 750 y 5.000 mL (de izquierda a derecha). (B) bandejas usadas para la cría de larvas en una densidad controlada, generalmente de 500 larvas en 4 L de agua. (C) 19.7 L y (D) L 3 jaulas utilizados para los adultos de la vivienda. Una densidad de adultos de 25 o menos por litro debe ser mantenido para proporcionar suficiente espacio. (E) taza de 35 mL con algodón húmedo proporcionado como una fuente de agua para adultos. (F) taza de 35 mL con solución de sacarosa proporcionada a través de un cable o mecha dental como una fuente de azúcar. (G–H) Tazas con agua de cría larval y alineado con un sustrato de oviposición de papel de lija o papel de filtro (G y H, respectivamente). () Cierre de cremallera bolsa para almacenamiento de las tiras de papel de lija o papel de filtro. Puntos negros en la papel de lija son huevos de mosquito. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Lateral (A) y dorsales (B) vistas de pupas y adultos Ae. aegypti (C) demostrar su dimorfismo sexual. Los machos se colocan a la izquierda y las hembras a la derecha de cada panel. Cuando se alimenta óptimamente, pupas de machos y hembras se diferencian por tamaño; las hembras son más grandes que los machos (A) y tienen un cefalotórax con bulbo relativamente en comparación con los machos que tienen caras planas (B). Adultos masculinos se distinguen fácilmente de las hembras en todas las condiciones de cría, sobre todo por sus antenas plumosos y largos palpos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3. Cuatro días de edad huevos de Ae. aegypti en condiciones diferentes. Intactos (A) huevos en tiras de papel de lija, mantenidas a una humedad alta (> 80%) pero sin ninguna humedad visible. Tipos de Hatch deben ser sobre el 90% de tipo salvaje Ae. aegypti si mantiene correctamente. (B) huevos que eclosionan antes de ser sumergida en agua (eclosión precoz) se distinguen por una tapa de huevo individual y visible de la larva. Esto indica que la tira de papel de lija se mantiene demasiado húmeda. Huevos (C) que se secan demasiado severamente pueden colapsar y son claramente visibles por su apariencia cóncava. Si la lija se convierte en rígido también indica que los huevos sean demasiado secos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figura 4 muestra los efectos de la nutrición subóptima en el desarrollo de larvas de Ae. aegypti . Cuando contenedores cuentan con 0,25 mg de alimento por larva por día o menos, aumenta el tiempo de desarrollo para hombres y mujeres, y menos sincrónico que en contenedores cuenta con 0.5 mg de alimento. Si no se proporciona alimentación adecuada durante toda la duración del desarrollo larvario, esto podría tener un impacto adverso en el programa de mantenimiento. Desarrollo lento los individuos están en riesgo de ser seleccionado contra sangre de alimentación puede ser retrasada y hay un mayor riesgo de mortalidad de adultos antes de que ocurra la reproducción.

La figura 5 muestra la longitud del ala (una estimación del tamaño corporal) de los adultos de Ae. aegypti criados bajo una variedad de regímenes de nutrición. Longitudes de ala de machos y hembras disminuyen considerablemente y se vuelven más variables cuando la nutrición es subóptima. Tamaños de cuerpo uniforme son importantes para las comparaciones experimentales como tamaño corporal está positivamente asociado con la fecundidad y se espera que los mosquitos grandes exhiben mayor aptitud bajo condiciones de campo33,34,35 .

Los efectos de las infecciones de Wolbachia en los rasgos anteriores se describen en otros estudios, pero generalmente hay poco o ningún efecto23,39,49.

Figure 4
Figura 4: Proporción acumulada de Ae.aegypti (A) (B) hombres y desarrollar a la edad adulta bajo regímenes de alimentación diferentes a 26 ° C. 100 larvas fueron criadas en recipientes de 500 mL de agua (densidad larval de larvas 0,2 mL), con diferentes niveles de alimentación (ver tabla de materiales) y anotó para su tiempo de desarrollo. Se incluyeron sólo las larvas que sobreviven a la edad adulta. Barras de error son los errores estándar, n = 4 repeticiones por tratamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: La longitud del ala de Ae.aegypti (A) (B) hombres y desarrollo bajo regímenes de alimentación diferentes a 26 ° C. 100 larvas fueron criadas en recipientes de 500 mL de agua (densidad larval de larvas 0,2 mL) y con diferentes niveles de alimentación. Un subconjunto de adultos se midió entonces para la longitud del ala mediante el uso de métodos previamente descritos56. Barras de error son las desviaciones estándar. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Siguiendo el protocolo que presentamos para el mantenimiento de Wolbachia-infectados Ae. aegypti deben garantizar que los mosquitos sanos de una calidad constante se producen para los experimentos y abren notas de campo. A diferencia de otros protocolos que prioricen la producción de grandes cantidades de mosquitos (véase la referencia57), los métodos se centran en maximizar su aptitud, tanto dentro de las generaciones mediante la implementación de las condiciones de cría relajadas y a través de generaciones al minimizar la endogamia, la selección y laboratorio adaptación. Este protocolo también está diseñado específicamente para Ae. aegypti con Wolbachia infecciones pero debe ser adecuado para cualquier tipo de Ae. aegypti. Sin embargo, no es adecuado para la cría de grandes cantidades (en el orden de millones por semana), que pueden ser necesarias para comunicados de insectos estériles o incompatibles que requieren un número elevado lograr supresión de población57,58.

Hay algunos pasos importantes que deben seguirse cuidadosamente. Es importante alimentar a las larvas óptimo y evitar el hacinamiento de la duración de su desarrollo. Esto asegurará que los mosquitos se desarrollan sincrónicamente y son de un tamaño constante. Debe también tener especial cuidado cuando acondicionado los huevos; larvas muy fácilmente pueden tramar demasiado pronto o huevos pueden desecar si los sustratos de oviposición están demasiado húmedo o seco, respectivamente. En todos los pasos en el protocolo, se recomienda permitir tiempo suficiente para tantas personas en la Colonia como sea posible para completar cada etapa. Selección contra los individuos que son lentas desarrollar, madurar, alimentación de la sangre, ovipositan o Portilla conducirá probablemente a la pérdida de variación genética.

Observamos algunas otras consideraciones para el mantenimiento de Wolbachia-infectados por mosquitos que se describen en el protocolo anterior. Es posible para las infecciones de Wolbachia pérdida de colonias de laboratorio, y por lo tanto recomendamos que colonias controlarse rutinariamente para su estado de infección de Wolbachia . Utilizamos polimerasa cuantitativa (qPCR) la reacción en cadena49,59 para probar al menos 30 personas de cada Wolbachia-infectados línea cada generación. Si cualquier persona un resultado negativo para la infección por Wolbachia apropiada, las colonias pueden ser purificadas por aislar a tantas hembras como sea posible de la colonia afectada y entonces descendientes de madres infectadas, para encontrar la próxima generación. La causa de la pérdida de algunas cepas de Wolbachia de colonias de laboratorio es en gran parte desconocida, pero podría explicarse por la falta de controles de temperatura, como las altas temperaturas pueden causar la pérdida de Wolbachia infecciones47, 60.

Colonias y experimentos pueden también contaminarse con personas de diferentes líneas si no se tiene cuidado cuando cría. Contaminación puede resultar del uso descuidado de larvas, mezclando lotes de huevos, etiquetado falso jaulas o incorrectamente sexado pupas en las cruces. Especial debe por lo tanto, tener cuidado al manipular las colonias con diferentes tipos de infección por Wolbachia . Limpiar a fondo cualquier tazas de oviposición, bandejas y jaulas de cría antes de reutilizarlos, limpiar pipetas antes de manipular cada nueva bandeja de larvas y limpiar la malla cada tiempo cuando transferencia de larvas y pupas a otros envases. Además, inspeccione los dedos para huevos cuando lija tiras use toallas de papel fresca, al secarse cada tira, asegúrese de que los adultos son el sexo correcto antes de liberarlos en jaulas y solucionar rápidamente cualquier fugitivos. Tomando estas precauciones debe evitar la contaminación de la mayoría, pero las colonias deben todavía rutinariamente controlar usando análisis diagnóstico59.

Hembra de Ae. aegypti requiere una comida de sangre para poner huevos, y laboratorios de todo el mundo proporcionan en una variedad de maneras, de membrana alimentación sistemas57, animales refrenados61 y, en menor medida, sangre artificial62 . Sin embargo, los mosquitos con las infecciones experimentales de Wolbachia a menudo realizan mal en sangre no humana y pueden presentar disminución de la fecundidad y las tasas de portilla y transmisión incompleta de Wolbachia a su descendencia63, 64 , 65. mantener la receptividad de las hembras a los olores humanos también es importante para los mosquitos que se publicará en el campo y la alimentación a través de membranas u otros animales puede comprometer esta capacidad37. Nosotros, por tanto, optar por usar el antebrazo de humanos voluntarios para este protocolo de mantenimiento de la Colonia, aunque en algunas circunstancias se requieren otros métodos. Sangre debe suministrarse a través de otros medios cuando se trabaja directamente con arbovirus, y debe tener cuidado cuando las colonias proceden de poblaciones de campo con altas cargas virales como transmisión transovarial de arbovirus puede ocurrir66. Voluntarios humanos deben también no sangre alimentación si recientemente han visitado países endémicos arbovirales como puede existir un riesgo de transmisión.

Nuestro mantenimiento de protocolo tiene como objetivo minimizar la adaptación del laboratorio y presiones selectivas, pero hay margen de mejora. Leftwich et al. 42 dar otras recomendaciones para mantener la aptitud de los mosquitos para los lanzamientos de campo abierto, incluyendo el uso de dietas larvales más variadas y naturales, reduciendo la densidad de adultos en jaulas y proporcionar un entorno complejo. Estas consideraciones pueden mejorar la aptitud de Ae. aegypti a un nivel mayor, aunque actualmente no existe evidencia de cambios de aptitud debido a la adaptación de laboratorio bajo el protocolo de mantenimiento descrito aquí [Ross et al. no publicado]. Algunas medidas adicionales pueden no ser factibles para laboratorios con poco espacio y recursos, pero son sin embargo vale la pena investigar. Mantener tamaños de población, evitando grandes presiones selectivas a través de protocolos de crianza e implementación periódica de exogamia a mosquitos de campo debe ayudar a asegurar aptitud alta de Ae. aegypti para notas de campo abierto. Los principios involucrados en el enfoque pueden aplicarse a otras especies de vectores de enfermedad para liberación manipular o suprimir las poblaciones naturales de crianza.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores declaran que no tienen intereses financieros que compiten.

Acknowledgments

Reconocemos Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina y Clare Doig por sus contribuciones al desarrollo de nuestros métodos de mantenimiento de la Colonia y Johnson tres revisores anónimos por sus sugerencias que ayudaron a mejorar el manuscrito. Nuestra investigación es apoyada por un programa de subvención y beca de AAH del nacional salud y donación de Consejo de investigación médica y una traducción de la Wellcome Trust. PAR es un recipiente de un australiano gobierno investigación beca programa de formación.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187 (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. , Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).

Tags

Protocolo básico número 126 insecto que se cría dengue mosquito Aedes aegypti Zika Wolbachia fitness alimentación de sangre
Mantener los mosquitos <em>Aedes aegypti</em> infectados con <em>Wolbachia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, P. A., Axford, J. K.,… More

Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter