Summary
Этот протокол определяет простой метод для анализа сигналов кальция в растениях, порожденных кормления членистохоботные насекомых, таких как тли. Резуховидка преобразована с GFP биосенсор кальция GCaMP3 позволяют для изображений в реальном времени в vivo кальция динамики с высоким временным и пространственным разрешением.
Abstract
Ионы кальция, по прогнозам, быть Основные сигнальные подразделения во время биотических взаимодействия с кальция сигнализации, установленные частью реакции обороны завода микробной elicitors и ранив вызванных жевательные насекомых, вызывая системных кальция сигналы в растениях. Однако роль кальция в vivo во время биотического стресса до сих пор неясно. Этот протокол описывает использование генетически закодированный кальция датчика обнаружения сигналов кальция в растениях во время кормления членистохоботные вредителей. Hemipterans как тли проколоть небольшое количество клеток с специализированными, удлиненные, сосание ротовые, что делает их идеальным инструментом для изучения динамики кальция когда растение сталкивается с биотического стресса, который отличается от ранив ответа. Кроме того флуоресцентный биодатчики революционизируют измерения сигнальной молекулы в естественных условиях в животных и растений. Выражая биосенсор на основе GFP кальция, GCaMP3, в модели растение Arabidopsis thaliana позволяет в реальном времени изображений растений кальция динамики во время кормления, с высоким пространственным и временным разрешением насекомых. Надежные и повторяемые пробирного был разработан с помощью микроскопии флуоресцирования отдельностоящий GCaMP3 листьев, позволяя для непрерывного измерения динамики цитозольной кальция до, во время и после кормления насекомых. Это свидетельствует о весьма локализованные быстрого кальция высоты вокруг тля кормления сайта, который происходит в течение нескольких минут. Протокол может быть адаптирована к других биотических стрессов, например дополнительных видов насекомых, в то время как использование Arabidopsis thaliana для быстрого поколения мутантов позволяет облегчить молекулярный анализ этого явления.
Introduction
Кальций (Ca2 +) является одним из наиболее распространенным сигнальных элементов в растениях. Временный рост в цитозольной Ca2 + концентрации ([Ca2 +]cyt) декодируется в сложной сети компонентов нисходящего потока и участвует в ответ на оба абиотических и биотических стрессов1,2. Рост [Ca2 +]cyt является одна из первых реакций микробной elicitors, формирование общей частью4,3,завод обороны ответ5. Растет в [Ca2 +]cyt наблюдались также в ответ на ранение, вызванные жевательные насекомых, таких как триплоидная6,7. Однако потенциальная роль растений Ca2 + сигналов в ответ жить биотических угроз, которые вызывают повреждения только несколько клеток не были изучены. Зеленый персик тля Myzus persicae членистохоботные насекомое, которое представляет собой значительную угрозу для мирового сельского хозяйства8,9, и Ca2 + измеряем из внеклеточного пространства наблюдается в листья зараженная с . м. persicae10. Этот протокол описывает метод надежные и повторяемые для измерения завод Ca2 + сигналов а . м. persicae кормить из листьев, с использованием флуоресцентных Ca2 + биосенсор, тли и GCaMP3 предлагает новые инструменты для вскрыть роль Ca2 + в биотических взаимодействий.
CA2 +-селективный микроэлектродов ранее использовались для измерения [Ca2 +] в11,растений12. Совсем недавно стали стандартизированных биолюминесцентных и флуоресцентные подходы. Эти биодатчики связывают Ca2 + и испускают свет, позволяя ООН параллельно возможности для изучения Ca2 + динамика в клетки и всей ткани. CA2 + биодатчики может быть вставлен как красители или стабильно производится после введения биосенсор кодирования последовательности в геном организма через преобразования (то есть, генетически закодированный биосенсоры). Последний предлагает основные преимущества легко выражается в живой ткани и способных субцеллюлярные локализации13. Экворин белок, изолированных от Aequorea victoria (медузы) был первым генетически закодированный Ca2 + биосенсор развернуты в растения14. Как биолюминесцентных белков Экворин не требует возбуждения внешний свет, который избегает хромофора отбеливания и аутофлюоресценция15. Экворин успешно используется для измерения [Ca2 +] потоков в ответ на различные стимулы, в том числе температура16, патогенов17,18,19, соль подчеркнуть20 ,21и ранив7. Однако это является неблагоприятном положении относительно низкий сигнал интенсивности, что делает обнаружение [Ca2 +] потоков в отдельных клетках и тканях с плохой датчик выражение трудно13.
Разработка Ca2 + биодатчиков, которые могут флуоресцировать дополняет Экворин, позволяя для детального анализа субцеллюлярные и тканевом уровне Ca2 + динамики. Одним из наиболее распространенных флуоресцентные биодатчики являются передачи энергии резонансной флюоресценции (ЛАДА)-на основе Cameleons. Лада Cameleons состоят из двух белков, обычно CFP и рекламы ЯФП, которые принесены в тесный контакт конформационные изменения, вызванные связывание Ca2 + Кальмодулин домен в регионе компоновщика СЛП-рекламы ЯФП. Этот контакт позволяет рекламы ЯФП передачи энергии от СЛП, и результирующие изменения в флуоресцировании этих флуорофоров позволяет для точного количественного определения [Ca2 +] через расчет коэффициента флуоресценции сигналов от двух флуорофоров22. Лада Cameleons превосходят Экворин и не ratiometric флуоресцентными красителями, как они что меньше влияет на уровень экспрессии белка23 и часто имеют большую доходность флуоресцентные, позволяя на клеточном и субклеточном изображений23. Например лад Cameleons были недавно использовали для определения междугородних Ca2 + сигналов в растениях и решить их на клеточном уровне24,25,26.
Недавний прорыв с флуоресцентные GFP-основе Ca2 + биодатчики была разработка биосенсоров высокочувствительный сингл Флюорофор (сингл FP). Биодатчики сингл-FP состоят из одного циркулярно permutated GFP связан с Кальмодулин и M13 пептид, с Ca2 + привязка к Кальмодулин, что привело к воде опосредованной реакции между Кальмодулин и GFP так protonate GFP и увеличение Флуоресцентный доходность27,,2829. Одноместный-FP датчики предлагают несколько преимуществ над Cameleons ладу, включая проще экспериментальный дизайн и потенциально временным разрешением изображений30. Хотя одно FP датчики не может количественно абсолютной [Ca2 +] как просто как датчики ладу, они превосходят для анализа динамики временных и пространственных Ca2 + сигналов5,23. GCaMPs являются одним из насчитывающий сингл FP датчики28 и претерпели некоторые изменения для повышения их флуоресцентных урожайности, динамический диапазон, Ca2 + близость и соотношения сигнал шум31,32 , 33 , 34. GCaMPs успешно используются в системах животных, таких как данио рерио двигательных нейронов35 и фруктов летать нервно развязок34. Случайные мутагенеза GCaMP3 привело к дополнительные классы сингл FP датчиков, включая сверхчувствительная GCaMP636 и GECOs29. GECOs недавно использовались в проростках Arabidopsis thaliana (далее арабидопсиса) для измерения Ca2 + потоков в ответ СПС, хитин и бактериальных elicitor flg22. Это исследование также продемонстрировал, что R-GECO биосенсор превысил Cameleon YC3.6 ладу с точки зрения максимального сигнала изменения и сигнал шум коэффициент5.
Из-за простоты использования, флуоресцентный высокодоходных и высокой временное разрешение, которое может быть достигнуто с GCaMP биосенсорах GCaMP3 был генетически закодированы в проростках Arabidopsis под вируса мозаики цветной капусты 35S промоутер. Генетической инструменты для выращивания арабидопсиса исследований позволяют для детального анализа молекулярного Ca2 + сигналов измеряется GCaMP3. Кроме того GCaMP3 биосенсор могут быть визуализированы под микроскопом флуоресценции, вместо того, чтобы дороже конфокальный системы. Этот протокол позволяет целом ткани изображений, необходимых при проведении экспериментов с живой биотических стрессов. Этот эксперимент разработан таким образом, что отдельные листья из 35S::GCaMP3 растений плыли в воде, чтобы предотвратить насекомых побег и ограничить питание к конкретной ткани. Метод, изложенных в настоящем документе таким образом позволяет для анализа листьев Ca2 + динамика во время кормления, м. persicae, приводит в характеристике Роман завода сигнализации ответ. Этот метод также может быть адаптирована для работы с других биотических стрессов, таких дополнительных видов насекомых и патогенных микроорганизмов и других растительных тканей, таких как корни.
Protocol
1. завод подготовка (дни 1 - 4)
- на 1 день, стерилизовать 35S::GCaMP семена, используя три 75% этанола моет, 1 мин на мойка и плита их на 100 мм 2 Квадратные пластиковые пластины с ¼-сила фотосинтетическую и Средний Скуг (МС) (рецепт: 1,1 g фотосинтетическую и Скуг среды, 7,5 г сахарозы, 10 г Formedium агар, и 1 Л деионизированной воды) 37.
- Стратифицировать саженцев в темноте за три дня на 8 ° C до получения синхронных всхожесть.
- На 4 день эксперимента, переместить GCaMP саженцев в контролируемой среде комнату (CER) при 23 ° C, с 16 ч свет и 8 h темные фотопериода.
2. Насекомых воспитания (дни 11 - 12)
- на 11 день эксперимента, добавьте 15 взрослых м. persicae 5-недельных почвы выросли Arabidopsis растений с помощью влажной художник ' s кисть (размер 2 или 4) (выращенных в CER-области при 22 ° C с 10 ч света и 14 h темный photoperio d).
- клетка тли на заводе, поместив очистить пластиковые трубы (10 x 15 см) вокруг растений и шапочка с пластиковой крышкой.
- Оставить тля зараженных растений для 24 h в CER при 22 ° C с свет 16-h и 8-h темные фотопериода.
- На 12 день эксперимента, удалите все взрослые м. persicae, с помощью малярной.
Примечание: Насекомых можно увидеть глазом на заводе. Это дает население нимфы с аналогичного развития возраста. Примерно в течение этого периода будут производиться 1 Нимфа взрослого. - Оставить зараженных растений в нижнем температура CER на 16 ° C, с 8 h свет и 16 h темные Фотопериод, чтобы предотвратить слишком быстро увеличивается в размерах нимф.
3. Лист отряд (день 19)
- на день 19 эксперимента, удалите 35S::GCaMP3 саженцев из CER и отсоединение крупнейших листьев от каждого растения с помощью острых ножниц.
- Используя пинцет, место отдельный лист в колодец 96-луночных пластины, содержащий 300 мкл дистиллированной воды, abaxial поверхности, обращенной. Повторите эти действия для дополнительных листья ( рис. 1).
Рисунок 1: Assay листьев 35S::GCaMP3. Большой лист от каждого 16 день старый 35S::GCaMP3 арабидопсиса Рассада отсоединения и плыл на 300 мкл дистиллированной воды в 96-луночных пластине. Снимок сделан на следующий день после отряда. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- накладка в прозрачной пластиковой пленкой и алюминиевой фольгой и оставить при комнатной температуре на ночь, чтобы разрешить стресс отряда спадать.
4. микроскопии флуоресцирования (дней 20 - 22)
- на 20-й день эксперимента, удалить пластину 96-луночных из алюминиевой фольги и передачи его флуоресценции стереомикроскопом. Настроить стерео флуоресцентным микроскопом возбуждают GFP с 450-490 Нм свет и захватить Флуоресцентные выбросов между 500 и 550 Нм.
- Собирать возрасте тлей от колонии создан на 11 день, удалив растения из почвы и поместив его в прозрачной коробке с крышкой. Держать насекомых, содержащийся в поле во время проведения эксперимента.
- Место пластину 96-луночных под микроскопом. Измените освещенности до тех пор, пока флуоресценции GCaMP3 можно четко визуализируется в венах отдельностоящий листьев. Держите воздействия постоянным для всех экспериментов; для текущего протокола, 1-s воздействия был использован с коэффициентом усиления 3.5 ( рис. 2).
- Настроить масштаб и масштаб микроскопа таким образом, что 4 скважины можно наблюдать в одном кадре; для текущего протокола, было использовано 7.8 X увеличение и фокус-127.833 мм.
- Передачи тли один отдельный лист под микроскопом с помощью влажной кистью. Оставьте прилегающие листья, лечить как элемент управления, но слегка прикоснуться к ней с кисть для имитации прикосновения, что происходит во время передачи тля. Не забудьте поместить полиэтиленовой пленкой обратно на вершине 96-луночных пластины при микроскопии для предотвращения побега насекомое.
- Начала записи флуоресценции листьев в парах (1 тля лечить и не лечить 1), нажав " начало эксперимента " в программное обеспечение встроенных микроскоп ( рис. 2). Запись измерения для 50 мин
Примечание: для текущего протокола, интервал времени 5 s между измерениями использовался. - После 50 мин, остановить запись, нажав на " остановить эксперимент " и удалите тля из листьев. Сохранить измерения флуоресценции как файлы изображений (например, Теги формат файлов изображений, TIFF).
- Повторить эксперимент с дальнейшей парами листьев; изображений может быть расширен для изображения 2 пары листьев сразу, позволяющей одновременные снимки 2 генотипы.
5. Сбор данных
- импортировать файлы изображений в Фиджи (изображение J) и конвертировать их в 32 бита, нажав на " изображение " > " типа " > " 32-битный; " это позволяет для преобразования изображения в heatmap видео (см. шаг 7).
- Отмена образцах, в которых тлей не поселиться в одном месте более 5 мин, просмотрев насекомых движение под микроскопом.
Примечание: Это часто большинство образцов, и вплоть до 100 процедур может потребоваться найти 30 образцов экспонируется успешного урегулирования. - Установить шкалу измерений пикселей (или преобразовать в мм, если они известны) и сроки же интервал времени используется при микроскопии, нажав на " изображение " > " свойства. "
- С помощью курсора, место региона интерес (ROI) вокруг области ткани для анализа GFP.
Примечание: В текущем протоколе, круговой ROI 50 пикселей (0,65 мм) в диаметре был использован в 3 точках интереса: тля кормления сайта (Fs), системный регион на жилки листа (Sm) и системный регион, прилегающих к жилки (" боковые ткани " Sl) ( Рисунок 2).- Создать ROI с рисования овал (используйте " овал инструментом ") и изменить размер с помощью " редактировать " > " выбор " > " укажите. " Рисунок 2.
- Для необработанных элемента управления, выберите ROIs в сопоставимых регионах листа для выбранных на обработанных листьев (то есть, того же региона листа как где тля кормили на обработанных листьев) ( Рисунок 2).
Рисунок 2: анализ GCaMP3 флуоресценции под микроскопом. Слева: неочищенные управления лист. Справа: тля лечение лист. Тля кормления сайта обозначается стрелкой. Шкалы бар = 1 mm. (A) светлые области изображения. Увеличение: 7.8 X, фокус:-127.833 мм, воздействия: 1 расцве изображения GFP s. (B)нг трансформирования, используется для количественного анализа флуоресценции. FS = питание сайте, Sm = системный жилки, Sl = системный боковых ткани. Увеличение: 7.8 X, фокус:-127.833 мм, воздействия: 1 s. GFP был взволнован с использованием 450-490 Нм металлогалогенные лампы, и флуоресцентные выбросов был захвачен между 500 и 550 Нм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
- использовать плагин время серии анализатор, нажав " плагины " > " время серии анализатор " для анализа значения сырье флуоресцирования (F) в ROI с течением времени. Добавьте ROI интерес (" добавить [t] "). Убедившись, что выбрана ROI, выберите " получить среднее; " это будет отображать таблицу значений F для каждого кадра в что ROI.
- Скопировать эти данные в электронную таблицу.
- Вычислить площадь питания сигнала сайта, сначала выбрав региона с помощью " руки выбора инструмента. " наброски максимальный сигнал GFP и затем вычислить площадь этой фигуры, нажав " анализ " > " мера. "
- Вычислить скорость подачи сигнала сайта с помощью MTrackJ плагина, нажав " плагины " > " отслеживания " > " MTrackJ. "
- нажмите на " добавить " кнопку и нажмите курсор в центре сигнал, когда он первый видимый. Нажмите снова на краю сигнала в его дальней точке распространения. Нажмите кнопку " меры " чтобы вычислить скорость сигнала.
6. Анализ данных
- определить точки тля, урегулирования, играя через фотошоп от Микроскоп на Фиджи.
Примечание: Время урегулирования является кадр, в течение которого тля остается в одном месте для 5 минут или более. Продолжительность урегулирования события также могут быть рассчитаны с изображениями в Фиджи. - Нормализации данных F (ΔF/F) согласно уравнение ΔF/F = (F - F 0) / f 0, где 0 F является средний базовый флуоресценции рассчитано исходя из среднего F за первые 60 кадры записи перед тля поселились. Повторите эти действия для управления необработанными.
- Участок нормализованных GFP флюоресценция (ΔF/F) со временем для что ROI в обработанных и необработанных листьев. Отменить образцы (как листья), если необработанные управления показывает большой Ca 2 + транзиентов (т.е., ΔF/F поднимается выше 0,2).
- Повторять до тех пор, пока по крайней мере 20-30 жизнеспособные образцы были проанализированы в генотипе.
7. Создание видео-курс
- Преобразование 32-разрядного образа файлы в карты, с помощью NucMed_Image ТМП плагина, нажав " плагины " > " NucMed " > " таблицы подстановки. " выберите в меню таблицы подстановки, " синий зеленый красный " с конвертировать изображения в тепловых карт.
- Усилить контраст heatmap выделить GFP вызвало тлей сигналов с использованием " процесс " > " повысить контраст " > " настроить насыщенных пикселей %. "
- Добавление времени информации с помощью штампа времени плагина, нажав на " плагины " > " штампа времени ". Установите " время начала " на " 0 " и " интервал " основанный на интервал времени, используемый для микроскопии (например, 5 s).
- Экспорта это видео как чередование аудио-видео файлов (AVI).
Примечание: Это видео затем может быть отредактирован в другие пакеты программного обеспечения (например, Microsoft Movie Maker).
Representative Results
Рисунок 3 и Рисунок 4 , представитель результаты эксперимента, сравнивая тля лечение лист с необработанной управления. Сильно локализованные увеличение GFP флуоресцирования можно увидеть вокруг кормления сайта в течение нескольких минут в большинстве образцов, в то время как Ca2 + динамика в необработанной управления лист пребывания относительно стабильные (Рисунок 3А и 3Б). Это также можно наблюдать среднее увеличение в флуоресцировании GFP после первоначального пик в некоторых экспериментах (рисунок 3B). До 50% обработанных листьев тлей не соглашайтесь и образцы должны быть отброшены. Образцов, в которых происходит урегулирование 27% проб не демонстрируют четкое увеличение в флуоресцировании GFP вокруг кормления сайта (рис. 3 c и Таблица 1); Таким образом 25-30 реплицировать образцы должны усредняться для количественного анализа. Визуализация области и скорость кормления сайта [Ca2 +]cyt фасада должна выявить сигнал около 110 мкм, путешествуя на 6 мкм/s (Таблица 1). Кроме того не фасадыcyt [Ca2 +] должно быть обнаружено системно в пределах листа на тли лечения, либо в системный жилки (рис. 4A) или системных боковых ткани регионах (рис. 4B). Репрезентативной выборки [Ca2 +]cyt динамику с течением времени показано в видео 1. Это также можно анализировать поведение усадки тля, отслеживая количество и продолжительность отдельных урегулирования событий под микроскопом. Представитель результаты для этих поведений приведены в таблице 1, показывая что тли принять около 10 мин до урегулирования, и когда они успешно решить, это в среднем длится 20 минут. Таким образом насекомых поселились в одном месте для всей высотыcyt [Ca2 +].
Рисунок 3: GCaMP3 может использоваться для обнаружения тля-вызвал Ca2 + сигналы на сайте кормления в отдельные листья. Слева: представитель следы (n = 30) нормализованных GFP флуоресцирования (ΔF/F) вокруг кормления сайта 35S::GCaMP3 листа. Следы отображения 5 мин до урегулирования до 25 мин после урегулирования. Управление = эквивалентных местоположение на необработанных 35S::GCaMP3 листьев. Справа: представитель стереомикроскопом изображение [Ca2 +]cyt фасада видел вокруг тля, кормления сайта на лист 35S::GCaMP3 . Флуоресценции GFP цветом согласно шкале врезные. Идентификатор тля, изложенные в белом и кормления сайта обозначается стрелкой. Увеличение: 7.8 X, фокус:-127.833 мм, воздействия: 1 s. GFP был взволнован с использованием 450-490 Нм металлогалогенные лампы, и флуоресцентные выбросов был захвачен между 500 и 550 Нм. (A) пример большой тля индуцированной [Ca2 +]cyt возвышения. (B) пример среднем тля индуцированной [Ca2 +]cyt фасада. (C) пример не тля индуцированной [Ca2 +]cyt возвышения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Параметр | Средний (± SEM) |
| [Ca2 +] CYT фасада | |
| Доля проб, отображение рельефаcyt [Ca2 +] | 73% |
| Скорость волнового фронта | 5.9 мкм/s (± 0,6) |
| Максимальная площадь распространения | 110 мкм2 (± 18) |
| Тля поведение | |
| Количество оседает (> 5 мин) | 2 (± 0,1) |
| Общее количество оседает (все длительности) | 3.8 (± 0,4) |
| Время поселились для визуализации b | 20 мин (± 2) |
| Время до первого поселиться c | 11 мин (± 1.4) |
| Процент общего времени, затраченного поселились | 62% (± 3) |
Таблица 1: [Ca2 +]cyt фасада и тля параметры поведения во время 35S::GCaMP3 изображений. Параметры рассчитываются от жизнеспособные образцы в котором заселение > произошло 5 мин. (A) скорость видимый сигнал от точки начала до дальней точке распространения. (B) продолжительность первоначального урегулирования события, используемые для анализа флуоресценции. (C) продолжительность времени между началом изображений и первый тля урегулировать. [Ca2 +] данные высоты CYT , ранее представленные в растительной клетке (текущий статус: первоначальные КК).
Рисунок 4: GCaMP3 не может обнаружить тля вызвал Ca2 + сигналов системного кормления сайта. Представитель следы (n = 30) нормализованных GFP флуоресценции (ΔF/F) в местах системных тля кормления сайта в листьев 35S::GCaMP3. Следы отображения 5 мин до урегулирования до 25 мин после урегулирования. Управление = эквивалентных местоположение на необработанных 35S::GCaMP3 листьев. (A) ΔF/F в регионе системных жилки. (B) ΔF/F в регионе системных боковых ткани. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Видео 1: GCaMP3 цветения течением времени как тля каналы. Флуоресценции GFP цветом согласно шкале врезные. Расположение узла питания тля обозначается стрелкой. Слева: 35S::GCaMP3 листья подвергаются м. persicae взрослых. Справа: 35S::GCaMP3 без тля управления лист. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Discussion
Метод, описанный в этом документе позволяет в реальном времени анализ растений Ca2 + сигнализации во время биотического стресса, такие как Насекомое кормления. Это показывает, что одним из первых растений ответы на такие угрозы локализованных [Ca2 +]cyt высоты вокруг места кормления насекомых. Благодаря использованию мутантов, этот метод позволит для молекулярных и физиологических характеристик таких сигналов, которого не было возможно ранее. Важнейшим шагом в этом протоколе является обеспечить отдельные листья не чрезмерно нарушается во время процесса отряд (шаг 3.2) или при передаче насекомых на листья (шаг 4.5). Учитывая, что текущий протокол обеспечивает относительное измерение [Ca2 +]cyt , а не абсолютная концентрация, важно, что Микроскоп параметры хранятся постоянно на протяжении всего эксперимента. Существует также потенциал для человека предвзятости в ходе отбора трансформирования и анализ данных, и таким образом, рекомендуется, что эксперименты проводятся двойного слепого.
Есть несколько существенных преимуществ измерения [Ca2 +]cyt во время биотического стресса с настоящим Протоколом. Во-первых использование одного Флюорофор с флуоресцентные высокодоходных позволяет томографии проводиться на стереомикроскопом, который является менее дорогостоящим, чем с помощью конфокального микроскопа. Использование одного Флюорофор также упрощает сбор и анализ данных, как есть только одно измерение для записи. Кроме того использование стереомикроскопом позволяет для визуализации всего листья, который имеет важное значение, учитывая, что многие биотических взаимодействия, включая завод тля взаимодействий, происходят в больших пространственных масштабах. Высокая временное разрешение изображения захвата с GCaMP3, основанный на быстрое отключение Ca2 + от датчика после привязки23,30 и высокодоходных флуоресцентных, позволяет для измерений, которые необходимо принять до каждые 5 s. Кроме того лист assay предотвращает побег насекомое, ограничивая шаг для проведения таких экспериментов на весь растений (в подготовке)ключ. Отдельностоящий листья также убедиться, что насекомое каналы из предопределенные местоположения, позволяя для анализа динамики Ca2 + до, во время и после кормления. Этот протокол также гарантирует, что листья подобные этапы развития используются для анализа.
Основной недостаток этого протокола происходит от использования не ratiometric биодатчик. С одной FP биодатчики вариации в GFP выбросов может быть результатом экспериментальные переменные помимо [Ca2 +]cyt, например изменений в клеточных рН, движения или уровень экспрессии биодатчик. Эти вопросы не встречаются с Cameleons ладу во время МУЧИТЬСЯ, как передача энергии от СЛП рекламы ЯФП происходит только после Ca2 + привязки. Другие условия, которые изменяют флуоресцентные свойства отдельных флуорофоров маловероятно имитировать противоположные изменения в интенсивности CFP и рекламы ЯФП, и расчет ratiometric, используемый изначально нормализует измерения для многих из них другие оптические артефакты23,30. Это делает оценки абсолютной [Ca2 +]cyt более надежной с Cameleons ладу. Следовательно GCaMP3 лучше всего использовать как биосенсора для измерения относительной [Ca2 +]cyt, хотя это все еще достаточно, чтобы обнаруживать и определять характеристики биологических явлений в растений5,(in preparation). Таким образом, важно, чтобы использовать элементы управления, чтобы показать, что наблюдаемый эффект обусловлен Ca2 +, включая Ca2 +-генетических мутантов(в подготовке) или фармакологических Ca2 + канал ингибиторы, такие как La3 + . Важно отметить, что сингл FP биодатчики обычно отображают большую доходность флуоресцентные и более широкий динамический диапазон (т.е. увеличение цветения Ca2 + привязки), чем МУЧИТЬСЯ Cameleons23, что делает GCaMP более подходит для ткани уровня обработки изображений, в то время как Cameleons ладу являются полезным инструментом для сотовых воображения confocal микроскопа5,25.
Во время выполнения этого протокола возможно, будут возникать некоторые вопросы, которые требуют устранения неполадок. Например рекомендуется, что образцы, в котором управления (лечить) лист дисплеи, которые большие фасадыcyt [Ca2 +] отбрасываются (шаг 6.3). Такие переходные процессы являются скорее результатом стресса, вызванного микроскопии. Действительно, синий свет, как известно, вызывают Ca2 + сигналов38,,3940,41, и света высокой интенсивности может также привести к температуры и осмотического подчеркивает, оба из которых также вызывают [Ca2 +]cyt фасады21,25,42. Следовательно чтобы уменьшить такие стрессы, важно провести эксперимент в комнате хорошо проветриваемом и контролем температуры и избежать неоправданно долгих выдержек. Важно также, чтобы не сорвать листья чрезмерно в отряд или во время микроскопии для предотвращения вызвал касания [Ca2 +]cyt высоты43,44,45. Могут также возникнуть проблемы с насекомых урегулирования. С . м. persicaeнасекомых не соглашайтесь на листьях в нескольких пробах. Это может быть результатом раны вызвал обороны в отдельные листья46,47, или нарушение насекомых, синий свет. Действительно видение в . м. persicae регулируется три фоторецепторных клеток, в том числе один с чувствительностью пик 490 Нм48. Уменьшение воздействия микроскопии и обработки тли с осторожностью может уменьшить бедствия и поощрения урегулирования.
Протокола, изложенные в текущем документе дает новые идеи на молекулярных понимания взаимодействия растений насекомых и растений ответ биотического стресса. Это позволяет для визуализации одного из первых реакция растений на Насекомое кормления и облегчает дальнейшие исследования с использованием значительные Arabidopsis генетические ресурсы. Кроме того этот протокол обеспечивает использование живых организмов, в отличие от выдержки5049 или elicitors. В будущем этот метод может быть применен к других биотических стрессов, таких дополнительных видов насекомых, нематоды или патогенных микроорганизмов, а также к абиотическим стрессам. Микроскопия GCaMP3 также могут быть изменены для изображения других растительных тканей, альтернативные ROIs на лист, или даже целые растения. Кроме того есть потенциал для биосенсора быть генетическаялы, закодированные в дополнительных растений. Следовательно протокол, изложенных в настоящем документе имеет потенциал для тайных молекулярные основы Ca2 + сигнализации в диапазоне Роман биотических взаимодействий между растений и других видов.
Disclosures
Авторы не имеют никаких конфликтов интересов объявить.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить Грант Calder (Джон Innes центр, Великобритании) для консультации, касающиеся микроскопии. Авторы хотели бы также поблагодарить Джона Innes центр садоводства и энтомологии департаментов за их помощь. Эта работа была поддержана PhD студенчества от Джона Иннес Foundation (т.в.), Грант от Фонда Джона Иннес и СИББН B/JJ004561/1 (т.в., м.а., J.C., с.м., с.х., т.м. и д.с.), в год в промышленности размещения от Джона Иннес Центр (магистр) , летом студенчества от биохимического общества Великобритании (J.C.), JST PRESTO (м.т.) и грантов MCB 1329723 и IOS-1557899 от национального научного фонда (м.т. и с.г.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
- Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C., Harper, J. F. Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell. 14, S401-S417 (2002).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu Rev Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Blume, B., Nurnberger, T., Nass, N., Scheel, D. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell. 12 (8), 1425-1440 (2000).
- Lecourieux, D. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. 38 (6), 527-538 (2005).
- Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
- Verrillo, F., Occhipinti, A., Kanchiswamy, C. N., Maffei, M. E. Quantitative analysis of herbivore-induced cytosolic calcium by using a cameleon (YC 3.6) calcium sensor in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol. 171 (2), 136-139 (2014).
- Kiep, V. Systemic cytosolic Ca(2+) elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytol. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Blackman, R. L., Eastop, V. F. Aphids on the world's crops: an identification and information guide. , John Wiley & Sons, Ltd. (2000).
- Ng, J. C. K., Perry, K. L. Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol Plant Pathol. 5 (5), 505-511 (2004).
- Ren, G. W., Wang, X. F., Chen, D., Wang, X. W., Liu, X. D. Effects of aphids Myzus persicae on the changes of Ca2+ and H2O2 flux and enzyme activities in tobacco. J Plant Interact. 9 (1), 883-888 (2014).
- Brownlee, C., Wood, J. W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells of fucus-serratus. Nature. 320 (6063), 624-626 (1986).
- Miller, A. J., Sanders, D. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature. 326 (6111), 397-400 (1987).
- Kanchiswamy, C. N., Malnoy, M., Occhipinti, A., Maffei, M. E. Calcium imaging perspectives in plants. Int J Mol Sci. 15 (3), 3842-3859 (2014).
- Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun. 29 (2), 229 (1967).
- Plieth, C. Plant calcium signaling and monitoring: pros and cons and recent experimental approaches. Protoplasma. 218 (1-2), 1-23 (2001).
- Campbell, A. K., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants. Cell Calcium. 19 (3), 211-218 (1996).
- Mithofer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biol Proced Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstadler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochem J. 440 (3), 355-365 (2011).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. Plant J. 68 (1), 100-113 (2011).
- Zhu, X. H., Feng, Y., Liang, G. M., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. BBA Mol Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Choi, J. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Choi, W. G., Toyota, M., Kim, S. H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6497-6502 (2014).
- Evans, M. J., Choi, W. G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on atrbohd and tpc1 propagates the systemic response to salt stress in Arabidopsis roots. Plant Physiol. 171 (3), 1771-1784 (2016).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. P Natl Acad Sci USA. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J Biol Chem. 284 (10), 6455-6464 (2009).
- Okumoto, S. Quantitative imaging using genetically encoded sensors for small molecules in plants. Plant J. 70 (1), 108-117 (2012).
- Ohkura, M., Matsuzaki, M., Kasai, H., Imoto, K., Nakai, J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem. 77 (18), 5861-5869 (2005).
- Tallini, Y. N. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4753-4758 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Baum, G., Long, J. C., Jenkins, G. I., Trewavas, A. J. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (23), 13554-13559 (1999).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 1863-1865 (1995).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in transgenic luminous plants. Plant Physiol. 114 (3), 1408-1408 (1997).
- Harada, A., Shimazaki, K. I. Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochem. Photobiol. 83 (1), 102-111 (2007).
- Plieth, C., Hansen, U. P., Knight, H., Knight, M. R. Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18 (5), 491-497 (1999).
- Meyerhoff, O., et al. AtGLR3.4, a glutamate receptor channel-like gene is sensitive to touch and cold. Planta. 222 (3), 418-427 (2005).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Legue, V. Cytoplasmic free Ca2+ in Arabidopsis roots changes in response to touch but not gravity. Plant Physiol. 114 (3), 789-800 (1997).
- Koo, A. J. K., Gao, X. L., Jones, A. D., Howe, G. A. A rapid wound signal activates the systemic synthesis of bioactive jasmonates in Arabidopsis. Plant J. 59 (6), 974-986 (2009).
- Mousavi, S. A., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
- Kirchner, S. M., Doring, T. F., Saucke, H. Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera : Aphididae). J Insect Physiol. 51 (11), 1255-1260 (2005).
- Prince, D. C., Drurey, C., Zipfel, C., Hogenhout, S. A. The leucine-rich repeat receptor-like kinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1 and the cytochrome P450 PHYTOALEXIN DEFICIENT3 contribute to innate immunity to aphids in Arabidopsis. Plant Physiol. 164 (4), 2207-2219 (2014).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z. X., Brigg, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (24), 8919-8924 (2014).
