Summary
이 프로토콜 aphids와 같은 hemipteran 곤충을 먹이로 생성 하는 식물에 칼슘 신호 분석을 위한 간단한 방법을 설명 합니다. 애기 thaliana GFP 칼슘 바이오 센서 GCaMP3으로 변형 시간적, 공간적 해상도 높은 칼슘 역학의 실시간 vivo에서 영상에 대 한 수 있습니다.
Abstract
칼슘 이온 칼슘 신호 미생물 elicitors 씹는 곤충, 조직의 칼슘 도출로 인 한 부상 하 고 식물 방위 응답의 설립된 부분이 형성 된 생물 상호 작용 하는 동안 주요 신호 엔터티 수를 예측합니다 식물에 신호입니다. 그러나, 칼슘에서 vivo에서 생물 긴장 중의 역할 아직도 명확 하지 않습니다. 이 프로토콜 hemipteran 해충에 의해 먹이 동안 식물에 칼슘 신호를 검출 하는 유전자 인코딩 칼슘 센서의 사용을 설명 합니다. Aphids와 같은 hemipterans 피어스와 세포의 작은 숫자, 길쭉한 mouthparts, 그들을 만드는 공장 부상 응답에서 고유 생물 긴장으로 직면 될 때 칼슘 역학을 공부 하는 이상적인 도구를 빠는. 또한, 형광 바이오 센서 신호 분자에 vivo에서 동물 및 식물의 측정 혁명. 곤충 먹이, 공간 및 시간 고해상도 동안 식물 칼슘 역학의 실시간 이미징은 칼슘 GFP 기반 바이오 센서, GCaMP3, 모델 식물 애기 thaliana 에서 표현 할 수 있습니다. 반복 하 고 강력한 분석 결과 하기 전에, 하는 동안, 그리고 곤충 먹이 후 cytosolic 칼슘 역학의 연속 측정에 대 한 수 있도록 분리 된 GCaMP3 잎의 형광 현미경 검사 법을 사용 하 여 개발 되었습니다. 이 분 이내에 발생 하는 사이트를 먹이 진딧물 주위 높은 지역화 빠른 칼슘 상승 밝혀. 애기 thaliana 사용 현상의 분자 분석을 촉진 하기 위하여 돌연변이의 급속 한 세대에 대 한 허용 하는 동안 프로토콜 추가 곤충 종 등 다른 생물 스트레스에 적응 될 수 있다.
Introduction
칼슘 (캘리포니아2 +) 식물에 가장 유비 쿼터 스 신호 요소 중 하나입니다. Cytosolic 캘리포니아2 + 농도에 일시적인 상승 ([캘리포니아2 +]cyt) 다운스트림 구성 요소의 복잡 한 네트워크에 의해 해독 되 고 모두 abiotic 및 생물 스트레스1,2응답에 관여. [캘리포니아2 +]cyt 상승 식물 방위 응답3,,45의 일반적인 부분을 형성 하는 미생물 elicitors에 첫 번째 응답 중 하나입니다. [캘리포니아2 +]cyt 상승 또한 씹는 곤충 lepidopterans6,7등으로 인 한 부상에 대 한 응답에서 관찰 되었습니다. 그러나,의 잠재적인 역할 Ca2 + 신호 응답에만 몇 가지 세포에 손상을 biotic 위협 살고 탐험 되지 않은 식물. 녹색 복숭아 진딧물 Myzus persicae hemipteran 곤충 세계 농업8,9에 중요 한 위협을 나타내는 이며 캘리포니아2 + 세포 외 공간에서 경과에 관찰 되었습니다 단풍 M. persicae10득실 거리는. 공장 Ca2 + 측정 하기 위한 강력 하 고 반복 가능한 방법 신호 M. persicae 는 형광 캘리포니아2 + 바이오 센서, aphids와 GCaMP3 제공 하는 소설 도구 사용 하 여 잎에서 공급 하는 동안이 프로토콜 개요 생물 상호 작용 동안 캘리포니아2 + 의 역할을 해 부.
캘리포니아2 +-선택적 microelectrodes 했다 이전 [캘리포니아2 +] 식물11,12을 측정 하는 데 사용 됩니다. 더 최근에, 발광 및 형광 접근 표준화 되 고 있다. 이 바이오 센서 바인딩할 캘리포니아2 + 그리고 발광, 캘리포니아2 + 세포와 전체 조직 역학 공부를 취소 비교할된 기회를 허용. 캘리포니아2 + 바이오 센서는 염료로 주사 하거나 안정적으로 변환 (즉, 유전자 인코딩 바이오 센서)를 통해 생물의 게놈 시퀀스를 코딩 하는 바이오 센서의 도입에 따라 생산 수 있습니다. 후자는 쉽게 subcellular 지 방화13의 능력과 살아있는 조직에 표현 되 고의 주요 이점을 제공 합니다. Aequorea 빅토리아 (해파리)에서 분리 된 aequorin 단백질은 첫 번째 유전자 인코딩된 Ca2 + 바이오 센서 식물14에 배포 했다. 발광 단백질으로 aequorin는 발 색 단 표백 및 autofluorescence15피하는 외부 빛에 의해 여기를 필요 하지 않습니다. Aequorin는 성공적으로 [캘리포니아2 +] 용 온도16, 병원 체17,,1819를 포함 하 여 다양 한 자극에 대 한 응답에서을 측정 하기 위해 사용 되었습니다, 그리고 소금 스트레스20 21, 그리고 부상7. 그러나, 그것은 상대적으로 낮은 신호 강도, 가난한 센서 식 어려운13조직에서 개별 셀에 [캘리포니아2 +] 용의 검출 하 여 불이익을.
캘리포니아2 + 바이오 센서는 형광 수의 개발 Ca2 + 역학의 자세한 subcellular 및 조직 수준 분석 함으로써 aequorin을 보완 했다. 하나는 가장 일반적인 형광 바이오 센서는 형광 공명 에너지 전달 (무서 워)-Cameleons를 기반으로. 무서 워 Cameleons는 두 개의 단백질, calmodulin 도메인 c f P-YFP 링커 지역에 캘리포니아2 + 의 바인딩에 의해 유도 하는 구조적 변화에 의해 가까운 접촉으로 초래한 YFP, 및 일반적으로 CFP의 구성 됩니다. 이 연락처 YFP, CFP에서 에너지의 전송 수 있으며 이러한 fluorophores의 형광의 결과 변화 [캘리포니아2 +]의 정확한 정량화에 대 한 형광 신호는 2에서의 비율의 계산을 통해 수 있습니다. fluorophores22. 무서 워 Cameleons 보다 우량 하다 aequorin 및 비 비율 형광 염료, 단백질23 식 수준에 의해 영향을 덜 하 고 자주 큰 형광 수확량으로 세포 및 subcellular 이미징23에 대 한 허용. 예를 들어 무서 워 Cameleons 식물에 장거리 Ca2 + 신호를 식별 하 고 세포 수준의24,,2526이 해결 하기 위해 최근 사용 되어 왔습니다.
최근 획기적인 형광 GFP 기반 Ca2 + 바이오 센서와 매우 민감한 단일-fluorophore (단일-FP) 바이오 센서의 개발 되었습니다. 단일-FP 바이오 센서는 단일의 원형으로 구성 permutated GFP 연결할 calmodulin 및 M13 펩 티 드, 캘리포니아2 + calmodulin 바인딩, 그래서 calmodulin GFP 사이 물 중재 반응 결과로 protonate GFP와 증가 형광 수익률27,,2829 단일-FP 센서 무서 워 Cameleons, 간단 하 게 실험 설계 및 이미징30의 잠재적으로 더 높은 시간 해상도 포함 하 여 여러 가지 이점을 제공 합니다. 비록 단일 FP 센서는 단순히 절대 [캘리포니아2 +] 계량 수 없습니다 무서 워 센서로 그들은 우수한 Ca2 + 의 시간적, 공간적 역동성의 분석 신호5,23대 한. GCaMPs best-established 단일-FP 센서28 중 하나 이며 그들의 형광 수율, 동적 범위, 캘리포니아2 + 선호도, 그리고 신호 대 잡음 비율31,32 를 향상 시키기 위해 여러 개정 받은 , 33 , 34.의 GCaMPs는 성공적으로 사용 되었다 동물 시스템에서 zebrafish 모터 뉴런35 와 과일 비행 neuromuscular 접속점34와 같은. GCaMP3의 임의의 mutagenesis 磁 GCaMP636 및 GECOs29포함 한 단일 FP 센서의 추가 클래스에 결과 있다. GECOs 했다 최근 측정 캘리포니아2 + 용 ATP, 카이, 및 세균성 elicitor flg22 애기 thaliana (이제부터 애기 라고도 함)에 사용 됩니다. 이 연구는 또한 R GECO 바이오 센서 최대 신호 변화와 신호 대 잡음 비율5점에서 무서 워 Cameleon YC3.6 실적이 증명.
사용, 형광 고수익, 그리고 GCaMP 바이오 센서와 함께 얻을 수 있는 높은 시간 해상도의 용이성 때문에 GCaMP3는 유전자 인코딩됩니다 애기 꽃 양배추 모자이크 바이러스 의 35S 발기인 아래. 유전 도구 애기 연구에 사용할 수 있는 GCaMP3에 의해 측정 캘리포니아2 + 신호의 상세한 분자 분석에 대 한 수 있습니다. 또한, GCaMP3 바이오 센서 costlier confocal 시스템 보다는 형광 현미경에서 구상 될 수 있다. 이 프로토콜은 이미징, 필수 라이브 biotic 스트레스와 함께 실험을 실시 하는 경우 전체 조직에 대 한 수 있습니다. 실험은 35S::GCaMP3 식물에서 분리 된 잎 벌레 탈출을 방지 하 고 제한 하는 특정 조직에 먹이를 물에 떠내려는 되도록 설계 되었습니다. 이 문서에서 설명 하는 방법 따라서 M. persicae 여 수 유 하는 동안 잎 캘리포니아2 + 역동성의 분석에 대 한 허용응답 신호는 새로운 식물의 특성의 결과. 이 방법은 추가 곤충 종 등 미생물 병원 체, 다른 생물 스트레스, 뿌리 등 다른 식물 조직에서 작동 또한 적응 수 있습니다.
Protocol
1. 공장 준비 (일 1-4)
- 하루에 1, 35S::GCaMP 씨 세 75% 에탄올 세척, 세척, 그리고 접시 당 1 분을 사용 하 여 100 m m 2에 광장 ¼ 강도 重 플라스틱 접시를 소독 하 고 Skoog (MS) 중간 (제조 법: Skoog와 村 重 매체, 자당, Formedium 한 천, 고 드 이온된 수 1 L의 10 g의 7.5 g의 1.1 g) 37.
- 동기 발 아를 8 ° C에서 3 일 동안 어둠 속에서 묘를 충.
- 실험의 날 4, GCaMP 묘 16 h 빛과 8 h 어두운 photoperiod와 23 ° C에서 제어 환경 룸 (CER) 이동.
2. 곤충 Rearing (일 11-12)
- 15 성인 M. persicae 5 주 된 토양에서 재배 애기 식물 촉촉한 아티스트를 사용 하 여 추가 실험의 날 11, ' (22 ° C 10 h 빛과 14 h 어두운 photoperio에서 CER에서 성장 s 페인트 브러쉬 (크기 2 또는 4) d).
- 공장 및 플라스틱 뚜껑 캡 투명 한 플라스틱 튜브 (10 cm x 15 cm)를 배치 하 여 식물에 aphids 케이지.
- 두고 24 h에 대 한 득실 거리는 진딧물 식물 22 ° C에서 CER에 16 h 빛과 어두운 photoperiod 8 h.
- 실험의 12 일에는 붓을 사용 하 여 모든 성인 M. persicae 제거.
참고: 곤충 식물에서 눈으로 볼 수 있습니다. 이 유사한 발달 나이로 nymphs의 인구를 제공합니다. 대략 성인 1 요정이이 기간 동안 생산 됩니다. - 두고 사는 식물 16 ° c 낮은 온도 CER에는 8 h 빛과 16 h 어두운 photoperiod, nymphs 크기가 너무 빠르게 증가 하지 않도록 하려면.
3. 초연 (주 19) 잎
- 실험의 날 19, CER에서 35S::GCaMP3 묘를 제거 하 고 날카로운가 위를 사용 하 여 각 공장에서 가장 큰 잎을 분리.
- 증류수, abaxial 표면 위로 향하도록 300 µ L을 포함 하는 96 잘 접시의 우물에 분리 된 잎을 배치, 핀셋의 쌍을 사용 하 여. 추가 잎 ( 그림 1)에 대 한 반복.
그림 1: 35S::GCaMP3 잎 분석 결과. 각 16 일 된 35S::GCaMP3 애기 종묘에서 가장 큰 잎은 분리 하 고 96 잘 접시에 증류수 300 µ L에 떠내려. 초연 후 찍은 사진. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 투명 한 플라스틱 포장 및 알루미늄 호 일 접시를 커버 하 고 가시고 초연의 스트레스 수 있도록 하룻밤 실 온에 두고.
4. 형광 현미경 검사 법 (일 20-22)
- 실험의 날 20, 알루미늄 호 일에서 96 잘 접시를 제거 하 고 형광 stereomicroscope에 그것을 전송. 450-490 nm 빛 GFP를 자극 하 고 500과 550 nm 사이 형광 방출 잡으려고 스테레오 형광 현미경을 구성.
- 토양에서 식물을 제거 하 고 뚜껑을 가진 투명 한 상자에 배치 하 여 11 일에 설립 하는 식민지에서 세 진 디를 수집 합니다. 실험을 수행 하는 동안 상자에 포함 된 곤충 보관.
- 현미경 96 잘 접시를 놓습니다. GCaMP3 형광 명확 하 게 분리 된 잎의 정 맥에 구상 될 수 있다 때까지 빛의 노출 변경. 모든 실험;에 대 한 지속적인 노출을 유지합니다 현재 프로토콜 1의 노출 3.5 ( 그림 2)의 증가 함께 사용 되었다.
- 그런 4 우물 한 프레임에서 관찰 될 수 있다 확대 및 현미경의 확대/축소를 조정, 현재 프로토콜에 대 한 확대 및-127.833 m m의 초점 X 7.8이 사용 되었다.
- 촉촉한 페인트 브러시를 사용 하 여 현미경 분리 된 잎을 한 진딧물을 전송. 컨트롤, 치료 하는 인접 한 잎 두고 하지만 가볍게 진딧물 전송 중 발생 하는 감동 모방을 붓으로 터치. 탈출에서 곤충을 방지 하기 위해 현미경 중 96 잘 접시 위에 다시 비닐 포장을 배치 해야.
- 클릭 하 여 쌍 (1 진딧물 처리와 치료 1) 잎의 형광 녹음 시작 " 실험을 시작 " 내장 현미경 소프트웨어 ( 그림 2). 50 분에 대 한 측정 기록
참고: 현재 프로토콜, 5의 시간 간격에 대 한 측정 사이 s 사용 되었다. - 후 50 분, 클릭 하 여 녹음을 중지 " 실험을 중지 "는 진딧물은 잎에서 제거 하 고. 이미지 파일 (예를 들어, 태그 이미지 파일 형식 TIFF)으로 형광 측정 저장.
- 잎의 쌍이 추가 실험을 반복, 영상 2 genotypes의 동시 이미징 수 있도록 잎의 2 쌍을 한 번에 이미지를 확장할 수 있습니다.
5. 데이터 수집
- 피지 (이미지 J)로 이미지 파일을 가져오고 클릭 하 여 32 비트 변환 " 이미지 " > " 유형 " > " 32 비트; " heatmap 비디오 (7 단계 참조)에 이미지의 변환에 대 한 수 있습니다.
- 삭제는 aphids 정착 하지 않는 5 분 이상에 대 한 하나의 위치에서 현미경 벌레 움직임을 확인 하 여 샘플.
참고: 이것은 종종 대부분의 샘플, 그리고 100 치료 최대 30 샘플을 전시 하 고 성공적인 정착을 찾을 해야 할 수 있습니다. - 픽셀 (또는 m m, 알려진 경우에 변환)에 측정 비율 및 시간 프레임 같은 시간 간격으로 사용 하는 현미경 검사 법 중 클릭 하 여 설정에 " 이미지 " > " 속성. "
- GFP 분석에 대 한 조직의 주변 관심 (ROI)의 지역 배치는 커서를 사용 하 여.
참고: 현재 프로토콜에서 직경에서 원형 투자 수익 50 픽셀 (0.65 m m)에 사용 되었다 관심의 3 위치: 사이트 (Fs), 잎 (Sm)의 midrib에 조직의 지역 및 조직의 지역에서 midrib에 인접 한 먹이 진딧물 (" 조직 측면 " Sl) ( 그림 2).- 타원을 그려서 ROI를 만듭니다 (사용는 " 타원형 도구 "), 및 크기를 사용 하 여 편집 " 편집 " > " 선택 " > " 지정. " 그림 2를 참조 하십시오.
- 치료 컨트롤에 대 한 치료 잎 (즉,는 진딧물 처리 잎에 먹이로 잎의 같은 지역)에서 선택한 그 잎의 유사한 지역에 ROIs를 선택 합니다 ( 그림 2).
그림 2: GCaMP3 형광 현미경 분석. 왼쪽: 치료 제어의 잎 오른쪽: 진딧물 처리 잎입니다. 진딧물의 먹이 사이트 화살촉으로 표시 됩니다. 눈금 막대 = 1. (A) 밝은 필드 이미지. 확대: 7.8 X, 초점:-127.833 m m, 노출: 1 미 (B) GFP 이미지 꾸밈ng ROIs 형광의 정량 분석에 사용. Fs 먹이 사이트, Sm = 조직 midrib, Sl = = 조직 측면 조직. 확대: 7.8 X, 초점:-127.833 m m, 노출: 1 s. GFP는 450에서 490 nm 금속 할로겐 램프를 사용 하 여 흥분 했다 그리고 형광 방출 500과 550 nm 사이 체포 됐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
- 시간 시리즈 분석 플러그인을 사용 하 여 클릭 하 여 " 플러그인 " > " 시간 시리즈 분석기 " 시간이 지남에 투자 수익에서 원시 형광 값 (F)를 분석 하. 관심의 투자 수익을 추가 (" 추가 [t] "). 투자 수익 선택 되어 있는지 확인 하 고 선택 " 평균; 얻을 "이 그 투자 수익에 각 프레임에 대 한 F 값의 테이블을 표시 합니다.
- 스프레드시트에이 데이터를 복사.
- 먼저 선택 영역을 사용 하 여 계산 하는 먹이 사이트 신호 영역에서 " 자유형 선택 도구. " 최대한 GFP 신호를 약술 하 고 다음을 클릭 하 여이 모양의 면적을 계산 " 분석 " > " 측정. "
- MTrackJ 플러그인을 사용 하 여 클릭 하 여 먹이 사이트 신호 속도 계산 " 플러그인 " > " 추적 " > " MTrackJ. "
- 클릭에는 " 추가 " 단추와 다음의 가운데에 커서를 클릭 합니다 그것은 처음 볼 때 신호입니다. 클릭 다시의 먼 지점에서 신호에 확산. 클릭 " 측정 "의 신호 속도 계산 하.
6. 데이터 분석
- 정의 피지에 현미경에서 이미지 프레임을 통해 재생 하 여 정착 하는 진딧물의 포인트.
참고: 정착의 시간 동안 5 분 이상에 대 한 단일 위치에는 진딧물 유지 프레임입니다. 이벤트를 정착의 기간 또한 피지에 이미지에서 산출 될 수 있다. - 정상화 방정식 δ/F는 F 데이터 (δ/F) = (F-F 0) /F 0, F 0가 평균 기준 형광은 진딧물 전에 녹음의 처음 60 프레임 이상 F의 평균에서 계산 정착. 치료 컨트롤에 대 한 반복.
- 치료 및 치료 되지 않는 잎에서 그 투자 수익에 대 한 시간이 지남에 정규화 된 GFP 형광 (δ/F)를 플롯합니다. 치료 컨트롤 표시 큰 캘리포니아 2 + 과도 (0.2 이상 즉, δ/F 상승) 샘플 (두 잎)를 버리고.
- 유전자 당 적어도 20-30 가능한 샘플 분석 되었습니다 때까지 반복.
7. 시간-과정 비디오 창조
- 변환 32 비트 이미지 파일을 클릭 하 여 NucMed_Image Lut 플러그인을 사용 하 여 heatmaps에 " 플러그인 " > " NucMed " > " 조회 테이블. " 조회 테이블 메뉴에서 선택 " 블루 그린 레드 " 열 지도를 이미지를 변환 하.
- 진딧물 elicited GFP를 강조 하기 위해 heatmap의 대비를 사용 하 여 신호 향상 " 프로세스 " > " 대비 향상 " > " 조정 포화 픽셀 %. "
- 추가 시간 정보를 클릭 하 여 시간 Stamper 플러그인을 사용 하 여 " 플러그인 " > " 시간 Stamper ". 설정에서 " 시작 시간 "에서 " 0 "와 " 간격 " 현미경 검사 법 (예를 들어, 5 s)에 사용 되는 시간 간격에 따라.
- 수출이 동영상으로는 오디오 비디오 인터리브 (AVI) 파일.
참고:이 비디오 다음 편집할 수 있습니다 (예를 들어, Microsoft Movie Maker) 다른 소프트웨어 패키지에 추가.
Representative Results
그림 3 와 그림 4 는 대표 치료 컨트롤과 진딧물 처리 잎을 비교 하는 실험에서 결과. GFP 형광에 매우 지역화 된 증가 볼 수 있습니다 먹이 사이트 샘플의 대부분에서 몇 분 이내 동안 Ca2 + 역학 치료 제어 잎 숙박에 상대적으로 안정적인 (그림 3A 와 3B). 그것은 또한 보조 증가 (그림 3B) 실험에서 초기 피크 후 GFP 형광 관찰 가능. 대우 잎의 최대 50%, aphids 정착 하지 않는 하 고 샘플을 폐기 한다. 정착 발생 샘플, 샘플의 27% 전시 하지 않는 명확한 증가 GFP 형광 (그림 3C 및 표 1); 먹이 사이트에서 따라서, 25-30 복제 샘플 정량 분석을 위해 평균 한다. 지역의 시각화 및 먹이 사이트 [캘리포니아2 +]cyt 상승의 속도 6 µ m/s (표 1)에서 여행 약 110 µ m의 신호를 계시 해야 한다. 또한, 아니 [캘리포니아2 +]cyt 도 진딧물 치료, 조직 midrib (그림 4A) 또는 조직의 측면 조직 영역 (그림 4B)에 따라 잎 내에서 체계적으로 감지할 수 한다. [캘리포니아2 +] 시간이 지남에cyt 역학의 대표적인 샘플 비디오 1에 표시 됩니다. 그것은 또한 수와 현미경 개별 안정화 이벤트의 기간을 추적 하 여 진딧물 안정화 동작을 분석할 수입니다. 이러한 동작에 대 한 대표적인 결과 aphids, 정착 하기 전에 약 10 분 걸릴이 평균 20 분 동안 지속 그들은 성공적으로 정착 할 때 보여주는 표 1에 표시 됩니다. 따라서, 곤충 [캘리포니아2 +]cyt 상승의 전체에 대 한 단일 위치에 침전 된다.
그림 3: GCaMP3를 사용할 수 있는 검색 진딧물 elicited Ca2 + 신호 분리 된 잎에 먹이 사이트에서. 왼쪽: 대표적인 흔적 (n = 30). 35S::GCaMP3 잎의 먹이 사이트 정규화 된 GFP 형광 (δ/F)의 추적 25 분 후 정착까지 정착 하기 전에 5 분을 표시 합니다. 제어 치료 35S::GCaMP3 잎에 해당 위치를 =. [캘리포니아2 +]cyt 상승 주위 사이트 35S::GCaMP3 잎에 먹이 진딧물의 오른쪽: 대표 stereomicroscope 이미지. GFP 형광 인세트 규모에 따라 색 이다. 화이트와 먹이 사이트에서 설명 하는 진딧물 id 화살촉 표시. 확대: 7.8 X, 초점:-127.833 m m, 노출: 1 s. GFP는 450에서 490 nm 금속 할로겐 램프를 사용 하 여 흥분 했다 그리고 형광 방출 500과 550 nm 사이 체포 됐다. (A)는 큰 진딧물 유도 [캘리포니아2 +]cyt 상승의 예. (B) 평균 진딧물 유도 [캘리포니아2 +]의 예로cyt 상승. (C) 아무 진딧물 유도 [캘리포니아2 +]cyt 상승의 예. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 매개 변수 | 평균 (± SEM) |
| [캘리포니아2 +] cyt 상승 | |
| [캘리포니아2 +]cyt 고도 표시 하는 샘플의 백분율 | 73% |
| 웨이브 프론트는 는 의 속도 | 5.9 µ m/s (± 0.6) |
| 확산의 최대 영역 | 110 µ m2 (± 18) |
| 진딧물 행동 | |
| 침전의 수 (> 5 분) | 2 (± 0.1) |
| 침전 (모든 기간)의 총 수 | 3.8 (± 0.4) |
| 시간 b 이미징에 대 한 정착 | 20 분 (± 2) |
| 첫 번째 정착 c 까지 시간 | 11 분 (± 1.4) |
| 정착 하는 총 시간 비율 | 62% (± 3) |
표 1: [캘리포니아2 +]cyt 상승 및 35S::GCaMP3 동안 진딧물 동작 매개 변수 화상 진 찰. 매개 변수 계산의 어떤 정착 가능한 샘플에서 > 5 분 발생. 의 먼 지점에 개시의 시점에서 보이는 신호 (A) 속도. 형광의 분석을 위해 사용 된 초기 정착 이벤트의 (B) 기간입니다. 영상의 시작과 첫 번째 진딧물 사이의 시간 (C) 길이 정착. [캘리포니아2 +] cyt 고도 데이터는 식물 세포에 이전 제출 (현재 상태: QC 초기).
그림 4: GCaMP3 진딧물 elicited 캘리포니아2 + 신호 체계 먹이 사이트를 검색할 수 없습니다. 대표 흔적 (n = 30) 먹이 사이트에서 진딧물을 조직의 위치에 표준화 된 GFP 형광 (δ/F)의 35S::GCaMP3 나뭇잎. 추적 25 분 후 정착까지 정착 하기 전에 5 분을 표시 합니다. 제어 치료 35S::GCaMP3 잎에 해당 위치를 =. (A) / F δ 조직의 midrib 지구에서. (B) δ/체계적 측면 조직 영역에서 F. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
비디오 1: GCaMP3 개화에 시간 진딧물 피드. GFP 형광 인세트 규모에 따라 색 이다. 진딧물의 먹이 사이트의 위치는 화살촉으로 표시 됩니다. 왼쪽: 35S::GCaMP3 겹 판은 M. persicae 성인에 노출 오른쪽: 35S::GCaMP3 no-진딧물 제어 잎. 이 비디오를 보려면 여기 클릭 하십시오 (다운로드 오른쪽 클릭.)
Discussion
이 문서에서 설명 하는 방법을 수 있습니다 식물의 실시간 분석에 대 한 Ca2 + 곤충 먹이 등 생물 긴장 동안 신호. 그것은 그 같은 위협에 대 한 첫 번째 공장 응답 중 하나는 지역화 [캘리포니아2 +]cyt 상승 먹이 사이트는 곤충의 보여 줍니다. 이 방법은 허용 한다 돌연변이, 사용은 이전에 불가능 했던 같은 신호 분자 및 생리 적 특성. 이 프로토콜에서 중요 한 단계는 분리 된 잎 인지 확인 하지 지나치게 방해 분리 과정 (3.2 단계) 또는 (4.5 단계) 잎에 곤충을 전송할 때. 현재 프로토콜의 절대 농도 보다는 [캘리포니아2 +]cyt 상대 측정을 제공 합니다, 그는 현미경 설정 실험 내내 일정 하 게 유지는 생명 이다. 또한 인간의 편견에 대 한 잠재적인 ROIs의 선택 하 고 데이터를 분석 하는 동안 이며 따라서 것이 좋습니다 실험 더블 블라인드를 실시 하 고 있습니다.
이 프로토콜 생물 긴장 동안 [캘리포니아2 +]cyt 측정 몇 가지 중요 한 이점이 있다. 첫째, 형광 고수익으로 단일 fluorophore의 사용 이미지를 confocal 현미경을 사용 하 여 보다 적은 비용을 stereomicroscope에 실시 수 있습니다. 단일 fluorophore의 사용 또한 게 데이터 수집 및 분석 간단 한 측정 기록으로. 또한,는 stereomicroscope 사용 하 여 수 있습니다 전체 잎의 이미징에 대 한 큰 공간 규모에서 발생 하는 진딧물 식물 상호 작용을 포함 한 많은 생물 상호 작용을 필수입니다. 이미지의 높은 시간 해상도 GCaMP3, 바인딩23,30 및 형광 고수익 후 Ca2 + 센서에서의 급속 한 분열에 따라 가능한 캡처, 측정을 최대 허용 모든 5 s. 또한, 잎 분석 결과 곤충, 전체 식물에 (준비 중)에서같은 실험을 실시 하는 단계를 제한 하는 키의도 주를 방지 합니다. 분리 된 잎은 또한 곤충 전에, 동안, 그리고 수 유 후 Ca2 + 역동성의 분석에 대 한 수 있도록 미리 정의 된 위치에서 피드 확인 합니다. 이 프로토콜은 또한 잎의 유사한 발달 단계 분석을 위해 사용 됩니다 보장 합니다.
이 프로토콜의 주요 단점은 비 비율 바이오 센서의 사용에서 유래. 단일-FP 바이오 센서와 GFP 방출에 변화 [캘리포니아2 +]cyt, 휴대 전화, 모션, 또는 식 수준에서 바이오 센서의 변화 같은 다른 실험 변수에서 발생할 수 있습니다. 이러한 문제는 발생 하지 마세요 Cameleons와 무서 워, 동안으로 CFP에서 YFP 에너지의 전송만 Ca2 + 바인딩 때 발생 합니다. 개별 fluorophores의 형광 속성을 변경 하는 다른 조건 하지 CFP와 YFP, 강도에 반대 변경 모방과에 대 한 측정을 정규화 하는 기본적으로 사용 되는 비율 계산 다른 광학 유물23,30. 이것은 절대 [캘리포니아2 +]cyt 의 의견을 더 무서 워 Cameleons 믿을 수 있는. 따라서, GCaMP3는 가장는 바이오 센서로 측정 하 사용 상대 [캘리포니아2 +]cyt, 검출 하 고 식물5,(in preparation)에 생물학 현상의 특성을 여전히 충분 하지만. 따라서 컨트롤을 사용 하 여 관찰 된 효과 캘리포니아2 +, 캘리포니아2 +등 때문에 필수적 이다-(준비)에 유전 돌연변이 또는 약리학 Ca2 + 채널 억제제 라 3 +등 관련 . 중요 한 것은, 단일 FP 바이오 센서를 일반적으로 큰 형광 수율 및 (즉, 캘리포니아2 + 바인딩 시 개화 증가)에 무서 워 Cameleons23, GCaMP에 더 적합 하 게 보다 큰 동적 범위 표시 조직 수준 이미지, 무서 워 Cameleons는 confocal 현미경5,25세포 이미징에 대 한 유용한 도구입니다.
이 프로토콜을 실행 하는 동안 몇 가지 문제가 문제 해결 해야 하는 발생 가능 하다. 예를 들어 그 샘플 컨트롤 (치료) 잎 디스플레이 대형 [캘리포니아2 +]cyt 고도 (단계 6.3)를 삭제 하는 것이 좋습니다. 이러한 과도 대부분 현미경 검사 법에 의해 유도 된 스트레스의 결과입니다. 실제로, 푸른 빛38,39,,4041, 신호 유도 캘리포니아2 + 그리고 고 강도 빛 온도 및 삼투성 긴장에 또한 발생할 수 있습니다 알려져 있다 둘 다 또한 [캘리포니아2 +]cyt 도21,,2542유도. 따라서, 이러한 스트레스를 줄이기 위해, 통풍이 잘 되 고 온도 제어 실에서 실험을 수행 하 고 불필요 하 게 긴 노출 시간을 피하기 위해 중요 하다. 그것은 또한 분리 또는 터치 elicited [캘리포니아2 +]cyt 고도43,,4445를 방지 하기 위해 현미경 나뭇잎을 지나치게 방해 하지 해야. 문제 또한 곤충 정착으로 발생할 수 있습니다. M. persicae와 곤충 여러 샘플에서 잎에 침전 하지 않습니다. 이 상처 elicited 방어47분리 잎46,또는 파란 빛에 의해 곤충의 소요의 결과 수 있습니다. 실제로, M. persicae 에 비전 3 대뇌, 490 nm48의 피크 감도를 포함 하 여 적용 됩니다. 현미경 노출 줄이고 주의 aphids을 처리 고통을 감소 되 고 정착을 장려.
현재 종이에 설명 된 프로토콜 식물 곤충 상호 작용의 분자 이해와 생물 긴장에 식물 응답에 새로운 통찰력을 제공 합니다. 그것은 곤충 먹이에 대 한 첫 번째 공장 응답 중의 시각화과 더 조사 사용할 수 있는 상당한 애기 유전 자원 사용을 용이 하 게 합니다. 또한,이 프로토콜 허용, 살아있는 유기 체를 사용 하 여 반대로 추출49 또는 elicitors50합니다. 미래에이 기술을 적용할 수 있습니다 abiotic 스트레스 뿐만 아니라 추가 곤충 종, 선 충, 미생물 병원 체 등 생물 다른 스트레스에. GCaMP3 현미경 검사 법은 또한 다른 식물 조직, 잎, 또는 심지어 전체 식물에 대체 ROIs 이미지를 수정할 수 있습니다. 또한, 유전적 수 바이오 센서에 대 한 잠재력이 있다서둘러 추가 식물 종에 인코딩된입니다. 따라서,이 문서에서 설명 하는 프로토콜의 캘리포니아2 + 식물 및 다른 종 간의 소설 생물 상호 작용의 범위에 신호 분자 기초 위장을 가능성이 있다.
Disclosures
저자는 선언 하는 관심의 없습니다 충돌 있다.
Acknowledgments
우리는 현미경 검사 법에 관한 조언을 부여 칼더 (존이 네 스 센터, 영국)을 감사 하 고 싶습니다. 저자는 또한 존 인 스 센터 원 예 및 그들의 지원에 대 한 곤충학 부서 감사 하고자 합니다. B/JJ004561/1는 BBSRC와 존 인 스 재단에서 부여이 작품에서 존 인 스 재단 (TV), 박사 재학에 의해 지원 되었다 (T.V., 석사, J.C., S.M., 상훈, T.M., 및 D.S.), 산업 배치 존 인 스 센터 (석사)에서 1 년 영국 (제), JST 프레스 토 (몬태나), 및 보조금 MCB 1329723 및 국립 과학 재단 (몬태나 및 상기)에서 IOS-1557899의 생 화 확 적인 사회에서 여름 재학.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
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