Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Opprettholde Aedes aegypti mygg infisert med Wolbachia

Published: August 14, 2017 doi: 10.3791/56124
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1School of BioSciences, Bio21 Institute and University of Melbourne

Summary

Aedes aegypti mygg infisert med Wolbachia blir utgitt i naturlige populasjoner undertrykker overføring av arboviruses. Vi beskriver metoder baksiden Ae. aegypti med Wolbachia infeksjoner i laboratoriet for eksperimenter og feltet utgivelse, tar forholdsregler for å minimere laboratorium tilpasning og utvalg.

Abstract

Aedes aegypti mygg eksperimentelt infisert med Wolbachia benyttes i programmer for å kontrollere spredningen av arboviruses som dengue, chikungunya og Zika. Wolbachia-infiserte mygg kan bli sluppet inn i feltet enten redusere befolkningen størrelser gjennom inkompatible parring eller transformere populasjoner med mygg som er ildfaste til virus smitte. For disse strategier for å lykkes, må myggen sluppet inn feltet fra laboratoriet være konkurransedyktig med innfødt mygg. Men, opprettholde mygg i laboratoriet kan føre i inbreeding, genetisk drift og laboratoriet tilpasning som kan redusere deres egnethet i feltet og kan forvirre resultatene av eksperimenter. For å teste hensiktsmessigheten av forskjellige Wolbachia infeksjoner for distribusjon i feltet, er det nødvendig å opprettholde mygg i et kontrollert laboratoriemiljø over flere generasjoner. Vi beskriver en enkel protokoll for å opprettholde Ae. aegypti mygg i laboratoriet, som er egnet for både Wolbachia-infiserte og vill-type mygg. Metodene minimere laboratorium tilpasning og implementere outcrossing for å øke relevansen av eksperimenter til feltet mygg. I tillegg vedlikeholdes koloniene under optimale forhold å maksimere deres egnethet for åpne-feltet utgivelser.

Introduction

Aegypti Aedes mygg er ansvarlig for overføring av noen av de viktigste arboviruses i verden, inkludert dengue, Zika og chikungunya1. Disse virusene er blitt en økende trussel mot global helse som det alminnelig utbredte distribusjonen av Ae. aegypti i tropene fortsetter å utvide2,3,4. Kvinnelige Ae. aegypti feed fortrinnsvis på menneskelig blod5 og dermed en tendens til å bo i nærheten av mennesker, særlig i urbane områder der befolkningen er mest tett. Gjennom denne nært samarbeid med mennesker har de også tilpasset for å rase i kunstig habitater, inkludert dekk, Potter, takrenner og vann tanker6,7. AE. aegypti tilpasse også lett seg laboratorium miljøer der de kan vedlikeholdes uten noen spesielle krav etter samles direkte fra feltet, i motsetning til noen andre arter i Aedes slekten8, 9,10. Deres enkelt vedlikehold har sett dem mye studert i laboratoriet i et bredt spekter av felt, til slutt satsing å kontrollere sykdommer myggen kan overføre.

Tradisjonelt avhenger arboviral kontroll svært mye på bruk av insektmidler å redusere mygg populasjoner. Det er imidlertid økende interesse tilnærminger der endret mygg er oppdratt i laboratoriet og deretter ut i naturlige populasjoner. Utgitt mygg kan endres genetisk11,12,13, biologisk14,15, gjennom bestråling16, kjemisk behandling17,18, eller med kombinert teknikker19 å undertrykke bestander av mygg eller erstatte dem med mygg som er ildfaste til arboviral overføring20.

Wolbachia er bakterier som for tiden blir brukt som en biologisk kontroll til arboviruses. Flere stammer av Wolbachia ble nylig introdusert i Ae. aegypti eksperimentelt bruker embryonale microinjection21,22,23,24. Disse stammer redusere kapasiteten til arboviruses til å spre og gjenskape i myggen, redusere deres overføring potensielle23,25,26,27,28 . Wolbachia infeksjoner overføres fra mor til avkom, men enkelte stammer indusere sterilitet når infiserte menn kompis med infisert kvinner22. Wolbachia-infiserte menn kan derfor bli utgitt i store mengder til å undertrykke naturlig mygg befolkninger, som nylig demonstrert i andre Aedes arter15,29. Men siden Wolbachia også hemme arboviral overføring i Ae. aegypti, kan mygg også befridd for å erstatte innfødte befolkningsgrupper med dårligere vektorer. Ae. aegypti infisert eksperimentelt Wolbachia gis nå ut til feltet i flere land bruker denne sistnevnte tilnærming14,30,31.

Wolbachia-baserte tilnærminger for arboviral kontroll stole på en god forståelse av samspillet mellom Wolbachia, mosquito og miljø. Wolbachia forekommer naturlig i et bredt spekter av stammene introdusert i mygg er forskjellige i deres effekter32. Som nye Wolbachia infeksjon typer innføres i Ae. aegypti24, er det nødvendig å karakterisere hver stamme for deres virkninger på mygg fitness, reproduksjon og arboviral forstyrrelser under en rekke forhold. Strenge eksperimentering i laboratoriet er derfor nødvendig å vurdere potensialet for Wolbachia stammer å lykkes i feltet.

Åpen versjoner av Ae. aegypti med Wolbachia infeksjoner kan ofte kreve tusener eller titusener av mygg per utgivelsen sone å være Steilet hver uke14,30,31. Suksessen til første utgivelser kan forbedres ved å slippe mygg med en stor størrelse å maksimere deres fruktbarhet33 og parring suksess34,35. Mygg bør også være tilpasset forholdene de vil oppleve i feltet, men langsiktig laboratorium oppdrett kan forårsake endringer i atferd og fysiologi som kan påvirke feltet ytelse36,37, 38.

Vi beskriver en enkel protokoll for oppdrett Ae. aegypti i laboratoriet ved hjelp av grunnleggende utstyr. Denne protokollen er egnet for både vill-type og Wolbachia-infisert mygg, som kan kreve spesiell oppmerksomhet som noen Wolbachia stammer har stor innvirkning på mygg livshistorie trekk39, 40. oppdrett betingelsene unngå overbefolkning og konkurranse for mat til å produsere mygg til en enhetlig størrelse, som er avgjørende for vektor kompetanse og fitness eksperimenter, og sikrer at myggen er sunt for feltet utgivelsen41 . Vi også ta forholdsregler for å minimere laboratorium tilpasning og inbreeding ved å redusere selektive presset og sikrer at neste generasjon samples fra et stort, tilfeldig utvalg. Men laboratorium miljøer er utpreget annerledes fra feltforhold, og langsiktig vedlikehold under avslappet forhold kan redusere egnethet av mygg ved løslatelse i feltet37,42,43 . Vi krysser derfor kvinner fra laboratoriet linjer til feltet samlet menn regelmessig resulterer i kolonier som er genetisk like for eksperimentell sammenligninger og som er tilpasset mål feltet befolkningen39. Metodene krever ikke noen spesialisert utstyr, og kan skaleres baksiden titalls tusenvis av personer per uke for feltet utgivelser. Protokollen prioriterer også egnethet av mygg innen og over generasjoner, en viktig faktor for insekter til etablering i naturlige populasjoner. Protokollen er egnet for de fleste laboratorier som krever vedlikehold av Ae. aegypti, spesielt for eksperimentell sammenligninger der en gjennomført kvalitet av mygg og relatability til feltet er viktig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Blod fôring av mygg på mennesker ble godkjent av University of Melbourne menneskelige etikk (godkjenning #: 0723847). Alle frivillige gitt informert skriftlig samtykke.

1. larver oppdrett

Merk: Mygg holdes på 26 ± 0,5 ° C og 50-70% relativ fuktighet, med en 12:12 h (lys: mørk) fotoperiode for denne kolonien vedlikeholdsprotokollen. Disse betingelsene er lik de gjennomsnittlige klimatiske forholdene i Cairns, Australia og med optimal varmeavgivelse for Ae. aegypti overlevelse og utvikling44,45,46. Høye temperaturer bør kan føre til tap av Wolbachia infeksjoner fra mygg koloniene og unngås47. Vi opprettholde minst 500 personer per befolkningen å minimere inbreeding; opprettholde kolonier av mindre størrelse kan ha fitness konsekvenser [Ross et al. upubliserte]. Under disse forholdene og antar tilstrekkelig ernæring er gjennomsnittlig generasjon tiden 28 dager (se tabell 1).

  1. Senk egg på underlaget i skuffer (figur 1A) som inneholder 3 L vann (omvendt osmose vann eller alderen vann, generert ved å forlate vann i skuffene for 24 timer før bruk), ~ 300 mg av fisken næringen (en knust tablett, se Tabellen for materiale) og par korn av aktive tørr gjær å indusere klekking48.
  2. En dag etter klekking bruk en glass pipette overføre ca 500 Larvene til skuffer som inneholder 4 L vann (figur 1B), telle bruker en klikkeren teller. Legge til to knust fisk mat tabletter i hver skuff. Hvis nødvendig, bruk beholdere av ulike størrelser for oppdrett Larvene (figur 1A), men larver tettheter under 0,5 Larvene/mL å unngå overbefolkning.
  3. Når skuffene daglig for å sikre at larvene har tilstrekkelig mat. legge til ca to mat tabletter i magasinene annenhver dag. Gi mat annonse libitum men sikre at 0,5 mg/Larven/dag er tilgjengelig i denne perioden å sikre utvikling er synkron og kroppsstørrelse er konsekvente, ellers resultatene av eksperimenter kan bli forvirret (se representant resultater).
  4. Ta vare for å unngå overfeeding av larver, spesielt mindre oppdrett beholdere med vann mindre areal og volum. Hvis vannet ser skyet eller hvis det er betydelig larver dødelighet, erstatte den med ferskvann; dødelighet bør være ubetydelig hvis larver fôres optimalt.

2. voksen fremveksten

Merk: Larvene begynner å forpuppe seg fra fem dager etter klekking hvis godt matet og fleste skal forpuppe seg av syv dager etter klekking. Voksne vil starte nye omtrent to dager etter pupation hvis opprettholdt optimalt på 26 ° C (se Representant resultater). Larver utvikling påvirkes vanligvis av Wolbachia infeksjoner når nok mat tilbys23,39,49.

  1. Syv dager etter klekking helle skuffen hele innholdet gjennom en finmasket (pore størrelse 0.4 mm). Holde filtrerte larver vannet for senere bruk i ovicups (se "Blod fôring og Oviposition"-delen). Invertere mesh og dyppe den i en plastboks med 200 mL vann overføre pupae. Gir ekstra mat hvis noen larver forblir.
  2. Forberede voksen fremveksten merdene (figur 1 c) ved å gi to kopper 10% sucrose løsning (figur 1F) og to kopper fuktig vatt å hindre uttørking (figur 1E).
  3. Hvis pupae ikke trenger å sorteres etter sex, plassere lidded beholdere av pupae i buret og la lokket litt gløtt slik at de voksne å dukke opp i buret. Alternativt sted en omvendt trakt over beholderen å minimere drukning. Kontroller alle voksne har kommet før du fjerner beholderen fra byrået å forhindre valg mot langsom utviklere.

3. pupal Sexing for Outcrossing

  1. Hvis pupae må sorteres etter kjønn (f.eksfor outcrossing), Pipetter pupae fra larver skuffer og skille kjønnene (figur 2) i plastbeholdere (figur 1A) med 200 mL vann hjelp hvis du hver 24 timer før ønsket antall hver sex er nådd. Legg lokk på beholdere og la dem stengt.
  2. Voksne vil dukke opp i beholderne; bekrefte sitt kjønn før slippe bur (figur 2C). Fjern alle voksne sexed feil med en aspirator innen 24 timer av fremveksten før de når seksuell modenhet. Når kjønnene er bekreftet, slipp voksne bur hver 24 h.
  3. Hente Wolbachia-infiserte kolonier av lignende genetisk bakgrunn til en naturlig befolkningen, høylytt protest ved å legge Wolbachia-infiserte kvinner fra laboratoriet koloniene til burene infisert menn avledet fra egg samlet av ovitraps i i feltet39, opprettholde foreskrevet tettheten av 500 personer per befolkningen.
    1. Gjenta outcrossing for minst tre påfølgende generasjoner for å produsere kolonier som er minst 87,5% genetisk likhet med feltet befolkningen39. Kritisk: Sikre at kjønnene er riktig på dette stadiet (se trinn 3.1).
  4. Kvinnelige Ae. aegypti er vanligvis ildfaste til ytterligere inseminasjon innen timer parring50. Når outcrossing kolonier, la de kvinner og menn moden inne separat burene for to dager og deretter Sug opp kvinner inn i mannlige bur å gi en lik mulighet til alle menn.

4. blod fôring og Oviposition

  1. Vent minst tre dager etter den siste kvinnelige har kommet før blod fôring for å gi god tid til å modnes. Blod mate kvinner innen to uker etter fremveksten å forhindre overdreven dødelighet, spesielt for mygg med Wolbachia infeksjoner som negativt påvirker longevity22,24,49. Fjerne sukker koppene dagen før fôring for å forbedre fôring priser.
    1. Spør frivillig sette inn deres underarmen i buret for å tillate kvinnelige myggen å mate. De fleste kvinner bør feed til repletion innen 5 min, men for å redusere utvalget mot langsom feeders, la underarmen i buret i 15 minutter, eller til alle kvinner er synlig engorged; en latex hanske beskytte hånden fra biter er valgfritt, men anbefales.
    2. To dager etter blod fôring, plassere plast kopper som inneholder larver oppdrett vann og foret med en stripe av sandpapir (figur 1G) (eller filter papir (figur 1 H)) i buret for kvinner å legge egg. Delvis dykke sandpapir stripe i vannet for å holde det fuktig. Fjern andre kilder vann for å hindre at Hunnene legger egg utenfor oviposition cup.
      Merk: vann kan brukes i koppene, men larver-oppdrett vann oppmuntrer oviposition51,52 og kvinner vil legge sine egg mer synkront.

5. høsting og condition

  1. Hunnene legger egg på sandpapir like over vannlinjen; samle og erstatte strimler av sandpapir daglig til ingen flere egg legges. Merk at oviposition kan fortsette i opptil en uke.
  2. Delvis tørr sandpapir strimler av forsiktig blotting dem på et papirhåndkle for 30 s, ta vare ikke for å dislodge eggene. Deretter Pakk strimler i et ark tørr håndkle og legg den i en forsegles plastpose (figur 1I).
  3. Kontrollere tilstanden til egg under dissecting mikroskop (Figur 3). Hvis sandpapir strimler er for vått, kan klekker eggene før er neddykket i vann (figur 3B), men hvis tørket for hardt, egg kan kollapse (Figur 3 c).
  4. Egg kan være klekket samtidig utover tre dager etter samlingen. Luke alle egg fra hver kolonien, samlet i alle dager, i samme container vann for å sikre at neste generasjon samples fra en stor, tilfeldig gruppe av individer.
  5. For langtidslagring, holde egg i lukket beholder ved en høy (> 80%) fuktighet på rundt 20 ° C. Under disse forholdene, kan egg uten Wolbachia lagres i flere måneder samtidig opprettholde høy Luke priser53,54.
  6. Som noen Wolbachia infeksjoner reduserer levedyktigheten til egg med alder49,55, klekkes eggene fra Wolbachia-infisert linjer innen en uke av samling å forhindre overdreven dødelighet for relevante stammer. Blod feed kvinner igjen etter en uke hvis flere egg er nødvendig.
Dag Trinn
0 Luke egg
1 Antall larver i skuffer
7 Overføre larver og pupae til koloni burene
17 Blod feed kvinnelige voksne
21 Begynne å samle egg
25 Fullfør samle egg
28 Luke egg

Tabell 1: Oversikt over Ae. aegypti koloni vedlikeholdsplan på 26 ° C. Tidspunktet for den kvinnelige blodet-fôring og klekking egg er fleksibel, men lang varighet på disse stadiene bør unngås, spesielt for mygg infisert med Wolbachia, for å redusere dødelighet. Etter denne tidsplanen minimerer utvalg mot mosquitoes som er fort eller sakte å utvikle eller eldre på alle livsstadier, forutsatt at larvene fôres optimalt.

Figure 1
Figur 1: Utstyr for oppdrett Ae. aegypti i laboratoriet. (A) plastbeholdere brukes for klekking egg eller oppdrett Larvene med volumer på 500, 750 og 5000 mL (fra venstre til høyre). (B) skuffer brukes for oppdrett larver på en kontrollert tetthet, vanligvis 500 larver i 4 L vann. (C) 19.7 L og (D) 3 L bur som brukes for bolig voksne. En tetthet av 25 voksne eller mindre per liter bør opprettholdes tilstrekkelig plass. (E) 35 mL cup med fuktig vatt leveres som en kilde til vann for voksne. (F) 35 mL cup med sucrose løsning gitt gjennom en snor eller dental veken som sukker. (G-H) Kopper fylt med larver oppdrett vann og foret med en oviposition substrat av sandpapir eller filter papir (G og H, henholdsvis). (jeg) Zip-lock veske brukes for lagring av sandpapir strimler eller filter papir. Svarte flekker på sandpapir er mygg egg. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Lateral (A) og dorsal (B) utsikt over pupae og voksen Ae. aegypti (C) demonstrere deres seksuell dimorphism. Menn er plassert på venstre og kvinner til høyre i hvert panel. Når optimalt matet, er mannlige og kvinnelige pupae preget av størrelse; kvinner er større enn menn (A) og har en relativt oppsvulmede cephalothorax forhold til menn som har flatere sider (B). Mannlige voksne er enkelt å skille fra kvinner under alle oppdrett forhold, hovedsakelig av deres plumose antenner og lang palps. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3. Fire dagers gammel Ae. aegypti egg under ulike forhold. (A) Intact egg på sandpapir strimler vedlikeholdes på en høy (> 80%) luftfuktighet, men uten noen synlige fuktighet. Luke priser skal være over 90% for vill-type Ae. aegypti hvis vedlikeholdt på riktig måte. (B) egg som klekker før er neddykket i vann (bråmoden klekking) kjennetegnes av en frittstående egg cap og synlig larve. Dette indikerer at sandpapir stripen ble holdt for fuktig. (C) egg som er tørket for hardt kan kollapse, og er synlig konkave utseende. Hvis sandpapir blir stiv angir dette også at egg kan bli for tørr. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 4 demonstrerer effektene av suboptimal ernæring på utvikling av Ae. aegypti larver. Når beholdere leveres med 0,25 mg av mat per Larven per dag eller mindre, øker utbyggingen tid for både menn og kvinner, og mindre synkron enn i beholdere leveres med 0,5 mg av mat. Hvis tilstrekkelig mat ikke er angitt under hele larver utvikling, kan dette ha en negativ innvirkning på vedlikeholdsplan. Langsom utvikling individer er i fare for å bli valgt mot blod fôring kan være forsinket og det er en høyere risiko for voksen dødelighet før gjengivelse.

Figur 5 viser fløyen lengden (estimert kroppsstørrelse) Ae. aegypti voksne oppdratt under en rekke ernæring regimer. Vingen lengder både hanner og hunner redusere betydelig og bli mer variabel når ernæring er suboptimal. Uniform kroppen størrelser er viktig for eksperimentell sammenligninger som kroppsstørrelse er positivt assosiert med fruktbarhet, og store mygg er forventet større fitness under feltet forhold33,34,35 .

Effekten av Wolbachia infeksjoner på ovennevnte egenskaper er beskrevet i andre studier, men generelt er det liten eller ingen effekt23,39,49.

Figure 4
Figur 4: Kumulativ andelen Ae.aegypti (A) kvinner og (B) menn utvikle til voksen under forskjellige mat regimer på 26 ° C. 100 Larvene var oppdratt i beholdere 500 mL vann (en larver tetthet av 0,2 Larvene per mL), utstyrt med ulike nivåer av mat (se tabell for materiale) og scoret for deres utviklingstid. Bare larver som overlevde til voksen ble inkludert. Feilfelt er standardfeil, med n = 4 gjentak per behandling. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Wing Ae.aegypti (A) kvinner og (B) menn utvikle under forskjellige mat regimer på 26 ° C. 100 larver ble oppdratt i beholdere av 500 mL vann (en larver tetthet av 0,2 Larvene per mL) og leveres med ulike nivåer av mat. Et delsett av voksne ble deretter målt for sin vinge lengde ved hjelp av tidligere beskrevet metoder56. Feilfelt er standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Følger protokollen presenteres her for vedlikehold av Wolbachia-infiserte Ae. aegypti sikrer at sunn mygg av en gjennomført kvalitet er produsert for eksperimenter og åpne feltet utgivelser. I motsetning til andre protokoller som prioritere produksjon av masse mengder mygg (se referanse57), er metodene fokusert på å maksimere deres egnethet, både innen generasjoner ved å implementere avslappet oppdrett forhold, og over generasjoner ved å minimere inbreeding, utvalg og laboratoriet tilpasning. Denne protokollen er laget spesielt for Ae. aegypti med Wolbachia infeksjoner, men bør være egnet for alle typer Ae. aegypti. Men er det ikke egnet for oppdrett masse mengder (i millioner per uke), som kan være nødvendig for sterilt eller inkompatibel insekt utgivelser som krever høye tall å oppnå befolkningen undertrykkelse57,58.

Det er noen avgjørende skritt som bør følges nøye. Det er viktig å mate Larvene optimalt og unngå overbefolkning for varigheten av deres utvikling. Dette vil sikre at myggen utvikle synkront og har konsekvent størrelse. Forsiktighet bør også tas når condition egg; Larvene kan veldig lett klekkes for tidlig eller egg kan utenå tørrlegge overflaten hvis oviposition substrater for våt eller tørr, henholdsvis. På alle trinn i protokollen anbefaler vi tillater nok tid for så mange personer i kolonien som mulig for å fullføre hver scene. Markeringen mot personer som er trege til å utvikle, modne, blod feed, oviposit eller klekkes vil trolig føre til tap av genetisk variasjon.

Vi merke noen ytterligere betraktninger for vedlikehold av Wolbachia-infisert myggen som ikke er beskrevet i over protokollen. Det er mulig for Wolbachia infeksjoner tapt fra laboratoriet koloniene, og vi anbefaler derfor at koloniene overvåkes rutinemessig for sin Wolbachia infeksjonsstatus. Vi bruker kvantitative polymerase kjedereaksjon (qPCR)49,59 teste minst 30 personer fra hver Wolbachia-infisert linje hver generasjon. Hvis enkeltpersoner tester negativt for aktuelle Wolbachia infeksjon, kan kolonier bli renset ved isolere så mange kvinner som mulig fra den berørte kolonien og deretter bruke avkom fra infiserte mødre bare funnet neste generasjon. Årsaken til tapet av noen Wolbachia stammer fra laboratoriet koloniene er stort sett ukjent, men kan forklares med svikt i temperaturkontroll, som høye temperaturer kan føre til tap av Wolbachia infeksjoner47, 60.

Kolonier og eksperimenter, kan også bli forurenset med enkeltpersoner fra annerledes linjer hvis omsorg ikke tas når oppdrett. Forurensning kan skyldes uforsiktig pipettering av larvene, blander opp grupper av egg, mislabeling burene eller feil sexing pupae i krysser. Forsiktighet bør derfor tas ved håndtering kolonier med ulike Wolbachia infeksjon. Rense eventuelle oviposition kopper, oppdrett skuffer og bur før gjenbruk dem, rense Pipetter før du tar hver nye brett av larver og rengjør mesh hver gang når du overfører larver og pupae til andre beholdere. Videre inspisere fingrene for egg når håndtere sandpapir strimler og bruker ferske papirhåndklær når tørking hver stripe, sikre at voksne er riktig sex før slippe dem i bur og håndtere eventuelle escapees raskt. Tar disse forholdsregler bør unngå de fleste forurensning, men kolonier bør fortsatt rutinemessig overvåkes ved hjelp av diagnostiske analyser59.

Kvinnelige Ae. aegypti krever en blod måltid for å legge egg, og over hele verden gir dem i en rekke måter, fra membranen fôring systemer57, behersket dyr61 og, i mindre grad, kunstig blod62 . Men myggen med eksperimentell Wolbachia infeksjoner ofte fungere dårlig på ikke-menneskelig blod, og kan utvise redusert fruktbarhet og Luke priser og ufullstendig overføring av Wolbachia til deres avkom63, 64 , 65. vedlikehold for mottakelighet av kvinner til menneskelig lukt er også viktig for myggen frigis til feltet og mate dem gjennom membraner eller andre dyr kan kompromittere denne evnen37. Vi har derfor velger for å bruke underarmen av frivillige for denne kolonien vedlikeholdsprotokollen, men andre metoder kreves under noen omstendigheter. Blod skal angis på annen måte når du arbeider direkte med arboviruses, og bekymre burde være tatt når kolonier stammer fra feltet populasjoner høy viral belastning som transovarial overføring av arboviruses oppstå66. Frivillige bør heller ikke blod feed hvis de har nylig besøkt arboviral endemiske land som det kan være en risiko for overføring.

Våre vedlikehold protokollen mål å minimere laboratorium tilpasning og selektive presset, men det er rom for forbedring. Leftwich et al. 42 gir flere anbefalinger for opprettholde egnethet av mygg for åpne-feltet utgivelser, inkludert bruk av mer variert og naturlig larver dietter, reduserer tettheten av voksne i bur og gir en kompleks virksomhet. Disse hensynene kan forbedre helsa av Ae. aegypti til et høyere nivå, men for øyeblikket er det ingen bevis fitness endringer på grunn av laboratoriet tilpasning under vedlikeholdsprotokollen beskrevet her [Ross et al. upubliserte]. Noen ekstra tiltak kanskje ikke er gjennomførbart for laboratorier med begrenset plass og ressurser, men er likevel verdt å undersøke. Opprettholde store befolkningen størrelser, unngår store selektive presset gjennom oppdrett protokoller og implementere bør periodiske outcrossing til feltet mygg bidra til å sikre høy fitness av Ae. aegypti for åpne-feltet utgivelser. Prinsippene involvert i tilnærming kan brukes på oppdrett andre sykdom vector art for løslate å manipulere eller skjule naturlige populasjoner.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi erkjenner Heng Lin Yeap, Chris Paton, Petrina Johnson og Clare Doig for sine bidrag til utviklingen av våre kolonien vedlikehold metoder og tre anonyme vurderinger for deres forslag som bidro til å forbedre manuskriptet. Vår forskning støttes av programmet stipend og fellesskap å AAH fra National Health og Medical Research Council og en oversettelse grant fra Wellcome Trust. PAR er en mottaker av en australsk regjeringen forskning Training Program stipend.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Wild type Aedes aegypti Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others39 for details
w Mel-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Walker and others23 for information on the strain
w AlbB-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to Xi and others21 for information on the strain
w MelPop-infected Aedes aegypti Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others22 for information on the strain
Instant dried yeast Lowan Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used
5 L plastic tub Quadrant Q110950 Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used
Fish Food (Tetramin Tropical Tablets) Tetra 16152 Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE
Plastic containers Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable
Glass pipette Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez
Clicker counter RS Pro 710-5212 Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y
Rearing trays Gratnells Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com
Nylon mesh Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white
Cages BugDorm DP1000 Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html
35 mL plastic cup Huhtamaki AA272225 Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
35 mL plastic cup lid Huhtamaki GB030005 Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used
Cotton wool Cutisoft 71841-13 Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used
White Sugar Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores
Rope M Recht Accessories C323C/W Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/
Plastic cup (large) Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable
Sandpaper Norton Master Painters CE015962 Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html
Filter paper Whatman 1001-150 Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used
Latex gloves SemperGuard Z560979 Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Mayer, S. V., Tesh, R. B., Vasilakis, N. The emergence of arthropod-borne viral diseases: A global prospective on dengue, chikungunya and zika fevers. Acta Trop. 166, 155-163 (2017).
  2. Campbell, L. P., et al. Climate change influences on global distributions of dengue and chikungunya virus vectors. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 370 (1665), (2015).
  3. Kraemer, M. U., et al. The global distribution of the arbovirus vectors Aedes aegypti and Ae. albopictus. eLife. 4, (2015).
  4. Carvalho, B. M., Rangel, E. F., Vale, M. M. Evaluation of the impacts of climate change on disease vectors through ecological niche modelling. Bull Entomol Res. , 1-12 (2016).
  5. Scott, T. W., et al. Longitudinal studies of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Thailand and Puerto Rico: population dynamics. J Med Ent. 37 (1), 77-88 (2000).
  6. Cheong, W. Preferred Aedes aegypti larval habitats in urban areas. Bull World Health Organ. 36 (4), 586-589 (1967).
  7. Barker-Hudson, P., Jones, R., Kay, B. H. Categorization of domestic breeding habitats of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) in Northern Queensland, Australia. J Med Ent. 25 (3), 178-182 (1988).
  8. Watson, T. M., Marshall, K., Kay, B. H. Colonization and laboratory biology of Aedes notoscriptus from Brisbane, Australia. J Am Mosq Control Assoc. 16 (2), 138-142 (2000).
  9. Williges, E., et al. Laboratory colonization of Aedes japonicus japonicus. J Am Mosq Control Assoc. 24 (4), 591-593 (2008).
  10. Munstermann, L. E. The Molecular Biology of Insect Disease Vectors. , Springer. 13-20 (1997).
  11. McDonald, P., Hausermann, W., Lorimer, N. Sterility introduced by release of genetically altered males to a domestic population of Aedes aegypti at the Kenya coast. Am J Trop Med Hyg. 26 (3), 553-561 (1977).
  12. Rai, K., Grover, K., Suguna, S. Genetic manipulation of Aedes aegypti: incorporation and maintenance of a genetic marker and a chromosomal translocation in natural populations. Bull World Health Organ. 48 (1), 49-56 (1973).
  13. Harris, A. F., et al. Field performance of engineered male mosquitoes. Nature Biotechnol. 29 (11), 1034-1037 (2011).
  14. Hoffmann, A. A., et al. Successful establishment of Wolbachia in Aedes populations to suppress dengue transmission. Nature. 476 (7361), 454-457 (2011).
  15. O'Connor, L., et al. Open release of male mosquitoes infected with a Wolbachia biopesticide: field performance and infection containment. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1797 (2012).
  16. Morlan, H. B. Field tests with sexually sterile males for control of Aedes aegypti. Mosquito news. 22 (3), 295-300 (1962).
  17. Grover, K. K., et al. Field experiments on the competitiveness of males carrying genetic control systems for Aedes aegypti. Entomol Exp Appl. 20 (1), 8-18 (1976).
  18. Seawright, J., Kaiser, P., Dame, D. Mating competitiveness of chemosterilized hybrid males of Aedes aegypti (L.) in field tests. Mosq News. 37 (4), 615-619 (1977).
  19. Zhang, D., Lees, R. S., Xi, Z., Gilles, J. R., Bourtzis, K. Combining the sterile insect technique with Wolbachia-based approaches: II- a safer approach to Aedes albopictus population suppression programmes, designed to minimize the consequences of inadvertent female release. PloS One. 10 (8), e0135194 (2015).
  20. McGraw, E. A., O'Neill, S. L. Beyond insecticides: new thinking on an ancient problem. Nature Rev Microbiol. 11 (3), 181-193 (2013).
  21. Xi, Z., Khoo, C. C., Dobson, S. L. Wolbachia establishment and invasion in an Aedes aegypti laboratory population. Science. 310 (5746), 326-328 (2005).
  22. McMeniman, C. J., et al. Stable introduction of a life-shortening Wolbachia infection into the mosquito Aedes aegypti. Science. 323 (5910), 141-144 (2009).
  23. Walker, T., et al. The wMel Wolbachia strain blocks dengue and invades caged Aedes aegypti populations. Nature. 476 (7361), 450-453 (2011).
  24. Joubert, D. A., et al. Establishment of a Wolbachia superinfection in Aedes aegypti mosquitoes as a ppotential approach for future resistance management. PLoS Pathog. 12 (2), e1005434 (2016).
  25. Ferguson, N. M., et al. Modeling the impact on virus transmission of Wolbachia-mediated blocking of dengue virus infection of Aedes aegypti. Sci Transl Med. 7 (279), 279ra237 (2015).
  26. Aliota, M. T., Peinado, S. A., Velez, I. D., Osorio, J. E. The wMel strain of Wolbachia Reduces Transmission of Zika virus by Aedes aegypti. Sci Rep. 6, 28792 (2016).
  27. van den Hurk, A. F., et al. Impact of Wolbachia on infection with chikungunya and yellow fever viruses in the mosquito vector Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 6 (11), e1892 (2012).
  28. Moreira, L. A., et al. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti limits infection with dengue, Chikungunya, and Plasmodium. Cell. 139 (7), 1268-1278 (2009).
  29. Mains, J. W., Brelsfoard, C. L., Rose, R. I., Dobson, S. L. Female Adult Aedes albopictus Suppression by Wolbachia-Infected Male Mosquitoes. Sci Rep. 6, 33846 (2016).
  30. Nguyen, T. H., et al. Field evaluation of the establishment potential of wmelpop Wolbachia in Australia and Vietnam for dengue control. Parasit Vectors. 8, 563 (2015).
  31. Garcia Gde, A., Dos Santos, L. M., Villela, D. A., Maciel-de-Freitas, R. Using Wolbachia releases to estimate Aedes aegypti (Diptera: Culicidae) population size and survival. PloS One. 11 (8), e0160196 (2016).
  32. Hoffmann, A. A., Ross, P. A., Rašić, G. Wolbachia strains for disease control: ecological and evolutionary considerations. Evol Appl. 8 (8), 751-768 (2015).
  33. Briegel, H. Metabolic relationship between female body size, reserves, and fecundity of Aedes aegypti. J Insect Physiol. 36 (3), 165-172 (1990).
  34. Ponlawat, A., Harrington, L. C. Factors associated with male mating success of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 80 (3), 395-400 (2009).
  35. Segoli, M., Hoffmann, A. A., Lloyd, J., Omodei, G. J., Ritchie, S. A. The effect of virus-blocking Wolbachia on male competitiveness of the dengue vector mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3294 (2014).
  36. Imam, H., Zarnigar,, Sofi, G., Seikh, A. The basic rules and methods of mosquito rearing (Aedes aegypti). Trop Parasitol. 4 (1), 53-55 (2014).
  37. Spitzen, J., Takken, W. Malaria mosquito rearing-maintaining quality and quantity of laboratory-reared insects. Proc Neth Entomol Soc Meet. 16, 95-100 (2005).
  38. Lorenz, L., Beaty, B. J., Aitken, T. H. G., Wallis, G. P., Tabachnick, W. J. The effect of colonization upon Aedes aegypti susceptibility to oral infection with Yellow Fever virus. Am J Trop Med Hyg. 33 (4), 690-694 (1984).
  39. Yeap, H. L., et al. Dynamics of the "popcorn" Wolbachia infection in outbred Aedes aegypti informs prospects for mosquito vector control. Genetics. 187 (2), 583-595 (2011).
  40. Turley, A. P., Moreira, L. A., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Wolbachia infection reduces blood-feeding success in the dengue fever mosquito, Aedes aegypti. PLoS Negl Trop Dis. 3 (9), e516 (2009).
  41. Yeap, H. L., Endersby, N. M., Johnson, P. H., Ritchie, S. A., Hoffmann, A. A. Body size and wing shape measurements as quality indicators of Aedes aegypti mosquitoes destined for field release. Am J Trop Med Hyg. 89 (1), 78-92 (2013).
  42. Leftwich, P. T., Bolton, M., Chapman, T. Evolutionary biology and genetic techniques for insect control. Evol Appl. 9 (16), 212-230 (2016).
  43. Calkins, C., Parker, A. Sterile Insect Technique. , Springer. 269-296 (2005).
  44. Tun-Lin, W., Burkot, T., Kay, B. Effects of temperature and larval diet on development rates and survival of the dengue vector Aedes aegypti in north Queensland, Australia. Med Vet Entomol. 14 (1), 31-37 (2000).
  45. Richardson, K., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S., Kearney, M. R. Thermal sensitivity of Aedes aegypti from Australia: empirical data and prediction of effects on distribution. J Med Ent. 48 (4), 914-923 (2011).
  46. Richardson, K. M., Hoffmann, A. A., Johnson, P., Ritchie, S. R., Kearney, M. R. A replicated comparison of breeding-container suitability for the dengue vector Aedes aegypti in tropical and temperate Australia. Austral Ecol. 38 (2), 219-229 (2013).
  47. Ross, P. A., et al. Wolbachia infections in Aedes aegypti differ markedly in their response to cyclical heat stress. PLoS Pathog. 13 (1), e1006006 (2017).
  48. Gjullin, C., Hegarty, C., Bollen, W. The necessity of a low oxygen concentration for the hatching of Aedes mosquito eggs. J Cell Physiol. 17 (2), 193-202 (1941).
  49. Axford, J. K., Ross, P. A., Yeap, H. L., Callahan, A. G., Hoffmann, A. A. Fitness of wAlbB Wolbachia infection in Aedes aegypti: parameter estimates in an outcrossed background and potential for population invasion. Am J Trop Med Hyg. 94 (3), 507-516 (2016).
  50. Degner, E. C., Harrington, L. C. Polyandry depends on postmating time interval in the dengue vector Aedes aegypti. Am J Trop Med Hyg. 94 (4), 780-785 (2016).
  51. Bentley, M. D., Day, J. F. Chemical ecology and behavioral aspects of mosquito oviposition. Ann Rev Entomol. 34 (1), 401-421 (1989).
  52. Wong, J., Stoddard, S. T., Astete, H., Morrison, A. C., Scott, T. W. Oviposition site selection by the dengue vector Aedes aegypti and its implications for dengue control. PLoS Negl Trop Dis. 5 (4), e1015 (2011).
  53. Meola, R. The influence of temperature and humidity on embryonic longevity in Aedes aegypti. Ann Entomol Soc Am. 57 (4), 468-472 (1964).
  54. Faull, K. J., Williams, C. R. Intraspecific variation in desiccation survival time of Aedes aegypti (L.) mosquito eggs of Australian origin. J Vector Ecol. 40 (2), 292-300 (2015).
  55. McMeniman, C. J., O'Neill, S. L. A virulent Wolbachia infection decreases the viability of the dengue vector Aedes aegypti during periods of embryonic quiescence. PLoS Negl Trop Dis. 4 (7), e748 (2010).
  56. Ross, P. A., Endersby, N. M., Hoffmann, A. A. Costs of three Wolbachia infections on the survival of Aedes aegypti larvae under starvation conditions. PLoS Negl Trop Dis. 10 (1), e0004320 (2016).
  57. Carvalho, D. O., et al. Mass production of genetically modified Aedes aegypti for field releases in Brazil. J Vis Exp. (83), e3579 (2014).
  58. Benedict, M. The first releases of transgenic mosquitoes: an argument for the sterile insect technique. Trends Parasitol. 19 (8), 349-355 (2003).
  59. Lee, S. F., White, V. L., Weeks, A. R., Hoffmann, A. A., Endersby, N. M. High-throughput PCR assays to monitor Wolbachia infection in the dengue mosquito (Aedes aegypti) and Drosophila simulans. Appl Environ Microbiol. 78 (13), 4740-4743 (2012).
  60. Corbin, C., Heyworth, E. R., Ferrari, J., Hurst, G. D. Heritable symbionts in a world of varying temperature. Heredity. 118 (1), 10-20 (2017).
  61. Day, J. F., Edman, J. D. Mosquito engorgement on normally defensive hosts depends on host activity patterns. J Med Ent. 21 (6), 732-740 (1984).
  62. Gonzales, K. K., Hansen, I. A. Artificial diets for mosquitoes. Int J Environ Res Public Health. 13 (12), (2016).
  63. McMeniman, C. J., Hughes, G. L., O'Neill, S. L. A Wolbachia symbiont in Aedes aegypti disrupts mosquito egg development to a greater extent when mosquitoes feed on nonhuman versus human blood. J Med Ent. 48 (1), 76-84 (2011).
  64. Caragata, E. P., Rances, E., O'Neill, S. L., McGraw, E. A. Competition for amino acids between Wolbachia and the mosquito host, Aedes aegypti. Microb Ecol. 67 (1), 205-218 (2014).
  65. Suh, E., Fu, Y., Mercer, D. R., Dobson, S. L. Interaction of Wolbachia and bloodmeal type in artificially infected Aedes albopictus (Diptera: Culicidae). J Med Entomol. , (2016).
  66. Thangamani, S., Huang, J., Hart, C. E., Guzman, H., Tesh, R. B. Vertical transmission of Zika virus in Aedes aegypti mosquitoes. Am J Trop Med Hyg. 95 (5), 1169-1173 (2016).

Tags

Grunnleggende protokollen problemet 126 insekt oppdrett mygg Aedes aegypti dengue Zika Wolbachia fitness blod fôring
Opprettholde <em>Aedes aegypti</em> mygg infisert med <em>Wolbachia</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ross, P. A., Axford, J. K.,… More

Ross, P. A., Axford, J. K., Richardson, K. M., Endersby-Harshman, N. M., Hoffmann, A. A. Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia. J. Vis. Exp. (126), e56124, doi:10.3791/56124 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter