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Medicine

쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가

doi: 10.3791/56133 Published: December 5, 2017

Summary

이 원고는 쥐 대뇌 저항 동맥 혈관 기능을 평가 하기 위한 비디오 현미경 검사 법 프로토콜을 체 외에 설명 합니다. 원고는 또한 레이저 도플러 Flowmetry를 사용 하 여 붙일 레이블된 lectin과 조직 관류와 microvessel 밀도 평가 하기 위한 기법을 설명 합니다.

Abstract

이 프로토콜 텔레비전 현미경 고립된 대뇌 저항 동맥 (와 다른 배), 혈관 기능을 평가 하기 위해 생체 외에서 의 사용을 설명 하 고 레이저 도플러 Flowmetry (LDF를 사용 하 여 조직 관류를 평가 하기 위한 기술에 설명 합니다. )와 microvessel 밀도 붙일 활용 Griffonia simplicifolia (GS1) lectin를 표시. 현재 공부에 대 한 과거 발생 압력에서 vivo에서 에서 저항 동맥을 분리 방법과 parenchymal 세포 영향의 부재에서 vivo에서 연구와 분자에서 얻은 정보 사이의 중요 한 링크를 제공 전체 동물 수준에서 통합 응답에 제한 된 통찰력을 제공 하는 reductionist 접근. 선택적으로 붙일 레이블 GS1 lectin arterioles, 모세 혈관을 식별 하는 LDF 및 기술 절연된 저항 동맥의 연구에서 얻은 지식을 확장할 수 사관 수 있도록 실용적인 솔루션을 제공 합니다. 이 종이 혈관 생리학과 병리학 일반 실험 모델 쥐에서의 기본적인 지식을 얻기 위해 이러한 기술의 응용 프로그램을 설명 하 고 전문의 다양 한 제공할 수 있는 "디자이너" 쥐 종자를 유전자 조작 중요 한 혈관 고기에 특정 한 유전자의 영향으로 중요 한 통찰력. 녹아웃 마우스 모델에서 개발 된 과학 건물의 엄 함 확장 됩니다 선택적 번 식 전략과 쥐에 유전자 녹아웃 모델 생산을 위한 새로운 기술을 개발한 쥐 긴장에서이 귀중 한 실험적인 접근을 이용 하 고 그 지식을 잘 이해 생리 적 배경 및 그것의 큰 크기 때문에 생리 적 연구에 대 한 적합성과 더 관련 동물 모델을 확장 합니다.

Introduction

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혈관 기능 활용 하는 동맥 도관 동맥, 및 많은의 초기 연구는 대동맥의 경우. 큰 동맥에서 강제로 생성은 일반적으로 조직 목욕; 힘 변환기를 동맥의 링 세그먼트를 연결 하 여 공부 대동맥의 경우 나선형 절단 하 여 스트립 선박의 있도록 부드러운 근육 섬유 첨부 파일의 포인트와 힘 변환기의 수축에 의해 생성 된 힘의 좋은 견적을 제공 하는 경도 방향에서 동쪽으로 향하게 했다 세로 축 따라 부드러운 근육입니다. Aortas의 나선형 스트립을 절단에 대 한 표준 기술 선박의 루멘에 유리 막대를 배치, 원하는 각도에서 혈관 벽에 상처를 만들고 컷은 전체 생산 확장으로 혈관 벽의 노출된 가장자리의 끝에 개최 되었다 그릇의 나선형 스트립입니다. 그 시점에서, 혈관의 내 피 쪽은 일반적으로 선박 스트립 힘 변환기에 연결 하 고 물속에 산소를 준비 하기 전에 파편을 제거 하 얼룩이 및 온도 제어 조직 목욕. 결국, 편안한 인자 (EDRF), 이후에에서 산화 질소로 식별 된 파생 된 접근 생리학의 역사에서 가장 유명 하 고 중요 한 발견 중 하나를 Furchgott와 Zawadski1, 즉 피 내 막의 역할에 의해 주도 혈관 기능을 규제. 그의 발견에 지도 하는 중요 한 이벤트는 조사 외국 표면 동맥의 내 피 쪽의 접촉을 피하 여 그대로 피를 유지 하 고 대동맥 스트립 예상 전시 하지 않았다 발견 상황 이었다 아 세 틸 콜린 (ACh), 대신에 ACh 대응 편안 하지만 수축. 그 관찰을 바탕으로, 조사는 그들은 (그러나 수축 성 힘을 생성할 수 없습니다)는 그대로 피와 대동맥 세그먼트를 연결 하는 "샌드위치" 준비 대동맥의 표준 헬리컬 스트립 개발과 ACh 유도 변환 휴식으로 수축입니다.

광범위 하 게 오늘 사용 되는이 지역에서 두 개의 주요 발전은 작은 저항 동맥2,3 에 활성 수축 성 힘을 측정 하는 준비의 개발 (예:3 장 mesentery )와 cannulated 저항 동맥 준비4,,56. 초기 보고서 중 하나에서 Mulvany 및 Halpern3 와이어 myograph 준비 공부 저절로 고혈압 쥐 (SHR)의 장 mesentery에서 절연된 저항 동맥에 활성 수축 성 힘을를 사용 하 여 설명 하 고 normotensive WKY 제어 합니다. 와이어 myograph 시스템의 개발, 후속 cannulated 저항 동맥 준비 vivo에서 조건4,,56배 가까이의 연구를 허용 하도록 개발 되었다.  두 방법 모두 귀중 한 결과 제공 하는 동안 cannulated 동맥 준비는 더 효과적으로 보존; 동맥에 본질적인 활성 톤의 추가 장점 변화 흐름 율과 내 피 전단 응력 변화에 과거 압력과 배 응답에 활성 조직적 응답 연구 조사를 허용 하 고 (참조 Halpern와 켈리6검토).

현재 종이의 주요 목표에서 이러한 중요 한 활성 톤을 조절 하는 메커니즘에 대 한 정확한 정보를 얻기 위해 절연, cannulated 저항 동맥을 사용 하 여 비디오 현미경의 영광 기술을 채용 하는 방법을 설명 하는 것입니다. 혈관, 신경, 체액, 또는 parenchymal 세포의 독립에 영향을. 이 기본 정보, 고용 표준 쥐 모델 및 예의 우리의 연구에서 새로운 유전자 조작 쥐 긴장, 텔레비전으로 얻을 수 있는 혈관 기능에 대 한 통찰력의 종류의 아이디어로 독자를 제공할 것입니다. 현미경 접근 하 고 있는 모든 제어 및 탐정의 선택, 강력한 새로운 실험 쥐 모델을 포함 한 선택적 근 친 결혼에 의해 생성 하 고 새로 개발 된 유전자의 실험적인 그룹을 포함 하는 연구에서 채택 될 수 있다 엔지니어링 기술입니다.

텔레비전 현미경 방식의 정밀 감사 cannulated 동맥 준비에 직경 변화의 측정 혈관의 내 피-종속 및 endothelium 독립 메커니즘에 관한 매우 귀중 한 정보를 제공할 수 있습니다. 휴식, 뿐만 아니라 고혈압, 높은 소금 다이어트, 그리고 다른 실험 개입으로 발생 하는 혈관 제어 메커니즘에서 중요 한 (그리고 때로는 예기치 않은) 변경. 더하여, 압력-직경 관계의 절연 측정과 cannulated 극대로 Ca2 +치료에 의해 완화 저항 동맥-무료 솔루션 또는 약리학 vasodilator 약물 평가 하기 위해 조사를 수 동맥 동맥 기능에 영향을 미칠 수 있는 동맥의 수동 기계적 특성의 변화에 중요 한 통찰력을 제공할 수 있는 수동 응력-변형 관계7 을 계산 하 고 혈관 개장 때문에 구조적인 변화 독립 (또는 이외에)의 활성 제어 메커니즘에 변경합니다. 그것은 또한 절연된 저항 동맥의 연구에서 얻은 정보 LDF, 전체 동물 레벨8,9 조직 관류를 평가 하기 위한 실용적인 방법을 이용 하 여 얻은 정보에 의해 보완 될 수 있습니다 주의 하는 것이 중요 ,10, microvessel 밀도 붙일 이라는 GS1 lectin를 사용 하 여 평가에서 얻은 정보로는 특히 작은 arterioles, 모세 혈관11 의 지하실 막에 있는 당단백질 moieties에 바인딩합니다 , 12. 후자의 방법을 고전적인 어려움 혈관에서 vivo에서, 예를 들어 비 끼얹는다 누락 계산 하 여 microvessel 밀도 추정에 적용 되지 않습니다 microvessel 밀도의 매우 정확한 견적 제공 선박 어디 혈 arterioles의 활성 폐쇄로 인해 중지. 함께 사용 하는 경우 이러한 접근 기능 변경 수준 microcirculatory; 조직 관류의 변화에 절연된 저항 동맥에 연결 하는 중요 한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그리고 cannulated 동맥 기술와 함께에서 이러한 중요 한 접근 방법의 사용의 몇 가지 예 또한 현재 원고에 제공 됩니다.

현재 종이 outbred Sprague-Dawley 쥐의 동맥에서 혈관 변화를 평가 하기 위해 비디오 현미경 검사 법 기술의 사용에 초점을 맞추고. 그러나, 그것은 중요 이러한 기술을 elucidating 선택적 번 식 또는 유전자 기술을 사용 하 여 편집에 의해 만들어진 고도로 전문화 된 유전자 조작된 쥐 긴장에서 phenotypic 변경에 매우 유용한 것으로 입증 되었습니다. 이 원고를 제공 어떻게 비디오 현미경 검사 법 기술의 예 수 귀중 한 쥐에에서 혈관 기능에 관한 중요 한 정보에서 가장 널리는 Dahl 소금에 민감한 (SS) 타고 난된 쥐 쥐 한 긴장을 포함 한 모델 제공 실험 모델을 사용 하는 소금 민감한 hypertenson18,19,20,21,,2223;의 메커니즘 연구 그리고 consomic 쥐 소금 구분 브라운 노르웨이 (BN) 쥐 긴장 SS 쥐의 선택적인 breeding를 통해 만든. Consomic 쥐 패널에서 갈색 노르웨이 쥐에서 모든 염색체 introgressed Dahl SS24,,2526 유전 배경으로 개별적으로 되었습니다. 혈압 및 혈관 반응성24,25,26 포함 하 여 다른 고기 소금 감도에 기여 하는 특정 염색체에 관한 귀중 한 단서를 제공 하는 consomic 쥐 패널의 사용 ,,2728.

SS 쥐와 개별 BN 염색체를 운반 하는 consomic 쥐를 이용 하 여 선택적 번 식 전략 또한 Dahl SS 유전으로 개별 브라운 노르웨이 염색체 introgressed의 작은 세그먼트와 좁게 congenic 긴장의 생성 활성화 배경22,29 이 제공 하는 매우 귀중 한 입력된에 특정 한 유전자 또는 혈압, 신장 손상, 혈관 반응성22,29등 중요 한 생리 적 변수 영향을 미칠 수 있는 염색체의 지구를 좁힐 수 있습니다. 쥐 유전자 도구 상자에 또 다른 강력한 추가 쥐 유전자 녹아웃 모델 ZFNs, transcriptional 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENS)를 포함 한 기술을 편집 고급 유전자를 활용 하 여 개발 하 고 가장 최근에 CRISPR-Cas913 ,,1415,,1617. 쥐에 기 절 하는 유전자를 활성화 하는 이러한 강력한 기술의 출현은 대단히 중요 한 발전 날짜에 유전자 녹아웃 학문의 사용 (및 계속 사용) 마우스 때문에 거의 독점적으로. 현재 종이 다른 실험적인 구성 요소 cannulated 동맥 기술 및 녹아웃 쥐 마스터 항 산화 및 세포 보호 전사 부족에 생리 적 제어 메커니즘을 평가 하기 위해 비디오 현미경의 값을 보여 줍니다. 요소, 핵 팩터 (erythroid 파생 2)--2 (NRF2)30,31, Sprague-Dawley 유전 배경17TALEN 기술을 사용 하 여 개발 되었다. 그 실험에서 NRF2 유전자의 손실의 기능 검증을 제공 하 고 잠재적으로 귀중 한 치료 접근을 중재 하는 NRF2 항 산화의 직접 upregulation에 따라 테스트를 비디오 현미경 기술은 생체 외에서 사용 되었다 방어입니다. NRF-2는 항 산화 비타민 C와 E32등의 직접적인 관리를 포함 하는 임상 시험의 실망 스러운 결과 비추어 인간에서 혈관 산화 스트레스를 싸우는에 상당한 치료 중요 합니다.

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Protocol

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의학 대학의 위스콘신 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC) 승인이 문서에 설명 된 모든 프로토콜 및 모든 절차는 준수는 국립 보건원 (NIH) 사무실의 실험실 동물 복지 (OLAW) 규정입니다.

1입니다. 솔루션 및 선박 챔버의 준비

  1. 일련의 실험을 실시, 사전 준비 집중된 소금 재고 솔루션 278 g/L NaCl; 구성 된 x 20의 2 L 14 g/L KCl; 11.52 g/L MgSO4. 7 H2O; 9.4 g/L CaCl2. 2 H2o. 또한 집중된 버퍼 재고 80.8 g/L NaHCO3 및 0.4 g/L EDTA, 구성 된 x 20의 2 리터를 준비 하 고 20 x 2 L 집중 캘리포니아2 +-무료 재고 솔루션 281.6 g/L NaCl;의 구성 14 g/L KCl, 및 11.52 g/L MgSO4. 7 H2o.
    참고: 재고 솔루션 X 20 저장할 수 있습니다 냉장고에 사용까지.
  2. 실험 당일 준비 생리 적 소금물 (PSS)의 2 L 집중된 재고 솔루션 x 20에서 다음과 같습니다: 2l 삼각 플라스 크 또는 동력된 교 반 접시에 비 커에 이온된 수의 1800 mL를 100 mL 소금 재고 x 20의 추가. 동안 지속적으로 솔루션 포함 된 21% O2, 5% CO2가스 혼합물으로 평형 20 x 버퍼 재고 100 mL를 추가, N2및 자석 교 반 바 감동 균형. 천천히 0.28 g NaH24 pH;를 모니터링 하는 동안 추가 파스퇴르 피 펫에서 방울 6 N HCl 또는 6.5 N NaOH 솔루션을 추가 하 여 필요에 따라 pH 7.4에 조정 합니다. PSS 준비 후 pH 조정, PSS를 1.98 g의 포도 당을 추가 합니다.
    참고: 그것은 천천히 때문에 PSS의 pH를 모니터링 하는 동안 마지막 NaH24 추가 하는 것이 중요 NaH24 알카라인 솔루션의 추가 (pH > 7.4)에 표시 된 대로 인산 칼슘 침전을 형성 수는 흐린 솔루션 또는 컨테이너의 하단에 흰색 침전의 모양입니다.
    참고: PSS의 최종 조성은 119 mM/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1.17 m m/L m g2이렇게4. 1.6 mM/L CaCl2; 1.18 mM/L NaH24; 24 m m/L NaHCO3; 0.03 mM/L EDTA; 그리고 5.5 m m/L 포도 당입니다. PSS의 구성 실험실 사이에서 다를 수 있습니다, 하지만이 제조 법은 매우 혈관 톤, 내 피 기능 및 절연된 저항 동맥 vasoactive 에이전트 응답 유지 적합 합니다.
  3. 최대 직경을 결정 하 고 생산 선박의 최대 팽창 하 여 동맥에 활성 톤을 평가 하기 위해 준비의 캘리포니아2 +500ml-20 X 캘리포니아2 +25 mL를 추가 하 여 PSS를 무료-무료 이온된 물 450 mL 소금 재고 25 mL 삼각 플라스 크 또는 비 커와 비슷한 1.2 위의 단계에서 버퍼 재고 x 20의 뒤. 모니터링 솔루션의 pH를 조정 하는 동안 NaH24 의 0.07 g 솔루션에 추가 합니다. 캘리포니아2 +-무료 PSS 정상적인 PSS에 선박 응답에 영향을 미칠 수 있는 세포내 캘리포니아2 + 매장을 없애고 방지 하기 실험의 끝에 PSS 저수지와 선박 챔버에 추가 됩니다. 때문에 캘리포니아2 +-무료 솔루션, 동맥의 최대 휴식을 생성 하는 실험의 끝에 추가 됩니다 PSS에 포도 당을 추가할 필요가 없습니다.
    참고: 때, 캘리포니아2 +의 최종 구성 완료-무료 PSS는 120.6 m m/L NaCl; 4.7 mM/L KCl; 1.17 m m/L m g2이렇게4. 1.18 mM/L NaH24; 24 m m/L NaHCO3; 0 mM/L CaCl2; 그리고 0.03 m m/L EDTA입니다.
    참고: 많은 연구는 동맥의 최대 팽창을 요구, verapamil (1 µ M) 같은 칼슘 항목 차단 및/또는 나트륨 nitroprusside (10 µ M)과 같은 산화 질소 기증자 추가할 수 있습니다 PSS에서 캘리포니아2 + 제거 뿐만 아니라 솔루션에.
  4. 지속적으로 고립 된 대동맥 반지, 장 평활 근, 또는 다른 조직 (그림 1)을 공부 하는 데 사용 하는 표준 기관 목욕에서 선박 챔버로 흐르는 PSS 평형 여 포2, PCO2및 PSS의 pH를 유지 합니다. Tetrafluoroethylene 튜브의 합성 중합체를 사용 하 여 연결할 가스 탱크 기관 목욕 튜브의이 종류는 가스 불 침투성, 튜브, 예를 들면, 라텍스의 많은 다른 형태를 달리 하기 때문에.
  5. 장소는 작은 공기 돌 PSS 가스 구성 유지 하려면 배 실에서 재래식 가스 혼합물에 연결.
    참고: 변화 포2 에 선박 응답 선박 실과 luminal perfusate에 PSS O2, 예를 들어, 21% O2, 10% O2, 5 %O2의 다양 한 비율을 포함 하는 가스 혼합물으로 평형으로 시험 될 수 있다 , 0% O2, 5% CO2 와 균형 N233,,3435와 함께. 두꺼운 벽, 혈관 벽의 센터에 산소의 확산 제한 해야 할 수 있는, 큰 동맥 산소, 예를 들면, 95% O2 의 더 높은 백분율을 사용할 수 있습니다.
  6. 개별 실 그들의 열 전달 특성에 따라 달라질 수 있습니다으로 밀접 하 게, 선박 챔버에서 온도 모니터링 합니다.
    참고: cannulated 저항 동맥의 연구에 사용 하는 많은 상업적으로 준비 된 선박 챔버 활용 연동 펌프 가스 equilibrated 저수지에서 산소 PSS를 제공를 제공 하는 매우 정밀 하 게 제어 목욕 온도 산소의 PSS입니다.
  7. 대형 (2 패) Mariotte 병 스 토퍼와 기관 목욕을가 열 하 고 가스 equilibrates 용기 챔버 (그림 1A)로 흐르는 PSS에 PSS를 지속적으로 제공 하는 저수지 역할을 중앙 유리 튜브에에서 PSS를 놓습니다.
  8. 장소 Mariotte 병 기관 목욕으로 PSS의 배달에 대 한 일정 한 액체 정역학 압력 머리 유지 기관 목욕에 PSS의 상단으로 동일한 수준에 중앙 유리 튜브의 오프닝. 사용 하 여 폴 리 에틸렌 튜브 J 모양 유리 또는 플라스틱 튜브 기관 목욕으로 PSS Mariotte 병에서 제공에 연결.
  9. Luminal 관류 (그림 1A)를 사용 하 여 폴 리 에틸렌 튜브 60 cc 플라스틱 주사기 (일반적으로 80 mmHg 쥐 뇌의 연구에 대 한 원하는 유입 압력을 유지 하는 위치에 높은 구성 PSS 저수지에 유입 피 펫을 연결 자 지를 통해 시스템에 연결 된 한 동맥), 압력 측정 변환기
  10. 압력 기울기에 대 한 응답에 있는 배를 통해 흘러 PSS 수 있도록 폴 리 에틸렌 튜브를 유출 피펫으로 고 저수지 유입 저수지와 비슷한에 유출 라인 연결. 비슷한 자 지와 압력 변환기 연결을 사용 하 여 유출 압력 측정.
    참고: 과거 압력을 설정 하 고 혈관을 통해 흐름 제어에 대 한 절차는 아래 2에서 설명 합니다.
  11. 실험의 끝에, 상공 회의소, 배달 라인과 저수지 시스템과 증류수 린스 철저 하 게. 빈번한 간격 깨끗 한 배관 및 납품 라인을 대체 또는 시스템에는 stopcocks를 대체 하 고 주기적으로 박테리아와 오염 원인이 다른 미생물의 성장을 방지 하기 위해 산 성 세척에 어떤 유리 PSS 저수지를 대상 및 혈관 반응성을 영향을 줍니다.

2. cannulated 동맥 준비

  1. 5 %isoflurane Sprague-Dawley 쥐를 anesthetize 하 고 1.5-2.5% 의학 급료 산소36을 사용 하 여 마 취를 유지 합니다. 또는, 케 타 민 (75.0 mg/kg), acepromazine (2.5 mg/kg), xylazine (10.0 mg/kg);를 포함 하는 근육 주사를 관리 pentobarbital (50-60 mg/kg);의 복 주사 또는 마 취, 프로토콜 및 탐정 환경 설정에 따라 다른 승인 된 방법.
  2. 깊은 마 취 쥐 목을 벨 고 저항 대뇌 동맥의 연구에 대 한 뇌를 제거 합니다.
  3. 두뇌의 제거 후, 신중 하 게 중간 대뇌 동맥 (MCA) (또는 격리 관심 예를 들어, 두개골 기저 부의 동맥, 후부 대뇌 동맥의 다른 동맥)37,38. MCAs를 격리 하려면 뇌를 부정사 차가운 PSS (그림 2)으로 가득 유리 페 트리 접시에 놓습니다.
  4. 욕실이 위 및 Dumont #5 좋은 팁 겸 자 사용 하 여 뇌에서 MCA를 삭제할.  MCA는 집게를 사용 하 여에서 어떤 잔여 뇌 조직 깨끗 하 고 온도 제어 선박 상공으로 앞에서 설명한 PSS를 포함 하는 동맥을 전송. 33 , 34  .
  5. 동맥 혈관 챔버를 전송 하려면 부드럽게는 ACA 또는 사후 통신 동맥 세그먼트 삭제 선박 누른 신중 하 게 챔버에 배치 합니다.
    참고: MCA, 뿐만 아니라 cannulated 선박 시스템은 다양 한 골격 근육 저항 동맥33,,3940, mesenteric 저항 동맥을 포함 하 여 작은 그릇 준비에 적합 38 , 41 , 42, 그리고 큰 (첫번째 순서) cremaster 근육43, arterioles, 인간 관상 동맥 arterioles 고 인간의 arterioles gluteal 생44,45, 동안 피하 지방 조직에서 얻은 46,47.
  6. 팁 MCA의 루멘으로 발전 될 때까지 피 펫 기지 쪽으로 당겨 유입 micropipette에 동맥을 연결 합니다. 이전 동맥 (그림 1B)에 주위 10-0 봉합에서 조롱 한 가닥 파이버에서 준비 하는 루프를 매 여 유입 피 펫에 동맥을 보안 합니다. 두 번째 봉합 루프 선박 (그림 1B) 주위를 강화 하 여 유출 피 펫에 MCA의 반대쪽 끝을 보안 합니다.
    참고: 봉합 루프 선박에 장착 하기 전에 micropipettes에 및 첨부 파일의 마지막 포인트에 가까운 위치, 어떤의 위험을 최소화 있도록 동맥에 쉽게 미 끄 러 하 고 신속 하 게 확보 선박 위치에 있을 때는 동맥은 펫을 미끄러져입니다.
    참고: Micropipettes 붕 규 산 유리 모 세관 튜브 (2 mm 외부 직경 1 m m 내경, 길이 10 c m)에서 준비가 수직 micropipette 끌어당기는 사람을 사용 하 여. 동맥을 연결 하기 전에 micropipettes의 팁 직경을 관류 시스템에서 유입 및 유출 저항의 불일치를 방지 하기 위해 최대한 가깝게 일치 합니다.
  7. 동맥은 micropipettes에 안전 하 게 연결 되어, 후 유입 피 펫 소유자에 연결 하는 마이크로 미터를 사용 하 여 제자리에 길이에 동맥을 스트레칭.
  8. 동맥에 일정 한 압력을 유지 하기 위해 10-0 봉합에서 조롱 하는 단일 가닥으로 모든 측 지점에서 넥타이.
  9. Intraluminal (과거) 압력 일시적으로 유입 피 펫을 닫은 후 계속 유지 하 여 누출의 부재를 확인 합니다. 어떤 지점에서 매십시오 또는 압력이 떨어지는 경우는 혈관에 있는 구멍에 대 한 확인. 과거 압력 일정 하 게 유지 하는 확인 한 후 관류를 복원 합니다.
    참고: Cannulation 절연된 저항 동맥의 수동 손 재주 및 연습을 요구 한다. 관찰 될 주요 조치는 펫을 침입 방지 하 고 동맥은 펫에서 슬라이드 하지 않습니다 있는지 확인 하십시오 있습니다. 선박 외상 endothelium을 손상 시킬 수 있습니다 전체 절차를 통해 격리 된 동맥을 부드럽게 하는 것이 중요 하다 혈관 부드러운 근육의 정상적인 기능을 방해 그리고/또한.
  10. 이루어진 해 현미경에 부착 하 고 비디오 마이크로미터와 텔레비전 모니터 (그림 1B, 1c)에 연결 된 비디오 카메라는 비디오 현미경 설치 (그림 1A)를 사용 하 여 동맥의 내부 직경을 측정 합니다. 이로써 동맥의 안 벽에 이동식 참조 라인을 배치 하 여 수동으로 배 직경을 측정 하는 관찰자 고, 원하는 경우, 뿐만 아니라, 동맥의 외부 벽에 혈관 벽의 두께 측정 하기 위하여.
    참고: 일부 비디오 마이크로미터 선박 크기의 자동 추적을 제공합니다.
    참고: 현미경 스테이지 마이크로 미터와 유입 비디오 마이크로미터 보정 및 압력 트랜스듀서는 수은 혈압 계 (0 mmHg, 50 mmHg, 100 mmHg, 150 mmHg, 그리고 200 mmHg) 실험의 정확한 측정을 보장 하기 위해 사이 유출 혈관 직경 및 intraluminal 압력입니다.
    참고: 표준 제어 과거 압력 쥐 MCA 실험에 대 한 80 mmHg입니다. 높고 낮은 압력 레벨 보정 극대로 동 공이 확장 되어 동맥에서 압력 및 수동 압력 직경 곡선 변화 과거에 조직적 응답의 연구에 대 한 정확도 보장합니다.
  11. 일정 한 레벨에서 원하는 과거 압력을 유지 하기 위해 유입 및 유출 저수지의 높이 조정 합니다. 작은 금액 (< 5 mmHg)으로 유입 저수지를 제기 하 고 동일한 양만큼 유출 저수지를 낮추는 뜻 과거 압력을 유지 하 고 배 루멘6에서 관류 흐름을 만듭니다.
    참고: 유입 저수지를 제기 하 고 동일한 금액으로 유출 저수지를 낮추는 압력 동맥, distending 같은 말은 과거를 유지 하지만 선박, 흐름 및 전단 응력을 발생 시키는 압 그라디언트를 생성 수는 변화 intraluminal 전단 응력에 다른 실험에 피 종속 응답을 평가 하는 조사는48를 그룹화 합니다.
  12. 조직적 응답 선박 vasodilator 자극에 응답을 평가, 동맥 실험 전에 활성 톤 (약 40%)의 적합 한 레벨을 전시 있는지 확인 합니다. 어떤 동맥 혈관, 예를 들어, 일반적으로 활성 휴식 톤을 전시 하지 않는 작은 mesenteric 동맥을 제외한 나머지에서 활성 톤 부족을 삭제 합니다.
    참고: 일반적으로 자연 스러운 톤을 전시 하지 않는 선박에 대 한 상응 하는 금액 norepinephrine 등 phenylephrine vasoconstrictor 주 작동 근을 이용 하 여 미리 동맥 수축. 미리 동맥을 수축 하는 데 사용 하는 주 작동 근의 복용량을 선택 하는 좋은 방법은 vasoconstrictor 에이전트, 예를 들어, norepinephrine41,42의 EC50 복용량을 활용 하는 것입니다. 그러나, 약리학 vasoconstrictor 요원 하지 휴식 조건 아래 자연 활성 톤 하는 동맥에 적용 합니다.
  13. ACh의 농도 증가의 추가 동안 혈관 직경을 측정 하 여 cannulated 저항 동맥의 내 피-종속 반응 테스트 (10-10 M-10-5 M) 선박 약 실에. (10-10 M-10-5 M)에 산화 질소 기증자 나트륨 nitroprusside의 농도 증가의 추가 동안 혈관 직경을 측정 하 여 혈관 평활 근의 내 피 독립 질소 산화물 감도 테스트는 선박 약 실입니다.
    참고: 감도 vasoconstrictor 에이전트 및 다른 vasodilator 촉진제를 테스트할 수 있습니다 비슷한 방식 선박 약 실에 있는 주 작동 근의 증가 농도 추가 하 여.
    참고: vasoactive 에이전트 뿐만 아니라 다양 한 약물, 억제제, 및 다른 약리 에이전트 추가할 수 있습니다 조직 목욕 또는 luminal perfusate. 포2 (로 PCO2 와 pH) 변화 관리 될 수 선택적으로 동맥의 내 피 쪽 또는 추가 luminal luminal perfusate의 별도 평형에 의해 보정된 가스 혼합물에 연결 하는 공기 돌으로 다른 조직 목욕33,,3449에 PSS를 equilibrate 하는 데 사용 하는 혼합. 과거 압력의 변화에 대 한 조직적 응답 유출 피 펫을 폐쇄 하 고 양육 하 여 공부 될 수 있다 (또는 저하) PSS 저수지의 높이는 유입 피 펫49,,5051 에 연결 증가 또는 intraluminal 압력을 감소 시킨다.
  14. 특정 자극에 선박 응답 중재에서 endothelium의 역할을 테스트 하려면 혈관 내 피를 제거 하 고 그 자극에 선박 응답 endothelium의 유무에 비교. 있는 피를 제거 하려면 신중 하 게 유출 피 펫에서 동맥 풀고 천천히 공기 bolus로 동맥의 루멘 perfuse (0.5-1.0 mL). 어 재 관류 후 PSS 관류 전에 다시 유출 피 펫43에 배를 묶는 세포질 파편을 복원 합니다.
    참고: 내 피 노출 절차에 따라 그것은 endothelium 알려진 endothelium 종속 엷게 그 선박 종류에서를 생산 하는 주 작동 근 (보통 ACh) 혈관 응답 테스트 하 여 제거 됩니다 확인 해야 합니다. 그러나, 특정 pathologic 조건에서 endothelium 종속 vasoconstrictors 해제 됩니다, 어떤 경우에, 그것은 위 응답 내 피 제거 다음 제거 됩니다 확인 해야 합니다.
  15. 실험의 끝에, 캘리포니아2 +를 추가 하 여 동맥의 최대 직경을 결정-perfusate 및 superfusate를 PSS를 무료. 적극적인 휴식 톤 (%) ((D최대-D나머지) /D최대)로 D최대 는 캘리포니아2 +의 최대 직경 100 x 계산-무료 솔루션 및 D나머지 는 휴식 제어 직경.
    참고: 다른 실험적인 그룹에 있는 극대로 편안한 동맥의 직경 측정은 활성 휴식 톤, 구조 (, 벽 두께 루멘 직경에서 변화), 리 모델링 및 동적 기계적 특성 비교에 중요 한 (과거 압력의 서로 다른 수준에서 수동 직경에서 계산 응력-변형 관계).

3. 대뇌 혈액 흐름 응답 LDF와 평가

  1. 5 %isoflurane 동물을 anesthetize 및 보안 기구 stereotaxic9,10에 쥐.
  2. 호흡 주파수, 끝 간만 CO2, 그리고 발가락 핀치36와 마 취의 깊이 모니터링 하는 동안 상수 마 취 동물을 유지 한다.
  3. 신중 하 게 얇은 광학 커플링10를 제공 하는 낮은 속도 치과 드릴 및 미네랄 오일을 사용 하 여 반투명에 두개골. 주의 과도 한 열 생성을 방지 하 고 뼈를 관통 하지 않도록 합니다.
    참고: 기본 조직에 도달 하 고는의 크기 (, 적혈구) 움직이는 입자의 수에 의해 결정 됩니다 도플러 이동 측정 하기 위하여 조사를 다시 반영 레이저 빛을 허용 한다 두개골의 고 그들의 속도입니다.
  4. micromanipulator LDF 프로브를 장악 하 고 두개골의 남았다 영역 바로 위에 놓습니다. 실험 기간 동안 LDF 조직에의 한 제한 된 지역에 흐름을 측정 하기 위해 설계 하 고 모션 아티팩트에 매우 민감한 LDF 프로브 또는 자체 준비의 움직임을 방지 하기 위해 매우 중요 하다.
    참고:의 처음 위치에서 검색의 모든 움직임 비교 제외 조직의 다른 영역에 혈액 흐름의 견적을 제공할 것입니다. LDF 절대 흐름 값을 제공 하지 않는 하는 동안 주제 사이 비교에 적합 하지 않습니다, 그것은 noninvasively 개별 과목; 실험 개입에 대 한 응답에서 조직 관류의 변화를 평가 하는 훌륭한 방법 그리고 LDF 신호 제어 값에서에 상대적인 변화를 평균 하 고 다른 실험적인 그룹에 있는 컨트롤에서 LDF 신호에 있는 변화에 비해 수 있습니다.
    참고: LDF는 다른 실험 그룹8,,910전체 혈관 침대의 수준에서 혈액 흐름을 조절 하는 요인에 대 한 편리한 방법입니다. LDF와 조직 관류의 평가 전체 침대 관점에 고립 된 배 연구 로부터 얻은 지식을 동화 하는 실용적인 접근 방식을 제공 합니다. 저항 동맥 사이는 미세 혈관 제어 메커니즘에 있는 지역 다름, 없다면 LDF 얻은 측정 일반적으로 얻은 결과와 일치 하는 조직의 혈액 흐름 제어의 좋은 표시를 제공 cannulated 동맥 준비입니다.

4. 평가 GS1 Lectin과 골격 근육 Microvessel 밀도의

  1. 표준 미세 수술가 위로 음 낭 오픈 절단 하 고 다음 몬 트 #5 집게를 사용 하 여 근육을 파악 하 여 남성 쥐에서 cremaster 근육을 제거 합니다.
    참고: (예를 들어, cremaster 근육 뿐 아니라 신 근 digitorum longus와 tibialis 앞쪽 근육 남성 및 여성 쥐에서 발견 되는) 얇은 근육 적합 사용 하기 위해 전체 lectin 연구에 대 한 마운트로 비록 조직학 두꺼운 조직에 대 한 섹션을 사용할 수 있습니다.
  2. 한 컷을 사용 하 여 고환에서 cremaster 근육을 제거 합니다. 얼음 처럼 차가운 PSS에 배치 하 고 표면 내부 바닥에 실리콘 고무 라이닝과 페 트리 접시에 그것을 핀. 부드럽게 떨어져 결합 조직 Dumont #5 집게를 사용 하 여 나무 랄 수 있습니다.
  3. 버퍼링 된 PSS의 2 mL와 함께 근육 샘플 린스 다음 rhodamine 표시 GS1 lectin (20 µ g/mL PSS) 2 mL와 함께 12-잘 셀 문화 판에서 50 분에 젖어/잘 그 빛을 제외를 알루미늄 호 일에 싸여 있다.
  4. Lectin 솔루션에서 조직을 제거 하 고 그들에 게 PSS에 세 번을 씻어 5 분 "세척" 외피에는 로커와 현미경 슬라이드에 탑재. 품 어 어둠 속에서 조직 및 형광의 손실을 방지 하기 위해 어둠 속에서 슬라이드를 저장 해야 합니다.
    참고: 슬라이드는 즉시 사용할 수 없습니다, 그들은 형광의 손실 없이 냉장고에 보관 될 수 있습니다. 장기간된 보관에 대 한 슬라이드11악화 방지 하기 위해 냉동 실에 보관할 수 있습니다.
  5. Microvessel 밀도52이미지 통해 컴퓨터에서 생성 된 그리드 선 또는 슬라이드를 보려면 하는 데 사용 되는 모니터 위에 겹쳐 투명 그리드 오버레이 레이블된 microvessels의 교차점의 수를 계산 하 여 평가 합니다.
    주: GS1 lectin 접근 설명 하는 데 사용 되었습니다: 소금 유도 microvascular 진공53, 소금 방지 보호 효과 유도 angiotensin II 억제 소금 먹이 동물17 microvessel 밀도 복원 ,5354; 쥐 소금 먹17; microvessel 희박을 방지 하기 위해 낮은 복용량 angiotensin II 주입의 보호 효과 중재 하는 NRF2의 역할 그리고 또한 안의 역할을 평가 하기 위해 신생 응답 소금에 만성 근육 자극을 유지 하는 II 쥐54,55먹이. GS1 lectin 기법에의 한 장점은 cannulated 저항 동맥 또는 LDF의 연구에 사용 하는 동일한 동물에 microvessel 밀도 평가 하기 위해 사용할 수 있습니다.

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Representative Results

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과거 압력 정상 에 vivo에 에서 그리고 parenchymal 세포의 부재에서 cannulated 저항 동맥의 생체 외에서 현미경에 작은 저항 동맥 (큰 arterioles) 활성 톤을 영향을 미치는 요인의 연구에 대 한 허용 영향을 미칩니다. 다양 한 vasodilator 및 vasoconstrictor 자극에 선박과 일반 PSS, 캘리포니아2 +에서 과거 압력 상승에 대 한 조직적 응답의 반응성을 평가 하는 것 외에도-무료 PSS는 perfusate와 superfusate의 끝에 추가할 수 있습니다 최대 선박 직경 및 벽 두께 결정 하는 실험. 후자의 측정은 혈관 개장, , 벽/루멘 비율 변화 혈압 또는 약리 에이전트의 관리에 대 한 응답에서 발생할 수 있는 변화 평가에 매우 중요 합니다. 캘리포니아2 +에서 극대로 동 공이 확장 되어 혈관의 직경의 측정-무료 PSS는최대 D와 D나머지 있는 최대 (캘리포니아2 +-100, x ((D최대-D나머지) /D최대)로 내장 음색을 계산 하는 데 유용 PSS 무료) 제어 평형 압력 (MCA에 대 한 일반적으로 80 mmHg)에 각각, 직경 (PSS), 휴식. 우리의 경험에서는, MCA에 활성 톤 평균 약 80 mmHg의 과거에서 40%. 극대 동 공이 확장 되어 동맥의 직경을 측정은 또한 직경을 측정 하 여 혈관의 수동 기계적 특성을 평가 하는 실용적인 방법을 압력 distending 및 결과를 사용 하 여 과거의 서로 다른 수준에서 동맥의 응력-변형 관계 및 선박7,56의 다른 기계적 성질을 계산 합니다.

그림 3 추가 선택적 번 식 접근법을 활용 하 여 SS.13BN 쥐에서 파생 된 3 좁혀 congenic 긴장의 도식 적인 표현입니다. 이러한 쥐 긴장에서 염색체 세그먼트 브라운 노르웨이 renin 대립 유전자 (Ren1 억)를 포함 하거나 또는 바로 (Ren1-SSA) 위에 또는 (Ren1-SSB) renin 유전자 소재 시 아래 그냥 잘라 (따라서 유지 SS renin 대립 유전자). 29연구에서는, 브라운 노르웨이 renin 대립 유전자를 포함 하는 염색체 세그먼트 포함만 25 유전자.

그림 4 endothelium 종속 vasodilator ACh에 대 한 응답을 보여 줍니다 (1 µ M) 남성 달 SS 쥐와는 3에서 고립 된 MCAs 좁혀 congenic 긴장 그림 3에 표시 된. 중 하나 나 포함 하는 (Ren1-BN) 또는 (Ren1-SSA) 바로 위에 차단 된다 (Ren1-SSB)는 renin 유전자 아래 약 25 유전자 (, renin 유전자 소재 시 주변 지역)의 지역 제한이 세 congenic 긴장의 결합된 사용. 그 실험에서 동물 normotensive 되었고 낮은 소금 먹이 (0.4 %NaCl) 다이어트. ACh 연구29 endothelium 종속 팽창 했다에 SS 부모의 스트레인 및 두 congenic 긴장 유지 SS renin 대립 유전자, 결 석 하지만 SS 유전 배경에서 BN renin 대립 유전자를 나르는 congenic 긴장에 복원 되었습니다. 그 연구의 결과 SS.13BN consomic 쥐57,58 를 이용 하 여 이전 연구의 결과 지지 하 고 강력한 증거를 제공 하는 내 피 기능 장애 normotensive 경우에 SS 쥐에 존재 하는 고 낮은 소금 다이어트를 먹이. 함께, 그 연구29,,5758 의 결과 지원 가설 SS 쥐에서 그 내 피 기능 장애 있다 낮은에 만성 노출의 결과로 renin 유전자의 장애인된 규정으로 인해 혈액에 angiotensin II의 수준입니다.

또 다른 연구59, 그림 5에 요약 비교 남성 달 SS 쥐와 SS.5BN consomic 쥐 염색체 5 (포함 브라운 노르웨이 유전자 운반에서 endothelium 종속 vasodilator ACh 격리 된 MCAs (MCA)에 대 한 응답 다양 한 isoforms의 시 토 크롬 P450 4A ω-hydroxylase)에 대 한. 그 연구에 동물 먹 힌 중 낮은 소금 (0.4 %NaCl) 또는 높은 소금 (4 %NaCl) 다이어트. SS 쥐에서 MCA 달리 endothelium 종속 팽창 ACh에 낮은 소금 규정식 먹이 SS.5BN consomic 쥐에서 MCA에 유지 되었다. 또한, (그리고 SS.13BN consomic 쥐57,58, Sprague-Dawley 쥐33,39,,4060, 골든 햄스터 에서 결과 달리 61), 높은 소금 다이어트는 CYP450 4A ω-hydroxylase를 나타내는 SS.5BN 쥐에 팽창 ACh 유도 제거 하지 못했습니다 및 20-hydroxyeicosatetraenoic 산 (20-HETE)는 중요 한 참여자 혈관 산화 스트레스 및 내 피 SS 쥐 그리고 다른 긴장에 규정식 소금 입구에 있는 고도 역이 기능 실험적인 관점에서 endothelium 종속 팽창 ACh 제거 하 고 소금 다이어트의 실패 어떻게 cannulated 저항 동맥의 연구는 전통적인 지혜에서 출발 하는 예기치 않은 결과 생성할 수 있습니다의 예를 제공 하 고 이러한 중요 한 혈관의 기능에 영향을 미치는 복잡 한 제어 메커니즘의 새로운 이해를 발생할 수 있습니다.

그림 6 ACh에 고립 된 MCA의 응답은 (1 µ M) 야생 유형 및 Nrf2(-/-) 에서 녹아웃 쥐 낮은 소금 다이어트 먹이 (0.4 %NaCl), 높은 소금 다이어트 (4 %NaCl), 또는 알려진된 NRF2 활성 제30,62 포함 하는 높은 소금 다이어트 . 소금 유발 산화 스트레스의 부재, ACh 유도 팽창 MCA에서 야생 유형 및 Nrf2(-/-) 녹아웃 쥐에서 유사 했다. Sprague Dawley 쥐의 이전 연구의 결과와 일치, 높은 소금 다이어트 ACh 유도 팽창 야생 유형 및 Nrf2(-/-) 녹아웃 쥐 제거. 또한 높은 소금 다이어트 NRF2 유도의 복원 endothelium 종속 팽창 ACh Nrf2 유전자 녹아웃 쥐에서의 성공적인 제거를 보여주는 Nrf2(-/-) 쥐에 강포한 유형 쥐만 그리고 혈관 산화 스트레스를 개량 하는 치료 접근으로 NRF2 업-레 귤 레이 터를 사용 하 여 지원.

그림 7 LDF 측정 비교 pial 미세 혈관의 진보적인 감소 동맥 혈압 연속 혈액 볼륨 인출 Sprague-Dawley 쥐에 관리에 의해 생산에 응답의 결과 요약 일반 소금 (0.4 %NaCl) 다이어트 또는 높은 소금 (4 %NaCl) 4 주 동안 다이어트. 달리 낮은 소금 규정식 먹이 쥐, 쥐 먹이 높은 소금 다이어트 전시 대뇌 혈액 흐름 autoregulation에 대 한 책임 메커니즘은 나타내는 관류 압력의 감소 하는 동안 일정 한 혈액의 흐름을 유지 하는 장애인된 능력 높은 소금 다이어트에 장기 노출에 의해 손상. 그 실험의 결과 소금 먹인 쥐60 의 고립된 대뇌 동맥에 손상된 혈관 이완 메커니즘의 존재와 일치 하 고 지원 하 고 확장 LDF 측정 수 고용 하는 방법의 좋은 예를 제공 합니다 채용 하는 연구의 결과 절연 저항 동맥 혈관 전체 침대의 수준.

저항 동맥 기능 평가 이외에 사용 하 여 격리 된 동맥 조직 관류 레이저 도플러 flowmetry, microvessel 밀도 및 신생 응답 만성 근육 자극54, 등 다양 한 자극을 사용 하 여 55 붙일 레이블 GS1 lectin, arterioles, 모세 혈관의 지하실 막에 있는 당단백질 moieties에 선택적으로 묶는 활용 같은 동물에 평가할 수 있습니다. 그림 8 일반적인 lectin Sprague-Dawley 쥐 2 주 (참고 높은 소금 먹인된 쥐에서 microvessels의 더 낮은 밀도)에 대 한 낮은 소금 다이어트 또는 높은 소금 다이어트 먹이의 cremaster 근육에 얼룩을 보여 줍니다. Microvessel 밀도 lectin 표시 된 microvessels 컴퓨터에서 생성 된 참조 표52와 교차를 계산 하 여 평가 하며 신생 응답54,55 를 평가 하는 우수한 방법 또는 검색 및 계량 고혈압과 높은 규정식 소금 입구12,,1753같은 조건에서 microvessels의 손실.

Figure 1
그림 1: 생체 외에서 비디오 현미경 셋업 절연, cannulated 저항 동맥 (A)를 공부 하는 고용. Cannulated 저항 동맥 유리 micropipettes (B)와 cannulated 저항 동맥 (C) 루멘 직경의 측정을 보여주는 비디오 마이크로 미터 디스플레이에 묶여있다. 패널 B에서 눈금 막대 cannulated 동맥 (µ m)의 내부 직경을 나타냅니다 패널 c에서 125 µ m 이며 실험을 실시 하는 관찰자에 의해 동맥의 내벽에 수동으로 배치 이동 참조 라인 사이의 거리의 비디오 디스플레이 . 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 중간 대뇌 동맥 뇌에서 분리 하 고는 micropipettes와 cannulation에 대 한 준비에 대 한 절차의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Dahl 소금 민감한 유전 배경으로 갈색 노르웨이 염색체 13 introgressed의 작은 세그먼트는 데 좁혀 congenic 쥐 긴장의 회로도. 염색체 세그먼트 또는 브라운 노르웨이 renin 대립 유전자 (Ren1 억) 포함 (Ren1-SSA) 바로 위에 잘라 또는 바로 아래 (Ren1-SSB) renin 유전자 소재 시 및 따라서 SS renin 대립 유전자를 유지. 이 수치를 수정 하 고 듀란 외. 에서 증 쇄 하는 29 미국 생리 적인 사회의 허가. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 절연, 응답 SS의 MCAs 쥐 및 congenic 쥐 긴장 ( 그림 2에 나와 있는) 1 µ M 아 세 틸 콜린을 cannulated. 데이터 이전에 아 세 틸 콜린, 제어 직경 휴식에서 평균 지름 변화 (Δ μ m) ±SEM으로 표현 되 고 듀란 그 외 여러분 에 의해 원래 연구 합니다. 29 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 동물에 1 µ M 아 세 틸 콜린의 절연, cannulated SS의 MCAs 쥐과 SS.5BN consomic 쥐 응답 먹이 낮은 소금 (0.4 %NaCl) 또는 높은 소금 (4 %NaCl) 다이어트. 데이터 이전에 아 세 틸 콜린, 제어 직경 휴식에서 평균 지름 변화 (Δ μ m) ±SEM으로 표현 되 고 Lukaszewicz 그 외 여러분 에 의해 원래 연구 합니다. 64 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림 6: 응답 1 µ M 아 세 틸 콜린 Nrf2(-/-) 녹아웃 쥐와 야생 타입 컨트롤의 절연, cannulated MCAs에 낮은 소금 규정식 먹이 (0.4 %NaCl), 높은 소금 다이어트 (4 %NaCl), 또는 알려진된 NRF2 활성 제30, 를 포함 하는 높은 소금 다이어트 62. 데이터 이전에 아 세 틸 콜린 제어 직경 휴식에서 평균 지름 변화 (Δ μ m) ±SEM으로 표현 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 7
그림 7: 뇌 혈액 흐름 pial 미세 혈관에 LDF에 의해 평가. Sprague Dawley 쥐 4 주에 대 한 높은 소금 다이어트 유지 동맥 혈압 연속 혈액 볼륨 인출에 대 한 응답에서 감소 되었다 혈액 흐름 상수를 유지 하는 그들의 기능에 상당한 장애를 전시. 데이터 제어 ±SEM의 평균 %로 그려집니다 * p < 동맥 압력을 의미 하는 동시에 낮은 소금 규정식 대 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 8
그림 8: 쥐 cremaster 근육 arterioles, 모세 혈관 microvessel 밀도의 평가 대 한 식별 GS1 lectin rhodamine 분류와 표시의 현미경 사진. Cremaster 근육 Sprague-Dawley 쥐 낮은 소금 먹이에서 가져온 (LS, 0.4 %NaCl) 또는 높은 (HS:4 %NaCl) 다이어트 2 주 동안 소금과 LS 컨트롤에 비해 HS 먹이 동물에 microvascular 진공을 보여줍니다. 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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이 종이 소개에서 설명 했 듯이, 텔레비전 현미경의 사용에 설명 합니다 및 절연된 저항 동맥 표준 쥐 모델 (비디오에 사용)에 뿐만 아니라 혈관 기능을 평가 하기 위해 접근 하지만 또한 매우 전문화 유전자 소설과 이러한 접근법을 활용 하 여 얻을 수 있는 강력한 통찰력을 보여 조작된 쥐 변종. 활성 톤을 평가 하기 위해 이러한 강력한 방법 사용 하 고 작은 저항 동맥의 수동 기계적 성질 endothelium 종속 규칙을 포함 한 혈관 제어 메커니즘의 넓은 스펙트럼에 관한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 저항 동맥에서 활성 톤의 정상 및 병 태 생리 조건, 및 수동 속성 동맥의 혈관 평활 근 기능 혈관 개장에 관련 하 고 혈관 벽 역학에서 변경 됩니다. 내 피 기능 장애 인간 심장 혈관 관련 사망63를 포함 하 여 여러 불리 한 심장 혈관 사건의 강력한 전조 표시기로 표시 되었습니다 그리고 cannulated 저항 동맥 준비에서 특히 귀중 한 내 피 기능 장애를 감지 하 고 내 피 기능 장애의 메커니즘에 대 한 우리의 이해를 증가.

비디오 현미경 기술 생체 외에서 절연된 저항 동맥 채용의 효과 설명 하기 위해, 우리 제공 Dahl 소금 민감한 (SS) 쥐 그리고 소설 consomic에 이러한 기술의 사용의 예 쥐 긴장 감소 하는 SS 부모의 스트레인24에 비해 혈압의 소금 감도. 그 연구 조사 혈압 그리고 SS 쥐에 혈관 변경 소금 감도에 기여에 특히 관심이 있는 두 개의 염색체에 유전자와 관련 된 혈관 제어 메커니즘. 이러한 염색체는 염색체 13, renin 유전자18,22,29,,5758, 운반 및 염색체 5, CYP450 4A ω-hydroxylase64의 isoforms 위한 유전자를 나르는 ,65-20-HETE, 신장 기능 및 혈관 반응성66,,6768에 주요 효과가 있는 합성 효소. 쥐 유전자 도구 상자에 또 다른 최근 및 강력한 추가 고급 유전자 편집 기법 등을 활용 하 여 쥐 유전자 녹아웃 모델의 개발: ZFNs; transcriptional 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENS), 그리고 가장 최근에 CRISPR-Cas913,14,15,,1617. 생체 외에서 비디오 현미경 Nrf2(-/-) 녹아웃 쥐 모델 중요 한 항 산화 및 세포 보호 전사 인자 NRF2, 부족에서 고립 된 MCAs 공부 이러한 기법을 활용 하 여 중요 한 제공 하 고 이전에 상승의 부재에서 내 피 기능 장애 소금 유도의 메커니즘에 대 한 알 수 없는 통찰력 혈액 압력17. 이러한 전문된 쥐 모델을 활용 하 여 실험의 특정 한 결과 이전 보고서17,29,,5758,59, 의 수에 설명 되어 60 , 64 , 65 .

그것은 분명 절연, cannulated 저항 동맥의 연구는 다양 한 조건에서이 비판적으로 중요 한 혈관의 기능을 조절 하는 메커니즘을 이해에 매우 중요 한, 그것은 매우 중요 한 운동 하는 정확 하 고 신뢰할 수 있는 결과 얻을 수 있도록 경고의 수입니다. 대뇌 동맥과 많은 다른 혈관 침대의 저항 동맥 내장 톤 전시, 하는 동안 일부 동맥 (특히 mesenteric 저항 동맥) 해야 norepinephrine 같은 vasoconstrictors와 미리 계약 응답을 평가 하기 위해 vasodilator 자극, 그리고 더 정확 하 게 비보에 조건을 시뮬레이션, 혈관 신경 그리고 체액 vasoconstrictor 자극, 노르 아드레날린 신경 터미널에서 발표 등의 영향을 받고 있다. 따라서, 공부 하는 동맥의 기본 속성을 잘 알고 있어야 하는 것이 중요 하다, 또는 문학에서 신중 하 게 예비 실험을 실시. Endothelium 큰 동맥, 작은 동맥, arterioles microcirculation에 조절에 중요 한 역할을, 때문에 격리 및 동맥의 cannulation endothelium 손상 되지 않도록 주의를 기울 필수적 이다. Endothelium 무결성에 대 한 고전적인 테스트 ACh 배 팽창 하면 데모입니다. 한 경고는, 산화 긴장의 조건 하에서 혈관 내 피 손상, 있을 수 있습니다 하지만 ACh에 vasodilatation는 결 석 초과의 과도 한 수준의 vasodilator 응답을 방지 하는 산화 질소 청소 때문에. 이러한 경우에, 내 피 무결성 ACh 응용 프로그램 응답 ACh 및 다른 endothelium 종속 vasodilator 자극으로 혈관을 복원 해야 하는 tempol와 같은 superoxide 폐품의 존재를 반복 하 여 확인할 수 있습니다. 또한, 다양 한 병 적인 조건에서에서 endothelium 혈관 부드러운 근육 세포의 수축과; 동맥의 수축 시키는 물질을 해제할 수 있습니다. 그리고 경우에 따라 피 종속 팽창 (또는 수축) cyclooxygenase 대사 산물, H2O2, epoxygenase 대사 산물, 등과 같은 다른 물질을 통해 중재 된다. Endothelium 종속 vasodilator 또는 vasoconstrictor 물질에 대 한 고전적인 테스트 팽창 또는 수축의 동맥 내 피 제거에 의해 삭제는 입증 하는. 마지막으로, 다양 한 endothelium 종속 vasodilator 및 vasoconstrictor 물질의 정체성 수 있습니다 일반적으로 될 ascertained 특정 억제제 또는 썩은 고기, 산화 질소 synthase, indomethacin 억제을 억제 하기 위해 L-이름 등의 관리에 의해 cyclooxygenase metabolites의 형성 catalase 청소할 H2O2, thromboxane synthase 억제제, epoxygenase 억제제, 또는 CYP450-4A/20-HETE 통로의 길 항 근.

그것은 또한 중요 한 (유익한) 척도를 액티브의 양을 톤 실험의 끝에 perfusing와 superfusing는 캘리포니아2 +동맥-PSS, 무료 또는 papaverine 같은 강력한 vasodilator 에이전트의 최대 복용량을 관리. 액티브의 전형적인 수준 MCA에 톤을 휴식, ((D최대-D나머지) /D최대)로 계산 된 x 100은 약 40%,최대 D와 D나머지 있는 최대 (캘리포니아2 +-무료 PSS) 직경 (PSS), 휴식 제어 평형 압력 (MCA에 대 한 일반적으로 80 mmHg)에서 각각. 그는 혈관에 외상의 표시로 실질적으로 덜 활성화 톤 나 보여주는 단편 constrictions 또는 dilations 동맥 혈관 분석에서 제외 됩니다. 캘리포니아2 +에서 극대로 동 공이 확장 되어 동맥의 직경의 측정-무료 솔루션 또한 동맥 직경 측정 및 계산 응력-변형 관계 하 여 혈관의 수동 기계적 특성을 평가 하는 조사를 수 극대 동 공이 확장 되어 혈관7,56에서 과거 압력에 입 하 면 순차도 동안 이러한 수동 응력-변형 관계는 쉽게 얻을 하 고 혈관의 기계적 특성 변화에 대 한 귀중 한 표시를 제공 합니다.

펫, 커넥터, 및 튜브 공급 하는 저수지의 청결은 절대적으로 성공적인 실험에 대 한 중요 합니다. 이와 관련, 그것은 실험 완료 되 면, 그리고 린스와 조직 청소 목욕, 배달 배관 및 저장 하는 데 사용 하는 모든 저수지 따뜻한, 가스 equilibrate 배를 도달 하기 전에 PSS 튜브에서 모든 솔루션을 플러시 하는 것이 중요 약 실입니다. Stopcocks 및 전달 시스템에 밸브 해야 청소 수 있으며 어떤 튜브 PSS를 들고 해야 합니다 정기적으로 변경. 오염 된 튜브의 고전적인 표시는 곰 팡 이와 박테리아;에 의해 생성 된 회색 안개 그리고 그 변화 물질 세균 오염에 의해 생산으로 인해 혈관의 정상적인 반응의 손실에 의해 함께. 그러나, 박테리아와 다른 미생물에 의해 오염 여전히 수 있습니다 표시 증거의 부재에.

현재 종이 매우 다른 혈관 침대의 모든 중요 한 작은 저항 동맥의 연구 적합 영광 기술의 사용에 대 한 유용한 예제를 제공 합니다 생각 합니다. 조직 관류, LDF는 GS1 lectin 방법 microvessel 밀도, 평가 등을 평가 하기 위한 표준 방법으로 결합 될 때 cannulated 저항 동맥의 생체 외에서 비디오 현미경 매우 귀중 한 통찰력을 제공 하는 것은 조직의 관류 및 어떻게 이러한 질병 상태에 변경 될 수 있습니다 제어 하는 요인. 표준 쥐 모델에서 내 피 기능과 혈관 평활 근의 기본적인 기계 장치를 공부 하는 강력한 수단을 제공, 뿐만 아니라 개별 저항 동맥 공부 비디오 현미경의 사용 적용할 수 있는 다른 동물 모델을 인간 저항의 동맥 새로운 유전자 조작된 쥐 모델의 절연된 저항 동맥의 비디오 현미경의 응용 프로그램 응답 유전자의 무리 (및 적-성장 목록)의 변경 된 기능으로 발생 하는 phenotypic 변화를 이해 하는 데 새로운 문을 엽니다.

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Disclosures

저자 아무 경쟁 금융 관심사 있다.

Acknowledgments

저자는 그들의 진실한 케이티 핑크와 린 Dondlinger이이 원고 준비에 그들의 귀중 한 도움에 대 한 표현.

보조금 지원: NIH #R21-OD018309; #R56-HL065289; 그리고 #R01-HL128242입니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

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쥐의 고립 된 저항 동맥의 비디오 현미경을 이용 하 여 혈관 제어 메커니즘의 평가
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Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).More

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

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