Questo protocollo descrive un metodo semplice per analizzare segnali di calcio negli impianti generati da insetti Pentatomomorfi, come gli afidi. Thaliana di Arabidopsis trasformate con il biosensore di calcio GFP GCaMP3 consentire per l’imaging in tempo reale in vivo della dinamica del calcio con un’alta risoluzione temporale e spaziale.
Gli ioni di calcio sono preveduti per essere chiave segnalazione entità durante le interazioni biotiche, con segnalazione del calcio che formano parte integrante della risposta di difesa della pianta di elicitori microbiche e di ferite causate da insetti, suscitando sistemica del calcio da masticare segnali in piante. Tuttavia, il ruolo del calcio in vivo durante stress biotico è ancora poco chiaro. Questo protocollo descrive l’uso di un sensore di calcio geneticamente codificato per rilevare segnali di calcio nelle piante durante l’alimentazione da un parassita ematofago. Emitteri come gli afidi perforare un piccolo numero di cellule con specializzato, succhiare apparato boccale, che li rende lo strumento ideale per studiare la dinamica del calcio quando una pianta si trova ad affrontare uno stress biotico, che è distinto da una risposta al ferimento di forma allungata. Inoltre, biosensori fluorescenti stanno rivoluzionando la misurazione di segnalazione molecole in vivo negli animali e piante. Esprimendo un biosensore GFP-basato del calcio, GCaMP3, nella pianta modello Arabidopsis thaliana consente l’imaging in tempo reale della dinamica del calcio pianta durante insetto alimentazione, con un’elevata risoluzione spaziale e temporale. Un dosaggio ripetibile e robusto è stato sviluppato utilizzando la microscopia a fluorescenza di foglie GCaMP3 distaccate, consentendo per la misurazione continua della dinamica del calcio citosolico prima, durante e dopo l’alimentazione dell’insetto. Questo rivela un’elevazione di calcio rapida altamente localizzato intorno l’afide alimentazione sito che si verifica in pochi minuti. Il protocollo può essere adattato ad altri stress biotici, come altre specie di insetti, mentre l’uso di Arabidopsis thaliana permette la rapida generazione di mutanti per facilitare l’analisi molecolare del fenomeno.
Calcio (Ca2 +) è uno degli elementi più onnipresenti segnalazione nelle piante. Un aumento transitorio nella concentrazione citosolica di Ca2 + ([Ca2 +]cyt) viene decodificato da una complessa rete di componenti a valle ed è coinvolto nella risposta a entrambi stress abiotici e biotici1,2. Un aumento in [Ca2 +]cyt è una delle risposte prime di elicitori microbiche, formando una parte comune della pianta difesa risposta3,4,5. Aumenti in [Ca2 +]cyt sono stati osservati anche in risposta al ferimento causato da masticare insetti, come lepidotteri6,7. Tuttavia, il ruolo potenziale della pianta Ca2 + segnali in risposta a vivere minacce biotiche che danneggiano solo poche cellule non è stato esplorato. L’afide verde pesco Myzus persicae è un insetto ematofago che rappresenta una grave minaccia per il mondo dell’agricoltura8,9, e Ca2 + efflusso dallo spazio extracellulare è stata osservata in foglie infestata da M. persicae10. Questo illustra protocollo un metodo affidabile e ripetibile per misurare pianta Ca2 + segnali mentre M. persicae feed da foglie usando un fluorescente2 + biosensore, di Ca con sia gli afidi e GCaMP3 offrendo nuovi strumenti con cui sezionare il ruolo del Ca2 + durante interazioni biotiche.
CA2 +-microelettrodi selettivi sono stati già utilizzati per misurare [Ca2 +] in piante11,12. Più recentemente, approcci bioluminescenti e fluorescenti sono diventato standardizzati. Questi biosensori legano Ca2 + ed emettono luce, permettendo di non-parallelo opportunità per studiare Ca2 + dinamica in tutta tessuti e cellule. Biosensori2 + CA possono essere iniettati come coloranti o stabilmente prodotto dopo l’introduzione del biosensore codifica sequenza nel genoma dell’organismo tramite trasformazione (cioè, geneticamente codificato biosensori). Quest’ultimo offre i principali vantaggi di essere facilmente espressa nel tessuto vivo e in grado di localizzazione subcellulare13. La proteina equorina, isolata da Aequorea victoria (Medusa) era il primo codificato geneticamente Ca2 + biosensore distribuito in piante14. Come una proteina bioluminescente, equorina non richiede eccitazione da luce esterna, che evita il cromoforo candeggio e autofluorescenza15. Aequorina è stato usato con successo per misurare flussi [Ca2 +] in risposta a vari stimoli, tra cui temperatura16, agenti patogeni17,18,19, sale lo stress20 ,21e ferendo7. Tuttavia, esso è svantaggiata dalla intensità del segnale relativamente basso, rendendo la rilevazione dei flussi [Ca2 +] in singole celle e dai tessuti con sensore scarsa espressione difficile13.
Lo sviluppo di Ca2 + biosensori che può essere flourescente ha completato equorina, consentendo una dettagliata analisi subcellulare e livello del tessuto di Ca2 + dinamiche. Uno del più comuni biosensori fluorescenti sono il trasferimento di energia di risonanza di fluorescenza (FRET)-base Cameleons. FRET Cameleons sono composti da due proteine, in genere PCP e YFP, che entrano in stretto contatto del cambiamento conformazionale indotto dal legame di Ca2 + a un dominio di calmodulina nella regione linker CFP-YFP. Questo contatto permette il trasferimento di energia da CFP di YFP, e il conseguente cambiamento di fluorescenza di questi fluorofori permette la quantificazione accurata della [Ca2 +] attraverso il calcolo del rapporto tra i segnali di fluorescenza da due fluorofori22. FRET Cameleons sono superiori ai coloranti fluorescenti equorina e non-raziometrici, quanto sono che meno colpiti dal livello di espressione della proteina23 e spesso hanno una maggiore resa fluorescente, permettendo per imaging cellulare e subcellulare23. Ad esempio, FRET Cameleons sono stati recentemente utilizzati per identificare a distanza Ca2 + segnali in piante e risolvere questi al livello cellulare24,25,26.
Un’innovazione recente con servizio fluorescente2 + biosensori per Ca basata su GFP è stato lo sviluppo di biosensori altamente sensibile singolo-fluoroforo (singolo-FP). Singolo-FP biosensori sono costituiti da un singolo circolarmente permutato GFP legata ad una calmodulina e peptide di M13, con Ca2 + associazione a calmodulina, causando così una reazione acqua-mediata tra calmodulina e GFP protonare GFP e aumento rendimento fluorescente27,28,29. Singolo-FP sensori offrono parecchi vantaggi sopra Cameleons FRET, tra cui disegno sperimentale più semplice e una risoluzione temporale potenzialmente maggiore di imaging30. Anche se single-FP sensori non possono quantificare assoluto [Ca2 +] semplicemente come come sensori di FRET, sono superiori per l’analisi della dinamica temporale e spaziale del Ca2 + segnali5,23. GCaMPs sono uno dei sensori di singolo-FP affermati28 e hanno subito diverse revisioni per migliorare il loro rendimento fluorescente, gamma dinamica, Ca2 + affinità e rapporti segnale-rumore31,32 , 33 , 34. the GCaMPs sono stati utilizzati con successo in sistemi animali, come zebrafish motoneuroni35 e frutta Vola giunzioni neuromuscolari34. Mutagenesi casuale di GCaMP3 ha provocato ulteriori classi di singolo-FP sensori, tra cui il GCaMP6 ultrasensibile36 e il GECOs29. La GECOs recentemente sono stati utilizzati in Arabidopsis thaliana (d’ora in poi denominato Arabidopsis) per misurare Ca2 + flussi in risposta all’ATP, la chitina e la flg22 batterica elicitori. Questo studio ha anche dimostrato che il biosensore R-GECO ha superato il FRET Cameleon YC3.6 in termini di segnale massima cambiamento e signal-to-noise ratio5.
A causa della facilità di uso, fluorescente ad alto rendimento e alta risoluzione temporale che può essere raggiunto con GCaMP biosensori, GCaMP3 geneticamente codificato in Arabidopsis sotto il promotore 35S del virus del mosaico del cavolfiore . Gli strumenti genetici disponibili per la ricerca di Arabidopsis consentono l’analisi molecolare dettagliata del Ca2 + segnale misurato da GCaMP3. Inoltre, il biosensore GCaMP3 possa essere visualizzato sotto un microscopio a fluorescenza, piuttosto che un più costoso sistema confocale. Questo protocollo consente tutto-tessuto di imaging, essenziale quando conducendo esperimenti con stress biotici dal vivo. L’esperimento è progettato tali che foglie distaccate da piante di 35S::GCaMP3 sono fatto galleggiare in acqua, per impedire la fuga dell’insetto e per limitare l’alimentazione ad un tessuto specifico. Il metodo descritto in questo documento permette quindi l’analisi di foglia dynamics2 + Ca durante l’alimentazione di M. persicae, conseguente la caratterizzazione di un novello della pianta risposta di segnalazione. Questo metodo può anche essere adattato per funzionare con altri stress biotici, come altre specie di insetti e microrganismi patogeni e con altri tessuti vegetali, come le radici.
Il metodo descritto in questo documento permette l’analisi in tempo reale della pianta di Ca2 + segnalazione durante uno stress biotico come l’alimentazione dell’insetto. Questo dimostra che una delle prime risposte pianta a tali minacce è una localizzatacyt elevazione [Ca2 +] intorno al sito d’alimentazione dell’insetto. Attraverso l’uso di mutanti, questo metodo consentirà la caratterizzazione fisiologica e molecolare di tali segnali, che non era possibile in precedenza. Un passaggio fondamentale in questo protocollo è quello di assicurare che le foglie distaccate non siano eccessivamente disturbate durante il processo di distacco (punto 3.2) o durante il trasferimento di insetti alle foglie (punto 4.5). Dato che l’attuale protocollo fornisce una misura relativa della [Ca2 +]cyt , piuttosto che una concentrazione assoluta, è vitale che le impostazioni di microscopio vengono mantenute costanti in tutto l’esperimento. C’è anche il potenziale per la parzialità umana durante la selezione di ROIs e l’analisi dei dati, e come tale, è consigliabile che gli esperimenti vengono condotti in doppio-cieco.
Ci sono diversi vantaggi significativi di misurazione [Ca2 +]cyt durante stress biotico con questo protocollo. In primo luogo, l’uso di un fluoroforo unico con un alto rendimento fluorescente permette l’imaging essere condotto su uno stereomicroscopio, che è meno costosa rispetto all’utilizzo di un microscopio confocale. L’utilizzo di un fluoroforo unico anche rende e analisi dei dati semplice, come non c’è solo una misura per registrare. Inoltre, l’uso di un microscopio stereoscopico permette per l’imaging di foglie intere, che è essenziale, dato che molte interazioni biotiche, incluse le interazioni pianta-afide, verificano su larga scala spaziale. L’alta risoluzione temporale dell’immagine cattura possibile con GCaMP3, basato sulla dissociazione rapida del Ca2 + dal sensore dopo associazione23,30 e l’alta resa fluorescente, consente per le misure da adottare fino a ogni 5 s. Inoltre, il dosaggio di foglia non permette la fuoriuscita dell’insetto, una chiave che limita il punto per lo svolgimento di tali esperimenti su piante intere (in preparazione). Le foglie distaccate, inoltre, garantire che l’insetto si nutre da un percorso pre-definito, consentendo l’analisi di Ca2 + dinamiche prima, durante e dopo la poppata. Questo protocollo garantisce anche che le foglie delle fasi di sviluppo simili sono usate per analisi.
Lo svantaggio principale di questo protocollo ha origine dall’uso di un biosensore non raziometrici. Con singolo-FP biosensori, variazione nell’emissione di GFP può derivare da variabili sperimentali diversi da [Ca2 +]cyt, quali cambiamenti di pH cellulare, movimento o il livello di espressione del biosensore. Questi problemi non sono rilevati con FRET Cameleons durante FRET, come il trasferimento di energia da CFP di YFP si verifica solo al momento di legame di Ca2 + . Altre condizioni che alterano le proprietà fluorescenti di singoli fluorophores rischiano di imitare l’avversari cambiamenti nell’intensità della PCP e YFP, e il calcolo di raziometrici utilizzato intrinsecamente normalizza le misurazioni per molti di questi altri artefatti ottico23,30. Questo rende più affidabile con FRET Cameleons stime di assoluto [Ca2 +]cyt . Di conseguenza, GCaMP3 è meglio utilizzato come un biosensore per misurare la relativa [Ca2 +]cyt, anche se è ancora sufficiente rilevare e caratterizzare i fenomeni biologici in piante5,(in preparation). Pertanto, è essenziale utilizzare i controlli per dimostrare che l’effetto osservato è a causa di Ca2 +, tra cui Ca2 +-correlati mutanti genetici(in preparazione) o Ca2 + canale inibitori farmacologici quali La3 + . D’importanza, singolo-FP biosensori in genere di visualizzare una maggiore resa fluorescente e una maggiore gamma dinamica (vale a dire, un aumento in fioritura al momento di legame2 + Ca) oltre FRET Cameleons23, che rende più adatto a GCaMP livello del tessuto imaging, mentre Cameleons FRET sono uno strumento utile per l’imaging cellulare con un microscopio confocale5,25.
Durante l’esecuzione del presente protocollo, è possibile che non si verificheranno alcuni problemi che richiedono la risoluzione dei problemi. Ad esempio, si raccomanda che i campioni in cui i display di controllo (non trattato) foglia grande [Ca2 +]cyt elevazioni sono scartati (punto 6.3). Tali transitori sono probabilmente il risultato di stress indotto da microscopia. Infatti, la luce blu è noto per suscitare Ca2 + segnali38,39,40,41, e la luce ad alta intensità potrebbe anche tradursi in temperatura e stress osmotico, entrambi i quali anche suscitare [Ca2 +]cyt elevazioni21,25,42. Di conseguenza, per ridurre tali sollecitazioni, è importante per condurre l’esperimento in una stanza ben ventilata e temperatura controllata e per evitare tempi di esposizione inutilmente lunghi. È anche importante per non disturbare le foglie eccessivamente durante il distacco o la microscopia per prevenire tocco-suscitata [Ca2 +]cyt elevazioni43,44,45. Possono inoltre verificarsi problemi con la sedimentazione degli insetti. Con M. persicae, gli insetti non si insediano sulle foglie in diversi campioni. Questo potrebbe essere un risultato di difesa ferita-suscitata nelle foglie distaccate46,47, o la dispersione degli insetti dalla luce blu. Infatti, visione in M. persicae è governata da tre fotorecettori, tra cui uno con un picco di sensibilità di 490 nm48. Riduzione dell’esposizione di microscopia e la gestione gli afidi con cura potrebbe ridurre il disagio e favorire la sedimentazione.
Il protocollo descritto nel libro corrente dà nuove intuizioni sulla comprensione dei meccanismi molecolari delle interazioni pianta-insetto e risposta della pianta a stress biotici. Consente la visualizzazione di una delle prime risposte pianta all’alimentazione dell’insetto e facilita ulteriormente le indagini attraverso l’utilizzo di notevoli risorse genetiche Arabidopsis disponibili. Inoltre, questo protocollo consente l’uso di organismi viventi, al contrario di estratti49 o elicitori50. In futuro, questa tecnica potrebbe essere applicata ad altri stress biotici, come altre specie di insetti, nematodi o microrganismi patogeni, come pure agli stress abiotici. La microscopia di GCaMP3 possa anche essere modificata per altri tessuti vegetali, alternativa ROIs sulla foglia, o anche intere piante di immagine. Inoltre, esiste il rischio potenziale per il biosensore essere geneticaly codificati in altre specie. Di conseguenza, il protocollo descritto in questa carta ha il potenziale per undercover la base molecolare del Ca2 + segnalazione in una gamma di nuove interazioni biotiche tra piante e altre specie.
The authors have nothing to disclose.
Vorremmo ringraziare Grant Calder (John Innes Centre, Regno Unito) per la consulenza in materia di microscopia. Anche, gli autori desiderano ringraziare il John Innes Centre orticole e dipartimenti di entomologia per la loro assistenza. Questo lavoro è stato supportato da un PhD studentship da John Innes Foundation (T.V.), concedere 1/JJ004561/B dalla BBSRC e John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. e D.S.), un anno nel collocamento di industria da John Innes Centre (M.A.) , una borsa di studio estiva da Biochemical Society del Regno Unito (J.C.), PRESTO JST (M.T.) e sovvenzioni MCB 1329723 e IOS-1557899 della National Science Foundation (M.T. e S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |