Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

تقييم آليات مراقبة الأوعية الدموية استخدام الفحص المجهري الفيديو الشرايين المقاومة المعزولة من الفئران

Published: December 5, 2017 doi: 10.3791/56133
Automatic Translation
1, 2, 3, 4, 5, 3, 3
1Department of Physical Therapy, Marquette University, 2Medical College of Wisconsin, 3Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 4Graduate Programs of Nurse Anesthesia, Texas Wesleyan University, 5Office of Research, Medical College of Wisconsin

Summary

ويصف هذه المخطوطة في المختبر بروتوكولات الفحص المجهري الفيديو لتقييم وظيفة الأوعية الدموية في الشرايين الدماغية مقاومة الفئران. ويصف المخطوط أيضا تقنيات لتقييم كثافة ميكروفيسيل مع فلوريسسينتلي المسمى نضح يكتين والأنسجة باستخدام الليزر دوبلر Flowmetry.

Abstract

هذا البروتوكول وصف الاستخدام في المختبر مجهرية التلفزيون لتقييم وظيفة الأوعية الدموية في الشرايين المقاومة الدماغية المعزولة (وغيرها من السفن)، ويصف تقنيات لتقييم نضح الأنسجة باستخدام الليزر دوبلر Flowmetry (LDF ) والمسمى ميكروفيسيل كثافة استخدام فلوريسسينتلي يكتين سيمبليسيفوليا جريفونيا (GS1). الأساليب الحالية لدراسة معزولة الشرايين المقاومة في ترانسمورال الضغوط التي تواجه في فيفو وفي غياب التأثيرات خلية متني بتوفير ارتباط حرجة بين في فيفو الدراسات والمعلومات المكتسبة من جزيئية النهج الاختزالية التي توفر البصيرة محدودة إلى استجابات متكاملة على مستوى الحيوان كله. LDF وتقنيات تحديد الشرايين والشعيرات الدموية بشكل انتقائي مع المسمى فلوريسسينتلي يكتين GS1 تقديم حلول عملية لتمكين المحققين لتوسيع المعرفة المكتسبة من الدراسات للشرايين المقاومة المعزولة. هذا الكتاب يصف تطبيق هذه التقنيات على اكتساب المعرفة الأساسية بالأوعية الدموية علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض في الفئران كنموذج تجريبي عام، وفي مجموعة متنوعة من متخصصة وراثيا سلالات الفئران "مصمم" التي يمكن أن توفر المهم ثاقبة تأثير جينات معينة على هامة تعمل الأوعية الدموية. استخدام هذه النهج التجريبي قيماً في سلالات الفئران وضعتها الوراثي استراتيجيات وتكنولوجيات جديدة لإنتاج نماذج خروج المغلوب الجينات في الفئران، ستوسع صرامة أماكن العلمية المتقدمة في نماذج الماوس خروج المغلوب و توسيع نطاق تلك المعرفة إلى نموذج حيوان أكثر أهمية، مع خلفية الفسيولوجية مفهومة جيدا ومدى ملاءمتها للدراسات الفسيولوجية بسبب حجمه أكبر.

Introduction

الدراسات أقرب وظيفة الأوعية الدموية في الشرايين تستخدم قناة الشرايين، وفي كثير من الحالات الشريان الاورطي. عموما درس توليد القوة في الشرايين الكبيرة عن طريق إرفاق مقطع الدائري الشريان محول قوة في حمام أنسجة؛ وفي حالة الشريان الاورطي، بالقطع الحلزونية شرائط السفينة حيث أن ألياف العضلات الملساء كانت موجهة في اتجاه طولي بين نقطة المرفق ومحول القوة، لتوفير أفضل تقدير للقوة الناتجة عن انكماش العضلات الملساء على طول محورها الطولي. وكان تقنية قياسية لقطع شرائط حلزونية من أورتاس وضع قضيب زجاج في التجويف للسفينة، وجعل قطع في جدار السفينة في زاوية المطلوب، وعلى عقد لنهاية حافة يتعرض الجدار السفينة كما تم تمديد الخفض إنتاج بأكمله قطاع حلزونية من السفينة. عند هذه النقطة، عموما تم مسح الجانب غشائي السفينة لإزالة الحطام قبل إرفاق محول قوة قطاع السفن وغمر التحضير في اﻷوكسيجين، والتحكم في درجة الحرارة حمام الأنسجة. في نهاية المطاف، أن نهج أدى إلى واحدة من الاكتشافات الأكثر شهرة وأهمية في تاريخ علم وظائف الأعضاء فورتشجوت وزاوادسكي1، إلا وهي دور البطانة المستمدة عامل الاسترخاء (EDRF)، حددت بعد ذلك كأكسيد النيتريك، في تنظيم وظيفة الأوعية الدموية. وكان هذا الحدث الحاسمة المؤدية إلى أن اكتشاف حالة التي تحتفظ بطانة سليمة عن طريق تجنب الاتصال الجانب غشائي الشريان مع الأسطح الخارجية المحققين، ولاحظت أن قطاع الابهري لا يحمل المتوقعة تقلص إلى أستيل (ACh)، لكن بدلاً من ذلك استرخاء في الاستجابة لمنظمة العمل ضد الجوع. وبناء على هذه الملاحظة، المحققون البلدان المتقدمة النمو إعداد "ساندويتش" التي يعلقونها جزء الابهر مع بطانة سليمة (ولكن غير قادر على توليد قوة الهوس) إلى شريط حلزوني قياسي من الشريان الاورطي وتحويلها المستحثة منظمة العمل ضد الجوع انكماش في استرخاء.

اثنين تقدما كبيرا في هذا المجال التي تستخدم على نطاق واسع اليوم هي تنمية الاستعدادات لقياس قوة الهوس النشطة في مقاومة صغيرة الشرايين2،3 (مثل تلك الموجودة في مساريق الأمعاء3 ) ومقني المقاومة شريان الأعمال التحضيرية4،،من56. في أحد التقارير الأولى، وصف مولفاني وهالبيرن3 استخدام إعداد أسلاك ميوجراف لدراسة قوة الهوس النشطة في الشرايين المقاومة المعزولة من مساريق الأمعاء عفويا ضغط الدم الفئران (باستفاض) و ضوابط وكي نورموتينسيفي. بعد تطوير نظام ميوجراف الأسلاك، وضعت المقاومة مقني الشريان الاستعدادات للسماح بالدراسات المتعلقة بالسفن أقرب إلى في فيفو الظروف4،،من56.  في حين توفر كلا النهجين نتائج قيمة، إعداد الشريان مقني قد أضيفت مزايا أكثر فعالية الحفاظ على لهجة نشطة مضمنة في الشرايين؛ والسماح للمحققين بدراسة الردود شذوذ النشطة للتغييرات في الردود transmural الضغط والسفينة على التغيرات في معدل التدفق وإجهاد القص غشائي (انظر استعراض هالبيرن وكيلي6).

أحد الأهداف رئيسية لهذه الورقة هو وصف كيفية توظيف تقنية العريقة للفحص المجهري الفيديو استخدام الشرايين المقاومة المعزولة، مقني من أجل الحصول على معلومات دقيقة بشأن الآليات التي تنظم لهجة النشطة في هذه الأهمية السفن، مستقلة عن الخلايا العصبية أو خلطيه أو متني التأثيرات. هذه المعلومات الأساسية، تستخدم نموذج الفئران قياسية وأمثلة من دراساتنا من جديد وراثيا هندسيا سلالات الفئران، وسيتم تزويد القارئ بفكرة عن أنواع الأفكار المتعلقة بوظيفة الأوعية الدموية التي يمكن أن تكتسب بالتلفزيون النهج الفحص المجهري، والتي يمكن استخدامها في الدراسات المتعلقة بأي عنصر تحكم والتجريبية مجموعة (مجموعات) لاختيار المحقق، بما في ذلك نماذج الفئران التجريبية الجديدة القوية التي تنتجها الاستيلاد الانتقائي والمطورة حديثا الوراثية التقنيات الهندسية.

بفضل دقة النهج مجهرية التلفزيون، قياس التغيرات القطر في الشريان مقني التحضيرية يمكن أن توفر معلومات قيمة للغاية فيما يتعلق بالآليات المعتمدة على البطانة والبطانة مستقلة من الأوعية الدموية الاسترخاء، فضلا عن تعديلات هامة (وغير متوقعة في بعض الأحيان) في آليات مراقبة الأوعية الدموية التي تحدث مع ارتفاع ضغط الدم والنظام الغذائي الملح عالية، والتدخلات التجريبية الأخرى. وبالإضافة إلى ذلك، قياس الضغط-قطر علاقات في عزل ومقني الشرايين المقاومة التي أقصى استرخاء بالمعاملة مع Ca2 +-الحرة حل أو دواء وعائي الدوائي، يسمح للمحقق لتقييم التغيرات الهيكلية في الشرايين بسبب إعادة عرض الأوعية الدموية، وحساب العلاقات السلبية الإجهاد-الانفعال7 التي يمكن توفير نظرة ثاقبة التغيرات في الخواص الميكانيكية السلبي للشرايين التي يمكن أن تؤثر على وظيفة الشرايين الهامة مستقلة من (أو بالإضافة إلى) إجراء تغييرات في آليات مراقبة فعالة. من المهم أيضا أن نلاحظ أن المعلومات المكتسبة من الدراسات للشرايين المقاومة معزولة يمكن أن تستكمل بالمعلومات التي تم الحصول عليها من خلال استخدام LDF، طريقة عملية لتقييم نضح الأنسجة في الحيوان كله مستوى8،9 ،10، ومن المعلومات المكتسبة من تقييم ميكروفيسيل كثافة استخدام المسمى فلوريسسينتلي GS1 يكتين، التي تلزم على وجه التحديد إلى بروتين سكري مويتيس في الغشاء الطابق السفلي ل الشرايين والشعيرات الدموية الصغيرة11 , 12-يوفر طريقة الأخيرة وضع تقديرات دقيقة للغاية للكثافة ميكروفيسيل التي لا تخضع لصعوبات الكلاسيكية في تقدير الكثافة ميكروفيسيل عن طريق العد السفن في فيفو، على سبيل المثال في عداد المفقودين غير perfused السفن حيث يتم إيقاف تدفق الدم بسبب الإغلاق النشط للشرايين. عندما تستخدم معا، هذه النهج يمكن أن توفر فكرة هامة للربط بين التعديلات الفنية في الشرايين المقاومة المعزولة للتغييرات في نضح الأنسجة على المستوى ميكروسيركولاتوري؛ وستقدم أيضا بعض الأمثلة على استخدام هذه النهج قيماً بالاقتران مع تقنيات الشريان مقني في المخطوطة الحالية.

تركز هذه الورقة على استخدام تقنيات الفحص المجهري الفيديو لتقييم التغيرات الأوعية الدموية في شرايين فئران سبراغ داولي أووتبريد. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن هذه التقنيات قد أثبتت أن تكون قيمة للغاية في توضيح التعديلات المظهرية في سلالات الفئران المهندسة وراثيا متخصصة للغاية تم إنشاؤها بواسطة الوراثي أو الجيني تحرير باستخدام تقنيات. في هذه المخطوطة، نحن نقدم أمثلة على تقنيات الفحص المجهري الفيديو كيف قدمت معلومات هامة فيما يتعلق بوظيفة الأوعية الدموية في عدد من الفئران قيمة النماذج، بما في ذلك داهل المراعية للملح (SS) سلالة الجرذان، الفئران الفطرية التي الأكثر انتشارا استخدام نموذج تجريبي لدراسة آليات هايبرتينسون الحساسة الملح18،19،20،21،،من2223؛ والجرذان كونسوميك التي تم إنشاؤها عن طريق الانتقاء الوراثي للفئران SS مع سلالة الجرذ البنى النرويج (BN) الملح غير متحسسة. في لوحات فأر كونسوميك، كان كل كروموسوم من الفئران "النرويج براون" إينتروجريسيد على حدة إلى SS داهل24،،من2526 الوراثية الخلفية. استخدام لوحات الفئران كونسوميك قدمت أدلة قيمة فيما يتعلق بالكروموسومات المحددة التي تسهم في حساسية الملح ضغط الدم وغيرها تعمل، بما في ذلك الأوعية الدموية مفاعليه24،25،26 ،،من2728.

استراتيجيات الوراثي باستخدام SS الجرذان والفئران كونسوميك تحمل الفردية BN الكروموسومات مكنت أيضا توليد سلالات كونجينيك ضاقت مع شرائح صغيرة من إينتروجريسيد الكروموسومات "النرويج براون" الفردية إلى SS داهل الوراثية خلفية22،29. وهذه توفر قيمة للغاية الإدخال على جينات محددة أو تضييق المناطق الكروموسومات التي يمكن أن تؤثر على المتغيرات الفسيولوجية حاسمة، مثل ضغط الدم والتلف الكلوي والأوعية الدموية مفاعليه22،29. آخر قوية بالإضافة إلى الأدوات الوراثية الجرذ هو تطوير جينات الفئران خروج المغلوب نماذج استخدام الجينات متقدمة تحرير تقنيات بما في ذلك زفنس، نوكليسيس المنشط--مثل-المستجيب النسخي (تالينس)، وفي الآونة الأخيرة كريسبر Cas913 ،،من1415،،من1617. ظهور هذه التقنيات القوية التي تمكن من الجينات أن خرج في الفئران تطور بالغة أهمية نظراً لدراسات الجينات خروج المغلوب حتى الآن استخدمت (والاستمرار في استخدام) الفئران حصرا تقريبا. عنصر آخر من عناصر تجريبية في هذه الورقة يوضح قيمة تقنيات الشريان مقني والفيديو المجهري لتقييم آليات المراقبة الفسيولوجية في الجرذان خروج المغلوب يفتقر إلى النسخ الحماية المضادة للأكسدة والخلية الرئيسية العوامل، العامل النووي (المستمدة من محمر 2)-مثل-2 (NRF2)30،31، التي تم تطويرها باستخدام التكنولوجيا TALEN في الخلفية الوراثية سبراغ داولي17. في تلك التجارب، واستخدمت في المختبر تقنيات الفحص المجهري الفيديو لتوفير التحقق الوظيفية لفقدان الجينات NRF2 واختبار نهج علاجية يحتمل أن تكون قيمة استناداً إلى أوبريجولاتيون مباشرة من مضادات الأكسدة بوساطة NRF2 الدفاعات. جبهة الخلاص الوطني-2 لها أهمية علاجية كبيرة في مكافحة الأكسدة والأوعية الدموية في البشر، وفي ضوء النتائج المخيبة للآمال للتجارب السريرية التي تشمل الإدارة المباشرة للمواد المضادة للأكسدة مثل فيتامينات ج وه32.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كلية من ولاية ويسكونسن المؤسسية الحيوان الرعاية الطبية استخدام اللجنة (IACUC) ووافق على جميع البروتوكولات المذكورة في هذه الورقة وجميع الإجراءات امتثالا للمعاهد الوطنية للصحة (NIH) مكتب لمختبر الحيوان الرعاية الاجتماعية (أولو) الأنظمة.

1-إعداد قاعة السفينة والحلول

  1. قبل القيام بسلسلة من التجارب، إعداد 2 لتر 20 x تتركز حل الأسهم الملح يتكون من 278 غرام/لتر كلوريد الصوديوم؛ بوكل 14 غرام/لتر؛ 11.52 غرام/لتر مجسو4. 7 ح2س؛ و 9.4 غرام/لتر كاكل2. 2 ح2o. كما تعد 2 ل 20 x المخزون الاحتياطي مركزة تتكون من 80.8 غرام/لتر ناكو3 و 0.4 غرام/لتر يدتا، وتتركز ل 2 س 20 Ca2 +-الحل الأسهم الحرة تتكون من 281.6 غرام/لتر كلوريد الصوديوم؛ بوكل 14 غرام/لتر، والأستاذ 11.52 مجسو4. 7 ح2o.
    ملاحظة: يمكن تخزين 20 × حلول المخزون في الثلاجة حتى الاستخدام.
  2. اليوم من هذه التجربة، إعداد 2 لتر حل الملح الفسيولوجية (PSS) من 20 × حلول الأسهم تتركز على النحو التالي: إضافة 100 مل 20 x مخزون الملح لمل 1,800 للمياه في قارورة Erlenmeyer 2 لتر أو الكأس على طبق يجهز من إثارة. إضافة 100 مل مخزون الاحتياطي x 20 بينما اكويليبراتينج الحل بشكل مستمر مع خليط غازات المحتوية على 21% O2، 5% CO2، تحقيق التوازن بين ن2، وآثاره ذلك مع شريط إثارة مغناطيسية. إضافة 0.28 ز نة2بو4 ببطء بينما رصد الرقم الهيدروجيني؛ ضبط حسب الضرورة للأس الهيدروجيني 7.4 بإضافة قطرات من HCl ن 6 أو 6.5 هيدروكسيد الصوديوم ن الحل من ماصة باستور. بعد مستعدة الوقائي وهو تعديل درجة الحموضة، إضافة غ 1.98 الجلوكوز الوقائي.
    ملاحظة: من المهم أن بطء إضافة نة2بو4 آخر أثناء مراقبة درجة الحموضة الوقائي نظراً لإضافة نة2بو4 إلى حل قلوية (درجة الحموضة > 7.4) يمكن أن تشكل ترسبات فوسفات الكالسيوم، كما ورد ظهور حل غائمة أو ترسبات بيضاء في الجزء السفلي من الحاوية.
    ملاحظة: يتم التشكيل النهائي للوقائي 119 ملم/لتر كلوريد الصوديوم؛ بوكل 4.7 مم/لتر؛ 1.17 ملم/لتر Mg2حتى4؛ كاكل 1.6 ملم/لتر2؛ 1.18 ملم/لتر نة2بو4؛ 24 ملم/لتر ناكو3؛ 0.03 ملم/لتر يدتا؛ والجلوكوز 5.5 ملم/لتر. على الرغم من أن تكوين الوقائي يمكن أن تختلف بين المختبرات، هذا الوصفة مناسبة جداً للحفاظ على لهجة الأوعية الدموية ووظيفة بطانية، والاستجابات لوكلاء فعال في الأوعية في الشرايين المقاومة المعزولة.
  3. لتحديد القطر الأقصى ولتقييم لهجة النشطة في الشريان بإنتاج التمدد الأقصى للسفينة، إعداد 500 مل من Ca2 +-مجاناً PSS بإضافة 25 مل من X Ca 202 +-الحرة الأسهم الملح إلى 450 مل مياه. ، تليها 25 مل 20 x المخزون الاحتياطي في قارورة Erlenmeyer أو الكأس مماثلة الخطوة 1-2 أعلاه. إضافة 0.07 ز نة2بو4 إلى الحل حين رصد وضبط الأس الهيدروجيني للحل. Ca2 +-PSS الحرة إضافة إلى قاعة PSS الخزان والسفينة في نهاية التجربة لتجنب استنفاد Ca2 + مخازن داخل الخلايا التي يمكن أن تؤثر على استجابات السفينة في PSS العادي. لأن Ca2 +-إضافة حل الحرة في نهاية التجربة إلى إنتاج أقصى استرخاء الشرايين، ليس هناك حاجة لإضافة السكر إلى الوقائي.
    ملاحظة: عند إتمام، التشكيل النهائي ل Ca2 +-PSS الحرة 120.6 ملم/لتر كلوريد الصوديوم؛ بوكل 4.7 مم/لتر؛ 1.17 ملم/لتر Mg2حتى4؛ 1.18 ملم/لتر نة2بو4؛ 24 ملم/لتر ناكو3؛ 0 ملم/لتر كاكل2؛ و 0.03 ملم/لتر يدتا.
    ملاحظة: للعديد من الدراسات التي تتطلب أقصى تمدد الشريان، حظر دخول كالسيوم مثل فيراباميل (1 ميكرومتر) و/أو الجهات مانحة أكسيد النيتريك مثل نيتروبروسيدي الصوديوم (10 ميكرون) يمكن إضافة إلى الحل، بالإضافة إلى إزالة Ca2 + من الوقائي.
  4. الحفاظ على بو2، PCO2، ودرجة الحموضة الوقائي باستمرار اكويليبراتينج PSS تتدفق إلى قاعة السفينة في حمام جهاز قياسية المستخدمة لدراسة الحلقات الابهر معزولة أو العضلات الملساء المعوية، أو الأنسجة الأخرى (الشكل 1). استخدام فلوروبوليمير الاصطناعية من أنابيب تترافلورو للاتصال خزان الغاز إلى حمام الجهاز نظراً لهذا النوع من أنابيب الغاز كتيمة، خلافا للعديد من أشكال أخرى من الأنابيب، مثلاً، واللثي.
  5. مكان حجر هواء صغيرة متصلة بخليط الغاز الموازنة في قاعة السفينة للمساعدة في الحفاظ على تكوين الغاز PSS.
    ملاحظة: يمكن اختبار استجابات السفينة إلى تغييرات في ص2 من اكويليبراتينج الوقائي في قاعة السفينة وبيرفوساتي لومينال مع الغاز المزائج المحتوية على نسب مختلفة من س2، مثلاً، 21% O2، 10% س2، 5% O2 ، و 0% O2, مع 5% CO2 والتوازن ن233،،من3435. للشرايين أكبر مع الجدران أكثر سمكا، حيث نشر الأوكسجين في وسط الجدار السفينة قد يكون القيد، يمكن استخدام نسبة مئوية أعلى من الأكسجين، مثلاً، 95% O2 .
  6. رصد درجة الحرارة في قاعة السفينة عن كثب، كما الدوائر الفردية قد تختلف في خصائصها نقل الحرارة.
    ملاحظة: العديد من الدوائر سفينة أعدت تجارياً المستخدمة لإجراء دراسات للمقاومة مقني الشرايين تستخدم مضخة تمعجية لتقديم PSS اﻷوكسيجين من خزان غاز اكويليبراتيد وتوفير مراقبة دقيقة جداً لدرجة حرارة الحمام والأوكسجين من PSS.
  7. ضع الوقائي في زجاجة Mariotte (2 لتر) كبير، بسداده وأنبوب الزجاج المركزية ليكون بمثابة مستودع لتسليم PSS بشكل مستمر في الحمام الجهاز مع ارتفاع درجات الحرارة والغاز اكويليبراتيس PSS تتدفق إلى قاعة السفينة (الشكل 1A).
  8. مكان افتتاح أنبوب الزجاج المركزية في زجاجة Mariotte في نفس مستوى الأعلى من PSS في الحمام الجهاز، للحفاظ على رأس ضغط الهيدروستاتيكي مستمر لإيصال PSS في الحمام الجهاز. استخدام أنابيب البولي إيثيلين متصلاً بالزجاج على شكل J أو أنبوب بلاستيكي لتسليم الوقائي من زجاجة Mariotte في الحمام الجهاز.
  9. لنضح لومينال (الشكل 1A)، استخدام أنابيب البولي إيثيلين للاتصال ماصة تدفق خزان PSS تتألف من 60 cc المحاقن البلاستيكية مرتفعة إلى موضع الذي يحافظ على ضغط التدفق المطلوب (عادة 80 مم زئبق لدراسات الفئران الدماغي محول الشرايين)، كما يقاس ضغط متصلاً بالنظام عن طريق محبس الحنفية.
  10. الاتصال ماصة تدفق أنبوب بولي إيثيلين للسماح PSS تتدفق من خلال السفينة في استجابة لضغط تدرج، وقم بتوصيل خط تدفق مستودعا مماثلة أن الخزان تدفق. استخدام اتصال محول طاقة محبس الحنفية وضغوط مماثلة لقياس ضغط تدفق.
    ملاحظة: إجراءات لتعيين الضغط ترانسمورال، والتحكم في التدفق من خلال السفينة يرد في الباب 2، أدناه.
  11. في نهاية التجربة، شطف جيدا في الدائرة، وخطوط التسليم، ونظم الخزان بالماء المقطر. على فترات متكررة، استبدال خطوط الأنابيب والتسليم، نظيفة أو محل في ستوبكوكس في النظام، ورهنا بأي الخزانات PSS الزجاج دورياً غسيل الحمضي لمنع نمو البكتيريا والكائنات الدقيقة الأخرى التي تتسبب في تلوث و تؤثر مفاعليه السفينة.

2-إعداد الشريان مقني

  1. تخدير الفئران سبراغ داولي مع إيسوفلوراني 5% والمحافظة على التخدير استخدام 1.5-2.5% الصف الطبي الأوكسجين36. وبدلاً من ذلك، إدارة حقنه عضليا تتضمن الكيتامين (75.0 مغ/كغ) و acepromazine (2.5 مغ/كغ) وإكسيلازيني (10.0 مغ/كغ)؛ حقن داخل بينتوباربيتال (50-60 مغ/كغ)؛ أو أي طريقة أخرى معتمدة للتخدير، اعتماداً على البروتوكولات و/أو تفضيلات المحقق.
  2. قطع رأس الفئران تحت التخدير العميق وإزالة الدماغ لإجراء دراسات للشرايين الدماغية المقاومة.
  3. بعد إزالة الدماغ، عزل بعناية الشريان الدماغي الأوسط (MCA) (أو الشرايين الأخرى من اهتمام، مثلاً، باسيلار الشريان أو الشريان الدماغي الخلفي)37،38. لعزل في MCAs، وضع الدماغ ضعيف في طبق بتري زجاج مليئة PSS المثلج (الشكل 2).
  4. استخدام Vannas المقص وملقط تلميح جيد دومون #5 للمكوس MCA من الدماغ.  تنظيف أي أنسجة المخ المتبقية من اتحاد الماليزيين الصينيين استخدام الملقط ونقل الشريان إلى دائرة سفينة التي تسيطر عليها درجة حرارة التي تتضمن PSS كما هو موضح سابقا. 33 , 34  .
  5. نقل الشريان إلى قاعة السفينة، اضغط برفق السفينة قصت هيئة مكافحة الفساد أو الجزء الخلفي من شريان التواصل ووضعه بعناية في الدائرة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى اتحاد الماليزيين الصينيين، نظام السفينة مقني مناسبة لمجموعة واسعة من الأعمال التحضيرية السفن الصغيرة، بما في ذلك الهيكل العظمى والعضلات المقاومة الشرايين33،،من3940، الشرايين المقاومة المساريقي العلوي 38 , 41 , 42، والكبيرة (الدرجة الأولى) الشرايين العضلات cremaster43، فضلا عن البشرية الشرايين التاجية والشرايين البشرية التي تم الحصول عليها من الأنسجة الدهنية تحت الجلد من خلال خزعة الوي44،45، ،من 4647.
  6. إرفاق الشريان ميكروبيبيتي تدفق بسحب نحو قاعدة ماصة حتى التلميح السلف في التجويف هيئة مكافحة الاحتكارات. تأمين الشريان على ماصة تدفق بربط حلقة المعدة من ألياف حبلا واحد مثار سابقا من خيوط 10-0 حول الشريان (الشكل 1B). تأمين على الطرف الآخر من هيئة مكافحة الاحتكارات إلى ماصة التدفق بتشديد حلقة خياطة ثانية حول السفينة (الشكل 1B).
    ملاحظة: وضع الحلقات خياطة في ميكروبيبيتيس قبل تركيب السفينة ووضعها قريبة من النقطة النهائية للمرفق، والسماح لهم بأن تراجع بسهولة عبر الشريان وتأمينها بسرعة عندما تكون السفينة في الموقف، مما يقلل من الخطر الشريان انزلاق قبالة الماصات.
    ملاحظة: تعد ميكروبيبيتيس من زجاج البورسليكات الأنابيب الشعرية (القطر الخارجي 2 مم؛ طولها 10 سم والقطر الداخلي 1 مم) استخدام ساحبة ميكروبيبيتي رأسية. قبل ربط الشريان، تتطابق مع أقطار نصيحة من ميكروبيبيتيس قدر الإمكان لمنع حالات عدم التطابق لمقاومة تدفق وتدفق في نظام التروية.
  7. بعد الشريان يرتبط بشكل أمن ميكروبيبيتيس، استخدام ميكرومتر متصلاً بصاحب ماصة تدفق لتمدد الشريان إلى طوله في الموقع .
  8. التعادل قبالة كل جانب فروع مع خيوط واحد مثار من خيوط 10-0 بغية الحفاظ على ضغط ثابت في الشريان.
  9. تحقق من عدم وجود تسربات بالتأكد من أن الضغط intraluminal (ترانسمورال) الذي يظل ثابتاً بعد إغلاق مؤقت ماصة تدفق. التعادل خارج أي فروع أو التحقق من وجود ثقوب في السفينة إذا كان يقع الضغط. استعادة التروية بعد التحقق من أن الضغط ترانسمورال لا تزال مستمرة.
    ملاحظة: يتطلب Cannulation الشرايين المقاومة المعزولة البراعة اليدوية والممارسة. هي الاحتياطات الرئيسية التي ينبغي مراعاتها لتجنب كسر الماصات والتأكد من أن الشريان الشريحة لا إيقاف الماصات. من المهم أن يكون لطيف مع الشرايين معزولة طوال الإجراءات بأكملها، كالصدمة للسفينة يمكن أن تتلف البطانة و/أو تتداخل مع وظيفة طبيعية للعضلات الملساء والأوعية الدموية.
  10. قياس القطر الداخلي من الشريان استخدام برنامج إعداد فيديو مجهرية (الشكل 1A) تتكون من كاميرا الفيديو المرفقة مجهر تشريح ومتصلا الفيديو ميكرومتر وشاشة التلفزيون (1B الأرقام، ج 1). وهذا يسمح للمراقب لقياس أقطار السفينة يدوياً عن طريق وضع خطوط الإشارة المنقولة على الجدار الداخلي للشريان، وإذا كان المطلوب، على الجدار الخارجي للشريان كذلك، من أجل قياس سمك الجدار السفينة.
    ملاحظة: تقدم بعض ميكرومتر الفيديو التعقب التلقائي لإبعاد السفينة.
    ملاحظة: معايرة ميكرومتر الفيديو مع ميكرومتر مرحلة مجهر والتدفق وتدفق محولات الضغط مع لكنها الزئبق (ملم زئبق 0، 50 مم زئبق، 100 ملم زئبق، 150 مم زئبق، و 200 ملم زئبق) بين التجارب من أجل ضمان قياسات دقيقة سفينة القطر وإينترالومينال والضغط.
    ملاحظة: الضغط transmural التحكم القياسية لتجارب MCA الجرذ 80 مم زئبق. معايرة للضغط العالي وانخفاض مستويات يؤكد دقة الدراسات شذوذ استجابة للتغيرات في ترانسمورال منحنيات قطرها الضغط الضغط الإيجابي والسلبي في الشرايين المتوسعة بشكل أقصى.
  11. ضبط ارتفاع الخزانات تدفق وتدفق للمحافظة على الضغط المطلوب transmural عند مستوى ثابت. رفع الخزان تدفق بكمية صغيرة (< 5 مم زئبق) وخفض الخزان إلى الخارج بنفس المقدار يحافظ على الضغط يعني ترانسمورال ويخلق تدفق التروية في التجويف السفينة6.
    ملاحظة: رفع الخزان تدفق وخفض الخزان إلى الخارج بكميات متساوية تحتفظ transmural يعني نفس التمددي الضغط في الشريان، ولكن يقوم بإنشاء تدرج ضغط الهيدروليكي الذي يسبب تدفق وإجهاد القص في السفينة، والسماح محقق لتقييم استجابات تعتمد على البطانة إلى تغييرات في إجهاد القص إينترالومينال في مجموعات تجريبية مختلفة48.
  12. تقييم شذوذ الردود والاستجابات السفينة للمنبهات وعائي، تأكد من أن يسلك الشريان مستوى مناسب من لهجة النشطة (حوالي 40%) قبل التجربة. تجاهل أي الشرايين تفتقر إلى نغمة نشطة في بقية استثناء السفن، مثلاً، الشرايين المساريقي العلوي الصغيرة التي لا تظهر عادة لهجة يستريح النشطة.
    ملاحظة: للسفن التي لا تظهر عادة لهجة عفوية، مسبقاً على انقباض الشرايين بمبلغ يعادل استخدام مؤثر مضيق للأوعية مثل إفراز أو phenylephrine. نهج جيد لاختيار جرعة مؤثر المستخدمة إلى ما قبل انقباض الشريان استخدام جرعة50 EC عامل مضيق للأوعية، مثلاً، إفراز41،42. بيد ينبغي أن لا تطبق وكلاء مضيق للأوعية الدوائية للشرايين الذي يحمل لهجة النشطة عفوية تحت يستريح الظروف.
  13. اختبار تفاعلية تعتمد على بطانة الشريان المقاومة مقني بقياس أقطار السفينة أثناء إضافة التركيزات المتزايدة لمنظمة العمل ضد الجوع (10-10 M-10-5 م) إلى قاعة السفينة. اختبار أكسيد النيتريك مستقلة البطانة حساسية العضلات الملساء والأوعية الدموية بقياس أقطار السفينة أثناء إضافة زيادة تركيزات nitroprusside الصوديوم المانحة أكسيد النيتريك إلى (10-10 M-10-5 م) قاعة السفينة.
    ملاحظة: يمكن اختبار حساسية لوكلاء مضيق للأوعية وغيرها يضع وعائي بطريقة مماثلة عن طريق إضافة التركيزات المتزايدة لمؤثر إلى قاعة السفينة.
    ملاحظة: بالإضافة إلى وكلاء فعال في الأوعية، مختلف العقاقير ومثبطات أخرى وكلاء الدوائية يمكن إضافة إلى حمام الأنسجة و/أو بيرفوساتي لومينال. التغييرات في ص2 (فضلا عن PCO2 ودرجة الحموضة) يمكن بشكل انتقائي يديره إلى الجانب بطانية أو الجانب إضافية لومينال الشريان الموازنة منفصلة من بيرفوساتي لومينال مع حجر هواء متصلاً بخليط غاز معايرة مختلفة من خليط يستخدم لحجته PSS في الأنسجة حمام33،،من3449. يمكن دراسة الردود شذوذ للتغيرات في الضغط transmural بإغلاق الماصة إلى الخارج ورفع (أو خفض) ارتفاع الخزان PSS متصلاً تدفق ماصة49،،من5051 إلى زيادة أو تقليل الضغط إينترالومينال.
  14. لاختبار دور البطانة في التوسط للسفينة الاستجابات لمنبهات محددة، إزالة البطانة الوعائية ومقارنة الاستجابات السفينة لهذه المنبهات في وجود أو عدم وجود البطانة. لإزالة البطانة، بعناية عدم تقييد الشريان من ماصة تدفق ونتخلل التجويف الشريان مع بولس هواء ببطء (0.5-1.0 مل). بعد نضح الهواء، استعادة التروية PSS لمسح الحطام الخلوية قبل إعادة ربط السفينة إلى ماصة تدفق43.
    ملاحظة: تبعاً لهذا الإجراء تعرية بطانية، من المهم التحقق من أن يتم إزالة البطانة بواسطة اختبار استجابات الأوعية الدموية لمؤثر (عادة ما تكون منظمة العمل ضد الجوع) المعروفة لإنتاج البطانة توسع الأوعية تعتمد في هذا النوع من السفن. ومع ذلك، تصدر في ظروف مرضية معينة، تعتمد على البطانة vasoconstrictors، في هذه الحالة، فإنه من المهم التحقق من هو القضاء على الاستجابة العاصرة بعد إزالة غشائي.
  15. في نهاية التجربة، تحديد القطر الأقصى الشريان بإضافة Ca2 +-الحرة PSS بيرفوساتي وسوبيرفوساتي. حساب لهجة يستريح النشطة (%) كما ((دماكس-دبقية) &/Dماكس) × 100، حيث دماكس هو القطر الأقصى حضور Ca2 +-مجاناً د والحل هوبقية القطر التحكم يستريح.
    ملاحظة: قياسات القطر من أقصى استرخاء الشرايين في مختلف المجموعات التجريبية قيمة في مقارنة لهجة يستريح النشطة ويعيد البناء الهيكلي (أيتغييرات في قطر التجويف وسمك الجدار)، والخصائص الميكانيكية السلبي (حساب علاقات الإجهاد-الانفعال من أقطار السلبي على مستويات مختلفة من الضغط ترانسمورال).

3-تقييم الاستجابات تدفق الدم الدماغي مع LDF

  1. تخدير الحيوان مع إيسوفلوراني 5% وتأمين الفئران في جهاز ستيريوتاكسيك9،10.
  2. الحفاظ على هذا الحيوان تحت التخدير المستمر مع رصد وتيرة التنفس ونهاية المد CO2وعمق التخدير مع رشة تو36.
  3. عناية رقيقة الجمجمة إلى الشفافية باستخدام حفر الأسنان منخفضة السرعة والزيوت المعدنية لتوفير اقتران بصري10. توخي الحذر لتجنب توليد الحرارة المفرطة وتجنب اختراق العظم.
    ملاحظة: ترقق الجمجمة يسمح ضوء الليزر للوصول إلى الأنسجة الكامنة، ويجب أن ينعكس مرة أخرى للتحقيق من أجل قياس التحول دوبلر، ضخامة الذي يتحدد بعدد جسيمات تتحرك (أي، خلايا الدم الحمراء) و سرعة.
  4. تأمين التحقيق LDF في ميكرومانيبولاتور ووضعه مباشرة فوق منطقة ضعفت الجمجمة. أثناء التجربة، من المهم جداً منع حركة المسبار LDF أو إعداد نفسها، كما LDF مصمم لقياس التدفق في المنطقة المحظورة واحد من الأنسجة وهي حساسة للغاية للتحف الحركة.
    ملاحظة: سوف تقدم أي حركة للتحقيق بعيداً عن موقفها المبدئي تقديراً لتدفق الدم في منطقة مختلفة من الأنسجة، النافية للمقارنات. بينما لا يوفر القيم المطلقة تدفق LDF وليست مناسبة للمقارنة بين الموضوعات، وسيلة ممتازة لتقييم التغييرات في نضح الأنسجة استجابة للتدخلات التجريبية في كل موضوع على حدة؛ نونينفاسيفيلي ويمكن كان متوسط التغيرات النسبية في إشارة LDF من قيم عنصر التحكم ومقارنة بالتغيرات في إشارة LDF من التحكم في المجموعات التجريبية الأخرى.
    ملاحظة: LDF نهج مناسب للتبصر في العوامل التي تنظم تدفق الدم على مستوى السرير كله والأوعية الدموية في مختلف المجموعات التجريبية8،،من910. تقييم نضح الأنسجة مع LDF يوفر نهجاً عمليا لاستيعاب المعرفة المكتسبة من خلال الدراسات سفينة معزولة في منظور سرير كله. وفيما عدا الاختلافات الإقليمية في آليات مراقبة الأوعية الدموية بين مقاومة الشرايين ودوران الأوعية الدقيقة، توفير القياسات التي تم الحصول عليها مع LDF مؤشرا جيدا لمراقبة تدفق الدم الأنسجة ينسجم عموما مع النتائج التي تم الحصول عليها مع الاستعدادات الشريان مقني.

4-تقييم كثافة الهيكل العظمى والعضلات ميكروفيسيل مع يكتين GS1

  1. إزالة العضلات كريماستير من الفئران ذكور بقطع الصفن مفتوحة مع المقص الجراحي غرامة قياسية ومن ثم استخدام ملقط دومون #5 اغتنام العضلات.
    ملاحظة: عضلات رقيقة (مثلاً، عضلة كريماستير، كذلك الباسطة أصابع طويلة والظنبوبي الأمامي العضلات التي تم العثور عليها في الفئران الذكور والإناث على حد سواء) هي مناسبة بشكل مثالي للاستخدام مع كل تصاعد للدراسات يكتين، على الرغم من غذائها يمكن استخدام المقاطع للأنسجة أكثر سمكا.
  2. إزالة العضلات كريماستير من الخصية باستخدام قطع واحد. ضعه في PSS المثلج ويعلقون عليها في طبق بتري مع بطانة سيليكون الاستومر أسفل داخل السطح. بلطف ندف النسيج الضام بعيداً باستخدام الملقط دومون #5.
  3. شطف عينات العضلات مع 2 مل PSS مخزنة بشكل مؤقت وثم تزج لهم في يكتين GS1 والرودامين المسمى (20 ميكروغرام/مل PSS) لمدة 50 دقيقة في صفيحة ثقافة خلية 12-جيدا مع 2 مل/أيضا أن ملفوفة في رقائق الألومنيوم لاستبعاد الضوء.
  4. إزالة الأنسجة من الحل يكتين وشطف لهم ثلاث مرات في PSS مع إينكوباتيونس "غسل" 5 دقائق على الروك وجبل لهم على شرائح المجهر. تأكد من احتضان الأنسجة في الظلام وتخزين الشرائح في الظلام لمنع الخسائر في الأسفار.
    ملاحظة: إذا كان لا يمكن استخدام الشرائح فورا، يمكن أن يوضع في الثلاجة مع أي فقدان للأسفار. لتخزين طويلة، يمكن الاحتفاظ بالشرائح في ثلاجة لمنع تدهور11.
  5. تقييم كثافة ميكروفيسيل بإحصاء عدد تقاطعات ميكروفيسيلس المسمى مع خطوط شبكة حاسوبية فرضه على صورة52، أو بمسح شبكة تراكب فرضه على جهاز العرض المستخدمة لعرض الشرائح.
    ملاحظة: استخدمت GS1 يكتين النهج تثبت: المستحثة بالملح المطروح microvascular53، تأثير وقائي لمنع الملح الناجم عن قمع الثاني انجيوتنسين في استعادة كثافة ميكروفيسيل في الملح تغذية الحيوانات17 ،،من5354؛ دور NRF2 التوسط لتأثير وقائي من الجرعات المنخفضة انجيوتنسين الثاني التسريب لمنع الاستنفاد ميكروفيسيل في17من الفئران التي تغذيها الملح؛ وأيضا لتقييم دور انجيوتنسين الثاني في الحفاظ على استجابات الأوعية لتنشيط العضلات المزمنة في الملح تغذية الفئران54،55. ميزة واحدة من الأسلوب يكتين GS1 أنه يمكن استخدامه لتقييم كثافة ميكروفيسيل في الحيوانات نفسها المستخدمة لإجراء دراسات للشرايين المقاومة مقني أو LDF.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

في المختبر الفحص المجهري للشرايين المقاومة مقني يسمح لدراسة العوامل المؤثرة على لهجة النشطة في الشرايين مقاومة صغيرة (والشرايين أكبر) في العادي في فيفو الضغوط ترانسمورال وفي حالة عدم وجود خلية متني التأثيرات. وبالإضافة إلى تقييم مفاعليه من السفن إلى مختلف المحفزات وعائي ومضيق للأوعية وشذوذ الاستجابات لارتفاع الضغط ترانسمورال في PSS العادي، Ca2 +-PSS الحرة يمكن أن تضاف إلى بيرفوساتي وسوبيرفوساتي في النهاية هذه التجربة لتحديد سمك الجدار وقطرها الأقصى السفينة. القياسات الأخيرة قيمة للغاية في تقييم إعادة عرض الأوعية الدموية، أيالتغيرات في نسبة الجدار/التجويف التي قد تحدث في استجابة للتغيرات في ضغط الدم أو الإدارة من وكلاء الدوائية. قياسات لقطر الأوعية المتوسعة أقصى في Ca2 +-PSS الحرة مفيدة لحساب لهجة الأصيلة ك ((دماكس-دبقية) &/Dماكس) × 100، دماكس ومدبقية فيها الحد الأقصى (Ca2 +- مجاناً PSS) ويستريح القطر (PSS)، على التوالي، في مراقبة الموازنة الضغط (عادة لاتحاد الماليزيين الصينيين 80 مم زئبق). في تجربتنا، لهجة النشطة في هيئة مكافحة الاحتكارات متوسط حوالي 40% عند ضغط ترانسمورال من 80 مم زئبق. قياس قطر الشرايين المتوسعة أقصى أيضا وسيلة عملية لتقييم الخصائص الميكانيكية السلبي للسفن بقياس القطر الشرايين transmural التمددي الضغط واستخدام النتائج للمستويات المختلفة حساب علاقات الإجهاد-الانفعال وسائر الخواص الميكانيكية لل7،سفن56.

الرقم 3 تمثيل تخطيطي لثلاث سلالات كونجينيك ضاقت المستمدة من الفئران SS.13BN استخدام نهوج إضافية الوراثي. في هذه السلالات الفئران، تشمل أجزاء كروموسومية أما اليل إنزيم الرينين "النرويج براون" (Ren1--الجبهة الوطنية) أو يتم قطع عادل أعلاه (Ren1-وزارة الصحة) أو مجرد أدناه (Ren1-تضمين أحادي الجانب) موضع الجينات إنزيم الرينين (وبالتالي الإبقاء على اليل إنزيم الرينين SS). أن دراسة29، الجزء صبغية تحتوي على اليل إنزيم الرينين "النرويج براون" الجينات فقط 25.

ويبين الشكل 4 الرد على وعائي البطانة تعتمد منظمة العمل ضد الجوع (1 ميكرومتر) في MCAs معزولة من الفئران SS داهل الذكور والثلاثة ضاقت سلالات كونجينيك هو مبين في الشكل 3. الجمع بين استخدام هذه ثلاث سلالات من كونجينيك التي تشمل (Ren1--الجبهة الوطنية) أو يتم اقتطاع فقط أعلاه (Ren1-وزارة الصحة) أو أدناه الجينات (Ren1-تضمين أحادي الجانب) إنزيم الرينين محدودة منطقة الفائدة (أي، المنطقة المحيطة بموضع الجينات إنزيم الرينين) للجينات حوالي 25. في تلك التجارب، والحيوانات نورموتينسيفي وتغذية ملح منخفضة (0.4% كلوريد الصوديوم) النظام الغذائي. في أن تمدد البطانة تعتمد على29 دراسة لمنظمة العمل ضد الجوع وكان غائبا في السلالة الأبوية SS وكلا سلالات كونجينيك استبقاء اليل إنزيم الرينين SS، ولكن أعيدت في سلالة كونجينيك تحمل اليل إنزيم الرينين BN في الخلفية الوراثية SS. نتائج هذه الدراسة تؤيد نتائج دراسات سابقة استخدام SS.13BN كونسوميك الفئران57،58 وقدمت أدلة قوية على أن الخلل غشائي موجود في الفئران SS، حتى عندما تكون نورموتينسيفي و تغذية نظام غذائي منخفض ملح. اتخذت معا، ونتائج تلك الدراسات29،،من5758 دعم الفرضية القائلة بأن الخلل غشائي في الفئران SS سبب ضعف تنظيم الجينات إنزيم الرينين، أسفر عن التعرض المزمن لانخفاض مستويات انجيوتنسين الثاني في الدم.

آخر دراسة59، الملخصة في الشكل 5، مقابل الاستجابة وعائي البطانة تعتمد منظمة العمل ضد الجوع في MCAs معزولة (MCA) من الذكور SS داهل الجرذان والفئران كونسوميك SS.5BN تحمل كروموسوم 5 (التي تحتوي على جينات "النرويج براون" لمختلف isoforms السيتوكروم P450-4A ω-hydroxylase). في تلك الدراسة، تم تغذية الحيوانات أما ملح منخفضة (0.4% كلوريد الصوديوم) أو الملح عالية (4 ٪ كلوريد الصوديوم) النظام الغذائي. على النقيض من هيئة مكافحة الاحتكارات من الفئران SS، أبقى MCA تمدد البطانة التابعة لمنظمة العمل ضد الجوع من الفئران كونسوميك SS.5BN تغذت منخفض الملح. وبالإضافة إلى ذلك، (وعلى النقيض من النتائج من SS.13BN كونسوميك الفئران57،58، سبراغ داولي الفئران33،39،،من4060، والهامستر الذهبي 61)، وفشل نظام غذائي ملح عالية للقضاء على التمدد الناجم عن منظمة العمل ضد الجوع في الفئران SS.5الجبهة الوطنية ، مشيراً إلى أن CYP450-4A ω-hydroxylase وحمض هيدروكسييكوساتيتراينويك 20 (20-HETE) المساهمين المهمين لإجهاد الأكسدة الأوعية الدموية وبطانية خلل في الفئران SS وخلال المرتفعات في تناول الملح الغذائية في السلالات الأخرى. من منظور تجريبي، فشل النظام الغذائي الملح عالية للقضاء على تمدد البطانة التابعة لمنظمة العمل ضد الجوع مثالاً عن كيفية الدراسات الشرايين مقني المقاومة يمكن أن تنتج نتائج غير متوقعة التي تخرج من الحكمة التقليدية و يمكن أن يؤدي إلى فهم جديد لآليات التحكم المعقدة التي تؤثر على وظيفة هذه السفن حاسمة.

ويبين الشكل 6 رد منعزلة MCA لمنظمة العمل ضد الجوع (1 ميكرومتر) تغذية الفئران بالضربة القاضية في نوع البرية و Nrf2(-/-) نظام غذائي منخفض ملح (0.4% كلوريد الصوديوم)، وارتفاع الملح في النظام الغذائي (4 ٪ كلوريد الصوديوم)، أو اتباع نظام غذائي ملح عالية التي تتضمن معروفة NRF2 منشط30،62 . نظراً لغياب الملح الناجم عن الأكسدة، كان تمدد المستحثة منظمة العمل ضد الجوع مماثلة في اتحاد الماليزيين الصينيين من نوع البرية والفئران بالضربة القاضية Nrf2(-/-) . وتمشيا مع نتائج دراسات سابقة للفئران سبراغ داولي، النظام الغذائي الملح عالية القضاء تمدد المستحثة منظمة العمل ضد الجوع في نوع البرية والفئران بالضربة القاضية Nrf2(-/-) . إضافة محفز NRF2 إلى النظام الغذائي الملح عالية استعادة تمدد البطانة تعتمد على منظمة العمل ضد الجوع في الفئران نوع البرية، ولكن ليس في الفئران Nrf2(-/-) ، مما يدل على نجاح القضاء Nrf2 الجينات في الفئران بالضربة القاضية، ودعم استخدام NRF2 حتى المنظمين كنهج علاجية للتخفيف من الإجهاد التأكسدي والأوعية الدموية.

الشكل 7 يلخص نتائج القياسات LDF مقارنة استجابات بيل دوران الأوعية الدقيقة لإجراء تخفيضات تدريجية في ضغط الدم الشرياني الدم المتعاقبة حجم الانسحابات في الفئران سبراغ داولي الإبقاء على أي التي تنتجها ملح عادي (0.4% كلوريد الصوديوم) النظام الغذائي أو ملح عالية (4 ٪ كلوريد الصوديوم) نظام غذائي لمدة أربعة أسابيع. على عكس الفئران التي تغذي نظام غذائي منخفض ملح، تغذية الفئران المعرض الغذائي الملح عالية ضعف قدرة على الحفاظ على تدفق دم مستمر خلال التخفيضات في ضغط التروية، تشير إلى أن الآليات المسؤولة عن تدفق الدم الدماغي autoregulation للخطر بالتعرض طويل الأجل لنظام غذائي ملح عالية. نتائج هذه التجارب وتتسق مع وجود آليات البصر استرخاء الأوعية الدموية في الشرايين الدماغية المعزولة من الفئران التي تغذيها الملح60 ويقدم مثالاً جيدا لكيفية قياسات LDF يمكن أن تستخدم لدعم وتوسيع النتائج التي توصلت إليها الدراسات التي توظف الشرايين المقاومة المعزولة إلى مستوى السرير كله والأوعية الدموية.

بالإضافة إلى تقييم الدالة الشريان مقاومة استخدام الشرايين معزولة ونضح الأنسجة باستخدام الليزر دوبلر flowmetry وكثافة ميكروفيسيل واستجابات الأوعية للمنبهات المختلفة مثل العضلات المزمنة التحفيز54، ويمكن تقييم 55 في الحيوانات نفس استخدام المسمى فلوريسسينتلي يكتين GS1، الذي يربط بشكل انتقائي على بروتين سكري مويتيس في الغشاء الطابق السفلي للشرايين والشعيرات الدموية. يبين الشكل 8 يكتين نموذجي تلطيخ في عضلة كريماستير من الفئران سبراغ داولي بنك الاحتياطي الفيدرالي نظام غذائي منخفض الملح أو النظام الغذائي الملح عالية لمدة أسبوعين (ملاحظة انخفاض كثافة ميكروفيسيلس في الفئران تغذية الملح عالية). الكثافة ميكروفيسيل يقيم عن طريق عد التقاطعات المسمى يكتين ميكروفيسيلس مع شبكة حاسوبية مرجعية52، ويوفر وسيلة ممتازة لتقييم الأوعية الردود54،55 أو إلى الكشف والتحديد الكمي للخسائر في ميكروفيسيلس في ظروف مثل ارتفاع ضغط الدم وارتفاع المدخول الغذائي الملح12،،من1753.

Figure 1
رقم 1: في المختبر مجهرية الفيديو الإعداد المستخدمة لدراسة الشرايين المقاومة المعزولة، مقني (A). الشريان مقني المقاومة مرتبطة بالزجاج ميكروبيبيتيس (ب) وعرض الفيديو ميكرومتر عرض قياس قطر التجويف في الشريان المقاومة مقني (ج). شريط مقياس في "الفريق ب" يمثل القطر الداخلي للشريان مقني (ميكرومتر)، وهو 125 ميكرومتر في "ج لوحة" عرض الفيديو للمسافة بين الأسطر الإشارة المنقولة وضعه يدوياً على الجدران الداخلية للشريان بواسطة المراقب إجراء التجربة . الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: رسم تخطيطي لإجراءات عزل الشريان الدماغي الأوسط من الدماغ وإعدادها كانوليشن ميكروبيبيتيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: رسم تخطيطي لسلالات الفئران كونجينيك ضاقت وجود شرائح صغيرة من "النرويج براون" كروموسوم 13 إينتروجريسيد في الخلفية الوراثية حساسة الملح داهل. أجزاء كروموسومية أما الوارد اليل إنزيم الرينين "النرويج براون" (Ren1--الجبهة الوطنية) أو يتم اقتطاع فقط أعلاه (Ren1-وزارة الصحة) أو أقل (Ren1-تضمين أحادي الجانب) موضع الجينات إنزيم الرينين وهكذا يحتفظ اليل إنزيم الرينين SS. وقد تم تعديل هذا الرقم وطبعها من دوراند et al. 29 بإذن من "الجمعية الفسيولوجية الأمريكية". الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
4 الرقم: رد معزولة، مقني MCAs SS الفئران وسلالات الفئران كونجينيك (كما هو موضح في الشكل 2) إلى أستيل 1 ميكرومتر. البيانات يتم التعبير عنها كالقطر يعني التغيير (Δ ميكرومتر) ±SEM من يستريح القطر التحكم قبل أستيل، وهي ريبلوتيد من دراسة الأصلية واسطة دوراند et al. 29 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
5 الرقم: استجابة معزولة، مقني MCAs SS الجرذان والفئران SS.5BN كونسوميك إلى أستيل 1 ميكرومتر في الحيوانات تغذية منخفضة الملح (0.4% كلوريد الصوديوم) أو الملح عالية (4 ٪ كلوريد الصوديوم) النظام الغذائي. البيانات يتم التعبير عنها كالقطر يعني التغيير (Δ ميكرومتر) ±SEM من يستريح القطر التحكم قبل أستيل، وهي ريبلوتيد من دراسة الأصلي من لوكاسزيفيتش et al. 64 الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
رقم 6: استجابة إلى أستيل 1 ميكرومتر في MCAs معزولة، مقني الفئران خروج المغلوب Nrf2(--/--) ويتحكم نوع البرية تغذت منخفضة الملح (0.4% كلوريد الصوديوم)، وارتفاع الملح في النظام الغذائي (4 ٪ كلوريد الصوديوم)، أو النظام الغذائي الملح العالية التي تتضمن معروفة NRF2 منشط30، 62. يتم التعبير عن البيانات كالقطر يعني التغيير (Δ ميكرومتر) ±SEM من يستريح القطر التحكم قبل أستيل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 7
7 الرقم: تدفق الدم الدماغي يقيمها LDF في دوران الأوعية الدقيقة بيل. أظهرت الفئران سبراغ داولي الإبقاء على نظام غذائي ملح عالية لمدة أربعة أسابيع ضعف كبير في قدرتها على الحفاظ على تدفق الدم ثابت كما تم تخفيض ضغط الدم الشرياني ردا على سحب حجم الدم المتتالية. يتم رسم البيانات يعني بالمئة من ±SEM التحكم * p < 0.05 مقابل نظام غذائي منخفض الملح في نفسه يعني الضغط الشرياني. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 8
8 الرقم: صورة مجهرية من الفئران cremaster العضلات المسمى مع المسمى والرودامين يكتين GS1 لتحديد الشرايين والشعيرات الدموية لتقييم كثافة ميكروفيسيل. العضلات كريماستير تم الحصول عليها من الفئران سبراغ داولي تغذية منخفضة الملح (LS، 0.4% كلوريد الصوديوم) أو عالية الملح (HS:4% كلوريد الصوديوم) نظام غذائي لمدة أسبوعين، وتثبت microvascular المطروح في الحيوانات التي تغذيها HS مقارنة بضوابط LS. شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وكما ذكر في المقدمة، وتصف هذه الورقة استخدام مجهر التلفزيون والشريان المقاومة المعزولة نهج لتقييم وظيفة الأوعية الدموية ليس فقط في نماذج الفئران القياسية (كالمستخدمة في الفيديو)، ولكن أيضا بدرجة عالية من التخصص وراثيا سلالات الفئران المهندسة، التي تظهر في الرواية والأفكار القوية التي يمكن الحصول عليها من استخدام هذه النهج. استخدام هذه التقنيات القوية لتقييم لهجة النشطة والسلبية الخواص الميكانيكية للشرايين مقاومة صغيرة يمكن أن توفر معلومات هامة فيما يتعلق بطائفة واسعة من آليات المراقبة والأوعية الدموية بما في ذلك تنظيم تعتمد على البطانة من لهجة النشطة في مقاومة الشرايين، وظيفة العضلات الملساء والأوعية الدموية تحت الظروف العادية والفيزيولوجية المرضية، وخصائص سلبية الشرايين المتصلة بإعادة عرض الأوعية الدموية والتغيرات في الميكانيكا جدار الأوعية الدموية. خلل غشائي قد ثبت أن يكون مؤشرا تشخيصية قوية لإحداث القلب والأوعية الدموية سلبية متعددة في البشر بما في ذلك المتصلة بالقلب والأوعية الدموية وفاة63، والمقاومة مقني الشريان الاستعدادات ذات قيمة خاصة في الكشف عن الخلل في بطانية وزيادة فهمنا لآليات الخلل بطانية.

لتوضيح فعالية تقنيات الفيديو المجهري في المختبر توظيف الشرايين المقاومة المعزولة، قدمنا أمثلة على استخدام هذه التقنيات في الفئران داهل حساسة الملح (SS) وفي رواية كونسوميك سلالات الفئران التي يحمل انخفاض الملح حساسية ضغط الدم مقارنة ب السلالة الأبوية SS24. تلك الدراسات التحقيق في آليات المراقبة والأوعية الدموية المتصلة بالجينات على اثنين من الكروموسومات التي تتسم بأهمية خاصة في المساهمة في الملح حساسية ضغط الدم والأوعية الدموية التعديلات في الفئران SS. هذه الكروموزومات هي كروموسوم 13، تحمل إنزيم الرينين الجينات18،22،29،،من5758، وكروموسوم 5، يحمل جينات ل isoforms من CYP450 4A ω-hydroxylase64 ،65– الإنزيم أن يجمع 20-HETE، التي لها آثار كبيرة على الوظيفة الكلوية والأوعية الدموية مفاعليه66،،من6768. آخر مؤخرا وقوية بالإضافة إلى الأدوات الوراثية الجرذ هو تطوير جينات الفئران خروج المغلوب نماذج استخدام تقنيات التحرير المتقدمة الجينات بما في ذلك: زفنس؛ النسخي المنشط--مثل-المستجيب nucleases (تالينس)، وفي الآونة الأخيرة كريسبر-Cas913،،من1415،،من1617. في المختبر مجهرية الفيديو استخدام هذه التقنيات لدراسة MCAs معزولة من Nrf2(-/-) نموذج الفئران خروج المغلوب التي تفتقر إلى مضادات الأكسدة الحاسمة وعامل النسخ الحماية خلية NRF2، وفرت الهامة و سبق الدم غير معروف ثاقبة آليات الخلل غشائي الناجمة عن الملح نظراً لعدم وجود ارتفاع الضغط17. نتائج محددة من تجارب استخدام هذه النماذج المتخصصة الفئران موصوفة في عدد من السابقة تقارير17،،من2957،،من5859، 60 , 64 , 65 .

وفي حين أنه من الواضح أن ثمة دراسات الشرايين المقاومة المعزولة، مقني قيمة للغاية في فهم الآليات التي تنظم وظيفة هذه السفن ذات أهمية حاسمة ضمن مجموعة متنوعة من الظروف، من المهم جداً أن تمارس عدد من الاحتياطات لضمان أن يتم الحصول على نتائج دقيقة وموثوق بها. بينما شرايين المخ وشرايين المقاومة العديد من أسرة الأوعية الدموية الأخرى يحمل لهجة الأصيلة، بعض الشرايين (لا سيما الشرايين المقاومة المساريقي العلوي) بحاجة إلى تكون مرحلة ما قبل التعاقد مع vasoconstrictors مثل إفراز بغية تقييم الردود على المحفزات وعائي، ومحاكاة بدقة أكثر في فيفو الشروط، التي تكون فيها هذه السفن تحت تأثير المنبهات العصبية وخلطيه مضيق للأوعية، مثل إفراز صدر من المحطات العصب ادريناليه. على هذا النحو، من المهم أن تكون على دراية بالخصائص الأساسية للشرايين دراستها، بعناية من الأدب أو من أجروا تجارب أولية. لأن البطانة تلعب دوراً رئيسيا في تنظيم الشرايين الكبيرة والشرايين الصغيرة والشرايين في دوران الأوعية الدقيقة، من الضروري توخي الحذر لتجنب إتلاف البطانة أثناء العزل و cannulation الشريان. اختبار الكلاسيكية لسلامة البطانة هي المظاهرة أن منظمة العمل ضد الجوع يسبب تمدد سفينة. أحد المحاذير هو أن ظروف الأكسدة، البطانة السفينة قد تكون سليمة، ولكن التوسع لمنظمة العمل ضد الجوع غائب نظراً لمسح مستويات مفرطة من أكسيد فائق أكسيد النيتريك منع استجابة وعائي. وفي تلك الحالات، يمكن التحقق من سلامة غشائي بتكرار تطبيق منظمة العمل ضد الجوع حضور زبال فائق أكسيد مثل تمبل، الذي ينبغي أن يعيد توسع الأوعية استجابة لمنظمة العمل ضد الجوع والمحفزات وعائي البطانة تعتمد على الأخرى. أيضا، في عدد من الحالات المرضية، البطانة يمكن الإفراج عن المواد التي تسبب انكماش خلايا العضلات الملساء والأوعية الدموية وانقباض الشريان؛ وفي بعض الحالات، هو وساطة البطانة تعتمد على تمدد (أو انقباض) عن طريق المواد الأخرى مثل الايضات السيكلواوكسيجيناز، ح2س2، والايضات ابوكسيجيناسي، إلخ. الاختبار الكلاسيكية لتعتمد على البطانة وعائي أو مضمون مضيق للأوعية إثبات أن تمدد أو انقباض الشريان القضاء بإزالة البطانية. أخيرا، يمكن عموما التحقق من مختلف المواد وعائي ومضيق للأوعية البطانة تعتمد على الهوية الإدارة مثبطات محددة أو جمع القمامة، مثل اسم L تمنع أكسيد النيتريك synthase، الاندوميتاسين تمنع تشكيل والايضات السيكلواوكسيجيناز، الكاتالاز مسح ح2س2ومثبطات سينثاز ثرومبوكاني ومثبطات ابوكسيجيناسي، أو الخصوم المسار CYP450-4A/20-HETE.

كما أنه من المهم (ومفيدة) لقياس مقدار نشط لهجة في نهاية التجربة بيرفوسينج وسوبيرفوسينج الشريان مع Ca2 +-مجاناً PSS، أو الدولة القائمة بجرعة قصوى لعامل وعائي قوية مثل بابافرين. مستوى نموذجي النشطة يستريح لهجة في هيئة مكافحة الاحتكارات، x 100 المحسوبة ك ((دماكس-دبقية) &/Dكحد أقصى)، ما يقرب من 40 ٪ دماكس ومدبقية فيها الحد الأقصى (Ca2 +-الحرة PSS) ويستريح القطر (PSS)، على التوالي، في ضغط الموازنة التحكم (عادة لاتحاد الماليزيين الصينيين 80 مم زئبق). سفن مع إلى حد كبير أقل نشاطا من لهجة أو الشرايين تظهر تضيقات القطاعي أو ديليشنز مستبعدة من التحليل، كما تلك دلائل إرشادية للصدمات للسفن. قياس أقطار الشرايين المتوسعة أقصى في Ca2 +-الحل مجاناً كما يسمح المحقق لتقييم الخصائص الميكانيكية السلبي للسفن بقياس قطر الشرايين وحساب الإجهاد-الانفعال علاقات خلال ارتفاعات متتابعة في الضغط ترانسمورال في ال7،الأوعية المتوسعة أقصى56. هذه العلاقات السلبية الإجهاد-الانفعال يتم الحصول عليها بسهولة، وتقدم دليلاً قيماً لأي تغييرات في الخصائص الميكانيكية للسفن.

نظافة الممصات والموصلات، وأنابيب إمداد الخزانات في غاية الأهمية للتجارب الناجحة. وفي هذا الصدد، من المهم لطرد جميع الحلول من الأنبوب بعد الانتهاء من التجربة، وشطف وتنظيف الأنسجة حمام وأنابيب توصيل جميع الخزانات المستخدمة في تخزين، الحارة، والغاز-حجته الوقائي قبل الوصول إلى السفينة الدائرة. ينبغي أيضا تنظيفها وتغييرها دورياً، كما ينبغي أي أنابيب تحمل PSS ستوبكوكس والصمامات في نظام التسليم. علامة كلاسيكية من الأنابيب الملوثة ضباب رمادية التي تم إنشاؤها بواسطة العفن والبكتيريا؛ وهذه التغييرات هي مصحوبة بفقدان مفاعليه عادي للأوعية الدموية بسبب المواد المنتجة بسبب التلوث البكتيري. ومع ذلك، مازال يمكن الحالي في غياب أي أدلة مرئية التلوث بالبكتيريا والكائنات الدقيقة الأخرى.

ونحن نعتقد أن هذه الورقة مثالاً مفيداً لاستخدام تقنيات العريقة التي تعتبر استثنائية مناسبة تماما لإجراء دراسات للشرايين المقاومة الصغيرة البالغة الأهمية من أسرة الأوعية الدموية المختلفة. عندما يتم دمجها مع نهج قياسية لتقييم نضح الأنسجة، مثل LDF واﻷسلوب يكتين GS1 لتقييم كثافة ميكروفيسيل، في المختبر مجهرية الفيديو الشرايين المقاومة مقني يوفر نظرة ثاقبة قيمة للغاية العوامل التي تتحكم في نضح الأنسجة وكيف يمكن تغيير هذه في الحالات المرضية. بالإضافة إلى توفير وسيلة قوية لدراسة الآليات الأساسية للعضلات الملساء والأوعية الدموية ووظيفتها غشائي في نماذج الفئران القياسية، يمكن تطبيق استخدام الفيديو المجهري لدراسة الشرايين المقاومة الفردية إلى نماذج حيوانية أخرى وإلى المقاومة البشرية الشرايين. تطبيق الفحص المجهري الفيديو الشرايين المقاومة المعزولة من رواية الفئران المهندسة وراثيا نماذج يفتح أبواباً جديدة لفهم التغيرات المظهرية التي تحدث استجابة لتغيير وظيفة تعدد (وقائمة متزايدة) من الجينات.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

المؤلفين قد لا تضارب المصالح المالية.

Acknowledgments

الكتاب الإعراب عن شكرهم الخالص فينك كاتي ولين دوندلينجير لما قدموه من المساعدة في إعداد هذه المخطوطة.

منحة الدعم: R21 # المعاهد الوطنية للصحة-OD018309؛ #R56-HL065289؛ #R01-HL128242.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SS Rat Medical College of Wisconsin SS/JHsd/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.5BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 5BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
SS.13BN Consomic Rat Medical College of Wisconsin SS-Chr 13BN/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-BN Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13hmgc41-D13)hmgc23/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSA Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat77-D13rat105/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Ren1-SSB Congenic Rat Medical College of Wisconsin SS.BN-(D13rat124-D13rat101/Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Nrf2(-/-) Knockout Rat and Wild Type Littermates Medical College of Wisconsin SD-Nfe212em1Mcwi strain Contact Dr. Aron Geurts (ageurts@mcw.edu)
Low Salt Rat Chow (0.4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113755
High Salt Rat Chow (4% NaCl)-AIN-76A Dyets, Inc. 113756
Colorado Video Caliper Colorado Video, Inc. Model 308
Video Camera Hitachi KPM1AN
Microscope Olympus Life Science CKX41
Television Monitor Panasonic WVBM1410
Pressure Transducers Stoelting 56360
Blood Pressure Display Unit Stoelting 50115
Cannulated Artery Chamber Living Systems Instrumentation CH-1 Single vessel chamber for general use
Temperature Controller for Single Chamber Living Systems Instrumentation TC-09S
Gas Dispersion Tube, Miniature,Straight Living Systems Instrumentation GD-MS Provides aeration in the vessel bath
Gas Exchange Oxygenator, Miniature Living Systems Instrumentation OX Allows gas exchange with perfusate
Laser-Doppler Flowmeter Perimed PeriFlux 5000 LDPM
GS1 Lectin Vector Labs RL-1102
Glass Capillary Tubes for Micropipettes Fredrich Haer Co. 27-33-1 2 mm ODX1 mm ID
Verticle Pipette Puller David Kopf Instruments Model 700C
Nylon suture material (10/0)-3 PLY Ashaway Line and Twine Manufacturing Co. 114-ANM-10 Single strands of 3 ply nylon suture teased out for use on vessels
Dumont #5 Forceps-Inox Fine Science Tools 11254-20
Vannas Scissors Fine Science Tools 15003-08
Protandim Protandim NRF2 Inducer: Contact Dr. Joe McCord (JOE.MCCORD@UCDENVER.EDU)
Sodium Chloride Fisher Bioreagents BP358-212
Sodium Bicarbonate Fisher Chemical S233-3
Dextrose (d-glucose) anhydrous Fisher Chemical D16-500
Magnesium Sulfate (MgSO4-7H2O) Sigma Aldrich M1880-500 G
Calcium Chloride (CaCl2-2 H2O) Sigma C5080-500G
Sodium Phosphate-Monobasic (NaH2PO4) Sigma S0751-500G
Potassium Chloride (KCl) Fisher Chemical P217-500G
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) Sigma ED255-500G

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Furchgott, R. F., Zawadzki, J. V. The obligatory role of endothelial cells in the relaxation of arterial smooth muscle by acetylcholine. Nature. 288, 373-376 (1980).
  2. Bevan, J. A., Osher, J. V. A direct method for recording tension changes in the wall of small blood vessels in vitro. Agents Actions. 2, 257-260 (1972).
  3. Mulvany, M. J., Halpern, W. Contractile properties of small arterial resistance vessels in spontaneously hypertensive and normotensive rats. Circ. Res. 41, 19-26 (1977).
  4. Speden, R. N. The use of excised, pressurized blood vessels to study the physiology of vascular smooth muscle. Experientia. 41, 1026-1028 (1985).
  5. Osol, G., Halpern, W. Myogenic properties of cerebral blood vessels from normotensive and hypertensive rats. Am. J. Physiol. 249, H914-H921 (1985).
  6. Halpern, W., Kelley, M. In vitro methodology for resistance arteries. Blood Vessels. 28, 245-251 (1991).
  7. Feihl, F., Liaudet, L., Waeber, B. The macrocirculation and microcirculation of hypertension. Curr Hypertens Rep. 11, 182-189 (2009).
  8. Smits, G. J., Roman, R. J., Lombard, J. H. Evaluation of laser-Doppler flowmetry as a measure of tissue blood flow. J Appl Physiol. 61, 666-672 (1985).
  9. Hudetz, A. G., Roman, R. J., Harder, D. R. Spontaneous flow oscillations in the cerebral cortex during acute changes in mean arterial pressure. J Cereb Blood Flow Metab. 12, 491-499 (1992).
  10. Hudetz, A. G., Smith, J. J., Lee, J. G., Bosnjak, Z. J., Kampine, J. P. Modification of cerebral laser-Doppler flow oscillations by halothane, PCO2, and nitric oxide synthase blockade. Am J Physiol. 269, H114-H120 (1995).
  11. Hansen-Smith, F. M., Watson, L., Lu, D. Y., Goldstein, I. Griffonia simplicifolia I: fluorescent tracer for microcirculatory vessels in nonperfused thin muscles and sectioned muscle. Microvasc Res. 36, 199-215 (1988).
  12. Greene, A. S., Lombard, J. H., Cowley, A. W., Hansen-Smith, F. M. Microvessel changes in hypertension measured by Griffonia simplicifolia I lectin. Hypertension. 15, 779-783 (1990).
  13. Aitman, T., Dhillon, P., Geurts, A. M. A RATional choice for translational research? Dis Model Mech. 9, 1069-1072 (2016).
  14. Geurts, A. M., et al. Knockout rats via embryo microinjection of zinc-finger nucleases. Science. 325, 433 (2009).
  15. Geurts, A. M., et al. Generation of gene-specific mutated rats using zinc-finger nucleases. Methods Mol Biol. 597, 211-225 (2010).
  16. Geurts, A. M., Moreno, C. Zinc-finger nucleases: new strategies to target the rat genome. Clin Sci (Lond). 119, 303-311 (2010).
  17. Priestley, J. R., Kautenburg, K. E., Casati, M. C., Endres, B. T., Geurts, A. M., Lombard, J. H. The NRF2 knockout rat: a new animal model to study endothelial dysfunction, oxidant stress, and microvascular rarefaction. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 310, H478-H487 (2016).
  18. Cowley, A. W., et al. Brown Norway chromosome 13 confers protection from high salt to consomic Dahl S rat. Hypertension. 37, 456-461 (2001).
  19. Rapp, J. P. Dahl salt-susceptible and salt-resistant rats. A review. Hypertension. 4, 753-763 (1982).
  20. Rapp, J. P., Wang, S. M., Dene, H. A genetic polymorphism in the renin gene of Dahl rats cosegregates with blood pressure. Science. 243, 542-544 (1989).
  21. Manning, R. D. Jr, Meng, S., Tian, N. Renal and vascular oxidative stress and salt-sensitivity of arterial pressure. Acta Physiol Scand. 179, 243-250 (2003).
  22. Moreno, C., et al. Multiple blood pressure loci on rat chromosome 13 attenuate development of hypertension in the Dahl S hypertensive rat. Physiol Genomics. 31, 228-235 (2007).
  23. Tobian, L., Lange, J., Iwai, J., Hiller, K., Johnson, M. A., Goossens, P. Prevention with thiazide of NaCl-induced hypertension in Dahl "S" rats. Evidence for a Na-retaining humoral agent in "S" rats. Hypertension. 1, 316-323 (1979).
  24. Mattson, D. L., et al. Chromosome substitution reveals the genetic basis of Dahl salt-sensitive hypertension and renal disease. Am J Physiol Renal Physiol. 295, F837-F842 (2008).
  25. Kunert, M. P., et al. Consomic strategies to localize genomic regions related to vascular reactivity in the Dahl salt-sensitive rat. Physiol Genomics. 26, 218-225 (2006).
  26. Cowley, A. W., Liang, M., Roman, R. J., Greene, A. S., Jacob, H. J. Consomic rat model systems for physiological genomics. Acta Physiol Scand. 181, 585-592 (2004).
  27. Kunert, M. P., Dwinell, M. R., Lombard, J. H. Vascular responses in aortic rings of a consomic rat panel derived from the Fawn Hooded Hypertensive strain. Physiol Genomics. 42A, 244-258 (2010).
  28. Liang, M., et al. Renal medullary genes in salt-sensitive hypertension: a chromosomal substitution and cDNA microarray study. Physiol Genomics. 8, 139-149 (2002).
  29. Durand, M. J., Moreno, C., Greene, A. S., Lombard, J. H. Impaired relaxation of cerebral arteries in the absence of elevated salt intake in normotensive congenic rats carrying the Dahl salt-sensitive renin gene. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 299, H1865-H1874 (2010).
  30. Hybertson, B. M., Gao, B., Bose, S. K., McCord, J. M. Oxidative stress in health and disease: the therapeutic potential of Nrf2 activation. Mol Aspects Med. 32, 234-246 (2011).
  31. Itoh, K., et al. An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements. Biochem Biophys Res Commun. 236, 313-322 (1997).
  32. Myung, S. K., et al. Efficacy of vitamin and antioxidant supplements in prevention of cardiovascular disease: systematic review and meta-analysis of randomised controlled trials. BMJ. 346, f10 (2013).
  33. Fredricks, K. T., Liu, Y., Lombard, J. H. Response of extraparenchymal resistance arteries of rat skeletal muscle to reduced PO2. Am J Physiol. 267, H706-H715 (1994).
  34. Fredricks, K. T., Liu, Y., Rusch, N. J., Lombard, J. H. Role of endothelium and arterial K+ channels in mediating hypoxic dilation of middle cerebral arteries. Am J Physiol. 267, H580-H586 (1994).
  35. Frisbee, J. C., Maier, K. G., Falck, J. R., Roman, R. J., Lombard, J. H. Integration of hypoxic dilation signaling pathways for skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 283, R309-R319 (2002).
  36. Pavlov, T. S., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A. Implementing Patch Clamp and Live Fluorescence Microscopy to Monitor Functional Properties of Freshly Isolated PKD Epithelium. J Vis Exp. (103), (2015).
  37. Nelson, M. T., Conway, M. A., Knot, H. J., Brayden, J. E. Chloride channel blockers inhibit myogenic tone in rat cerebral arteries. J Physiol. 502 (Pt 2), 259-264 (1997).
  38. Brayden, J. E., Halpern, W., Brann, L. R. Biochemical and mechanical properties of resistance arteries from normotensive and hypertensive rats. Hypertension. 5, 17-25 (1983).
  39. Weber, D. S., Lombard, J. H. Elevated salt intake impairs dilation of rat skeletal muscle resistance arteries via ANG II suppression. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 278, H500-H506 (2000).
  40. Weber, D. S., Lombard, J. H. Angiotensin II AT1 receptors preserve vasodilator reactivity in skeletal muscle resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 280, H2196-H2202 (2001).
  41. Wang, J., Roman, R. J., Falck, J. R., de la Cruz, L., Lombard, J. H. Effects of high-salt diet on CYP450-4A omega-hydroxylase expression and active tone in mesenteric resistance arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288, H1557-H1565 (2005).
  42. Raffai, G., et al. Modulation by cytochrome P450-4A omega-hydroxylase enzymes of adrenergic vasoconstriction and response to reduced PO2 in mesenteric resistance arteries of Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 17, 525-535 (2010).
  43. Mishra, R. C., Wulff, H., Hill, M. A., Braun, A. P. Inhibition of Myogenic Tone in Rat Cremaster and Cerebral Arteries by SKA-31, an Activator of Endothelial KCa2.3 and KCa3.1 Channels. J Cardiovasc Pharmacol. 66, 118-127 (2015).
  44. Freed, J. K., Beyer, A. M., LoGiudice, J. A., Hockenberry, J. C., Gutterman, D. D. Ceramide changes the mediator of flow-induced vasodilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in the human microcirculation. Circ Res. 115, 525-532 (2014).
  45. Beyer, A. M., Durand, M. J., Hockenberry, J., Gamblin, T. C., Phillips, S. A., Gutterman, D. D. An acute rise in intraluminal pressure shifts the mediator of flow-mediated dilation from nitric oxide to hydrogen peroxide in human arterioles. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 307, H1587-H1593 (2014).
  46. Durand, M. J., et al. Vascular actions of angiotensin 1-7 in the human microcirculation: novel role for telomerase. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36, 1254-1262 (2016).
  47. Beyer, A. M., et al. Transition in the mechanism of flow-mediated dilation with aging and development of coronary artery disease. Basic Res Cardiol. 112, 5 (2017).
  48. Muller, J. M., Chilian, W. M., Davis, M. J. Integrin signaling transduces shear stress--dependent vasodilation of coronary arterioles. Circ Res. 80, 320-326 (1997).
  49. Liu, Y., Harder, D. R., Lombard, J. H. Interaction of myogenic mechanisms and hypoxic dilation in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 283, H2276-H2281 (2002).
  50. Potocnik, S. J., et al. Endothelium-dependent vasodilation in myogenically active mouse skeletal muscle arterioles: role of EDH and K+ channels. Microcirculation. 16, 377-390 (2009).
  51. Harder, D. R. Pressure-dependent membrane depolarization in cat middle cerebral artery. Circ Res. 55, 197-202 (1984).
  52. Greene, A. S., Rieder, M. J. Measurement of vascular density. Methods Mol. Med. 51, 489-496 (2001).
  53. Hernandez, I., Cowley, A. W., Lombard, J. H., Greene, A. S. Salt intake and angiotensin II alter microvessel density in the cremaster muscle of normal rats. Am J Physiol. 263, H664-H667 (1992).
  54. Resende, M. M., Amaral, S. L., Moreno, C., Greene, A. S. Congenic strains reveal the effect of the renin gene on skeletal muscle angiogenesis induced by electrical stimulation. Physiol Genomics. 33, 33-40 (2008).
  55. Petersen, M. C., Munzenmaier, D. H., Greene, A. S. Angiotensin II infusion restores stimulated angiogenesis in the skeletal muscle of rats on a high-salt diet. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 291, H114-H120 (2006).
  56. Frisbee, J. C., Weber, D. S., Liu, Y., DeBruin, J. A., Lombard, J. H. Altered structure and mechanics of skeletal muscle arteries with high-salt diet and reduced renal mass hypertension. Microvasc Res. 59, 323-328 (2000).
  57. Drenjancevic-Peric, I., Lombard, J. H. Introgression of chromosome 13 in Dahl salt-sensitive genetic background restores cerebral vascular relaxation. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287, H957-H962 (2004).
  58. Drenjancevic-Peric, I., Phillips, S. A., Falck, J. R., Lombard, J. H. Restoration of normal vascular relaxation mechanisms in cerebral arteries by chromosomal substitution in consomic SS.13BN rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 289, H188-H195 (2005).
  59. Lukaszewicz, K. M., Paudyal, M. P., Falck, J. R., Lombard, J. H. Role of vascular reactive oxygen species in regulating cytochrome P450-4A enzyme expression in Dahl salt-sensitive rats. Microcirculation. 23, 540-548 (2016).
  60. Lombard, J. H., Sylvester, F. A., Phillips, S. A., Frisbee, J. C. High-salt diet impairs vascular relaxation mechanisms in rat middle cerebral arteries. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 284, H1124-H1133 (2003).
  61. Priestley, J. R., et al. Reduced angiotensin II levels cause generalized vascular dysfunction via oxidant stress in hamster cheek pouch arterioles. Microvasc Res. 89, 134-145 (2013).
  62. Velmurugan, K., Alam, J., McCord, J. M., Pugazhenthi, S. Synergistic induction of heme oxygenase-1 by the components of the antioxidant supplement Protandim. Free Radic Biol Med. 46, 430-440 (2009).
  63. Widlansky, M. E., Gokce, N., Keaney, J. F., Vita, J. A. The clinical implications of endothelial dysfunction. J Am Coll Cardiol. 42, 1149-1160 (2003).
  64. Lukaszewicz, K. M., Falck, J. R., Manthati, V. L., Lombard, J. H. Introgression of Brown Norway CYP4A genes on to the Dahl salt-sensitive background restores vascular function in SS-5BN consomic rats. Clin Sci (Lond). 124, 333-342 (2013).
  65. Lukaszewicz, K. M., Lombard, J. H. Role of the CYP4A/20-HETE pathway in vascular dysfunction of the Dahl salt-sensitive rat. Clin Sci (Lond). 124, 695-700 (2013).
  66. Roman, R. J. P-450 metabolites of arachidonic acid in the control of cardiovascular function. Physiol Rev. 82, 131-185 (2002).
  67. Roman, R. J., Maier, K. G., Sun, C. W., Harder, D. R., Alonso-Galicia, M. Renal and cardiovascular actions of 20-hydroxyeicosatetraenoic acid and epoxyeicosatrienoic acids. Clin Exp Pharmacol. 27, 855-865 (2000).
  68. Roman, R. J., Alonso-Galicia, M. P-450 eicosanoids: A novel signaling pathway regulating renal function. News Physiol Sci. 14, 238-242 (1999).

Tags

الطب، 130 قضية، مقاومة الشرايين، البطانة، دوران الأوعية الدقيقة، والملح، وارتفاع ضغط الدم، والدورة الدموية الدماغية
تقييم آليات مراقبة الأوعية الدموية استخدام الفحص المجهري الفيديو الشرايين المقاومة المعزولة من الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J.,… More

Lukaszewicz, K. M., Durand, M. J., Priestley, J. R. C., Schmidt, J. R., Allen, L. A., Geurts, A. M., Lombard, J. H. Evaluation of Vascular Control Mechanisms Utilizing Video Microscopy of Isolated Resistance Arteries of Rats. J. Vis. Exp. (130), e56133, doi:10.3791/56133 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter