Summary
このプロトコルは、アブラムシなどの半翅目昆虫の摂食によって生成される植物のカルシウム信号の分析のための簡単な方法をについて説明します。シロイヌナズナを用いたGFP カルシウム センサー GCaMP3 と変換高時間・空間分解能によるカルシウム動態のリアルタイム生体内イメージングを可能にします。
Abstract
カルシウム イオンがカルシウム シグナル微生物エリシターと咀嚼昆虫、全身のカルシウムを引き出すことによる負傷に植物の防衛対応の確立された部分を形成と生物の相互作用の間に重要なシグナリング エンティティに対して予測されます。植物の信号。ただし、カルシウム体内生物ストレス中の役割はまだ明確ではありません。このプロトコルでは、植物の半翅目害虫によって給餌中にカルシウム信号を検出する遺伝子にコードされたカルシウム センサーの使用について説明します。アブラムシなど hemipterans ピアスと細胞数が少ない専門、細長い吸う口器、それらの植物は、負傷の応答とは異なる生物的ストレスに直面したとき、カルシウム動態を研究に理想的なツールを作るします。さらに、蛍光バイオ センサーがシグナル伝達の分子生体内で動物と植物の両方の測定に革命を起こしてください。昆虫高時空分解能、食中植物カルシウム動態のリアルタイム イメージング GFP 基づかせていたカルシウム センサー GCaMP3、モデル植物シロイヌナズナを表現することができます。前に、中に、昆虫摂食後細胞内カルシウム動態の連続測定を可能にする戸建の GCaMP3 葉の蛍光顕微鏡を用いた再現性と堅牢なアッセイが開発しました。これは、アブラムシの餌は数分以内に発生するサイトの周り迅速なカルシウムの高いローカライズ昇格を明らかにします。プロトコルは、シロイヌナズナの使用可能ですが突然変異体の急速な生成現象の分子の解析を容易にする昆虫種の追加などの他の生物的ストレスに適応できます。
Introduction
カルシウム (Ca2 +) は植物で最もユビキタス信号要素の 1 つです。ゾル性細胞質 Ca2 +濃度の一過性の上昇 ([Ca2 +]cyt) 下流コンポーネントの複雑なネットワークによってデコードされ、1,2両非生物的ストレスに対する応答に関与しています。[Ca2 +]cytの上昇は微生物エリシター、植物防御応答3,4、5の共通部分を形成する最初の応答の 1 つであります。[Ca2 +]cytの上昇は、咀嚼昆虫 lepidopterans6,7などによる負傷に対しても観察されています。ただしの潜在的な役割は、Ca2 +信号応答の少数の細胞だけに損傷を引き起こす生物の脅威をライブには検討されていない植物します。世界農業8,9, に重大な脅威を表す半翅目昆虫であり、Ca2 +細胞外スペースからの流出で観察されている葉アブララムシモモアカアブラムシモモアカアブラムシ10出没。工場 Ca2 +の測定再現性の堅牢な法信号モモアカアブラムシフィード蛍光 Ca2 +バイオ センサー、アブラムシとする GCaMP3 を提供する新しいツールの葉の間このプロトコル概要生物間相互作用の中に Ca2 +の役割を分析します。
Ca2 +-選択的電極以前植物11,12[Ca2 +] 測定に使用されました。最近では、生物発光と蛍光のアプローチが標準化になります。これらのバイオ センサー バインド Ca2 +および発光細胞および組織全体における Ca2 +動態の研究に届かんの機会を可能にします。Ca2 +バイオ センサーを染料として注入またはコーディング シーケンスを変換 (すなわち、遺伝子にエンコードされたバイオ センサー) による有機体のゲノムにバイオ センサーの導入時に安定して生産できます。後者は、簡単にライブの組織で発現と細胞内局在13のことができるの主要な利点を提供しています。オワンクラゲ(クラ ゲ) から免震イクオリン タンパク質は、最初遺伝子にエンコードされた Ca2 +バイオ植物14展開だった発光タンパク質としてイクオリンは発色団の漂白と蛍光15回避できます外部光による励起を必要はありません。イクオリンは正常に [Ca2 +] 温度16、病原体17,18,19を含む、様々 な刺激に対する応答でフラックスを測定に使用されています、塩ストレス20 、21、7人が負傷した。しかし、貧しいセンサー式難しい13の組織からの個々 のセルに [Ca2 +] フラックスを検出を作る比較的低い信号強度で不利であります。
蛍光を発することができます Ca2 +バイオ センサーの開発には、Ca2 +動態の詳細な細胞および組織レベルの解析を可能にするによってイクオリンが補完されます。蛍光共鳴エネルギー移動 (FRET) は、最も一般的な蛍光バイオ センサーの 1 つ-Cameleons を用いた。フレット Cameleons 通常 CFP と YFP、Ca2 + CFP YFP リンカー領域でカルモジュリン ドメインへの結合による構造変化により近い接触に持って来られる 2 つのタンパク質から成る。この連絡先のエネルギー伝達 CFP から YFP にでき、これらの蛍光物質の蛍光性の変更の結果の [Ca2 +] 正確な定量化のため 2 つの蛍光信号の比を計算してフルオロ22。フレット Cameleons 優れているイクオリンとレシオ メトリック以外の蛍光染料23タンパク質の発現レベルの影響し、しばしば大きな蛍光収率がある細胞と細胞内イメージング23を可能にします。たとえば、フレット Cameleons 最近使用されている植物で長距離 Ca2 +シグナルを識別し、細胞レベル24,25,26にこれらを解決します。
蛍光 GFP ベースの Ca2 +バイオ センサーの最近の進歩は、高感度単一分子蛍光 (シングル FP) バイオ センサーの開発をされています。シングル FP バイオ センサーから成る単一の円形置換された GFP は、Ca2 +カルモジュリンに結合、だからカルモジュリンと GFP の間水を介した反応の結果とカルモジュリンと M13 ペプチドにリンクある GFP と増加蛍光収量27,28,29。シングル FP センサーは、フレットの Cameleons よりシンプルな実験的デザインと30をイメージングの潜在的に高い時間分解能を含む上のいくつかの利点を提供しています。シングル FP センサーは、単に絶対 [Ca2 +] を定量化することはできませんが Ca2 +の時間的・空間的ダイナミクスの解析信号5,23FRET センサーとして彼らが優れています。GCaMPs best-established シングル FP センサー28の 1 つ、蛍光収率、ダイナミック レンジ、Ca2 +アフィニティ、および信号対雑音比31,32を高めるいくつかの改訂を経た,33,34.、GCaMPs 正常にで使用されている動物のシステム、ゼブラフィッシュの運動ニューロン35フルーツ フライ神経筋接合部34など。シングル FP センサー、超高感度 GCaMP636 GECOs29などの追加クラスで GCaMP3 のランダム変異導入をもたらしました。GECOs は最近、Ca2 + ATP、キチンと細菌エリシター flg22 に応えてフラックスを測定するシロイヌナズナ(今後シロイヌナズナと呼ばれる) で使用されました。この調査はまた R エコ バイオ センサーが最大信号変化と信号対雑音比5面でフレット Cameleon YC3.6 を上回ることを示した。
GCaMP バイオ センサーと達成することができます高時間分解能、高蛍光収量、使用の容易さのためシロイヌナズナにおけるカリフラワー モザイク ウイルス35 s プロモーター GCaMP3 をエンコードする遺伝子だった。シロイヌナズナ研究できる遺伝的ツールは、GCaMP3 を用いて Ca2 +シグナルの詳細な分子分析が可能します。さらに、GCaMP3 バイオ センサーより高価な共焦点システムではなく、蛍光顕微鏡の下で視覚化できます。このプロトコルは、全体組織イメージング、ライブの生物的ストレスに実験を行う場合に必ず必要。実験は、 35S::GCaMP3植物から葉を浮かべ水、昆虫の脱出を防ぐために、特定の組織への供給を制限するように設計されています。このペーパーで説明する方法したがって葉 Ca2 +動態の解析によりモモアカアブラムシによって給餌中、応答新規植物の特性評価の結果します。このメソッドは、追加の昆虫や微生物病原体などの他の生物ストレスと根など他の植物の組織を動作するように合わせることができます。
Protocol
1 です工場準備 (日 1 - 4)
- 1 日 35S::GCaMP ¼ 強度培地でプラスチック板を正方形 100 mm 2 でそれら 3 75% エタノール洗浄、洗浄、およびプレートあたり 1 分を利用した種子を殺菌すると。培 (MS) 培地 (レシピ: 培地、培培地、ショ糖、Formedium 寒天培地と 1 L の脱イオン水の 10 g の 7.5 g の 1.1 g) 37 。
- 同期の発芽を取得する 8 ° C で 3 日間の暗闇の中で苗を階層化します 。
- 実験の日 4、23 ° C、16 h 光と 8 時間暗い日長で制御された環境室 (CER) に GCaMP の苗を移動します 。
2。昆虫飼育 (日 11 - 12)
- 実験の日 11、15 大人 モモアカアブラムシ を湿ったアーティストを用いたシロイヌナズナ植物を土壌栽培 5 週齢に追加 ' (10 h 光と 14 時間暗い photoperio の 22 ° C で CER 産 s ペイント ブラシ (サイズ 2 または 4)d).
- 工場とプラスチック製の蓋とキャップの周りの透明なプラスチック チューブ (10 cm × 15 cm) を配置することによって植物のアブラムシをケージします 。
- 光 16 h と 8 h 暗い日長 22 ° C で CER で 24 h のアブラムシが出没する植物を残す 。
- 実験の 12 日、成人 モモアカアブラムシ 絵筆を使って削除します
。 注: 昆虫は、植物の目で見ることができます。これは同じような発達年齢とニンフの人口を与えます。ほぼ大人 1 名につき 1 ニンフはこの期間中に生成されます 。
- 、8 h 光と 16 h 暗い日長、ニンフが余りに急速にサイズが増加することを防ぐために 16 ° c の低温 CER で寄生植物を残す 。
3。葉の剥離 (19 日)
- 実験の 19 日、CER から 35S::GCaMP3 苗を削除し、各工場の鋭いはさみのペアを使用してから最大の葉をデタッチします 。
- 切断面が上を向いて、蒸留水を 300 μ L を含む 96 ウェル プレートのウェルに切葉を配置、ピンセットのペアを使用しています。その他葉 ( 図 1) の繰り返し 。
図 1: 35S::GCaMP3 葉アッセイ。各 16 日古い 35S::GCaMP3 シロイヌナズナ実生から最大の葉をデタッチして 96 ウェル プレートで蒸留水 300 μ L に浮かんでいた。剥離後の日を撮影した写真。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- カバー クリア プラスチック製のラップとアルミ箔でプレートと常温のままに一夜を沈静化し剥離のストレスを許可します
4。 蛍光顕微鏡 (日 20 - 22)
- 実験の 20 日、アルミ箔から 96 ウェル プレートを削除し、蛍光顕微鏡にそれを転送します。450-490 nm の光で GFP を励起し、500 と 550 nm の蛍光発光をキャプチャ ステレオ蛍光顕微鏡を構成します 。
- は、土壌から植物を除去して蓋付き透明のボックスにそれを置くことによって 11 日確立されたコロニーから高齢者のアブラムシを収集します。実験を行いながら、ボックスに含まれる昆虫を維持します 。
- は、顕微鏡下で 96 ウェル プレートを配置します。GCaMP3 蛍光は戸建の葉の静脈で明確に視覚化することまで、光の露出を変更します。露出を保つすべての実験;3.5 ( 図 2) のゲインを持つ使用された現在のプロトコルでは、1 の露出 。
- 倍率と顕微鏡のズームを調整して、4 井戸を 1 つのフレームで観察できる; 現在のプロトコルを使用して X 倍率と-127.8330 ミリメートルの焦点 7.8 。
- は、1 つのアブラムシを湿ったペイント ブラシを使用して顕微鏡下で切葉に転送します。未処理のコントロールとして隣接する葉を残すが、アブラムシの転送中に発生する接触を模倣するペイント ブラシで軽く触る。昆虫の脱出を防ぐために顕微鏡の中に 96 ウェルのプレートの上にプラスチック製のラップを配置してください 。
- をクリックして (1 アブラムシ処理と未処理の 1) のペアで葉の蛍光レコーディングを開始 " 実験を開始 " 顕微鏡内蔵ソフトウェア ( 図 2)。50 分の測定記録
注: 現在のプロトコル 5 の時間間隔の測定の間 s を使用した 。
- 後 50 分をクリックして記録を停止 " 実験を停止 " および葉から、アブラムシを削除します。蛍光測定を (例えば、 タグ付きイメージ ファイル形式、TIFF) のイメージ ファイルとして保存します 。
- 葉のさらにペアで実験を繰り返す; イメージングを拡張して、2 遺伝子型の同時イメージングを可能にする 2 組の葉を一度に画像できます 。
5。データ コレクション
- フィジー (画像 J) にイメージ ファイルをインポートしをクリックしてそれらを 32 ビットに変換 " 画像 " > " タイプ " > "; 32 ビット " これにより、ヒートマップ動画 (手順 7 参照) への画像の変換 。
- は、アブラムシに定住しない 1 つの場所より 5 分顕微鏡下で昆虫の動きを表示することによってサンプルを破棄します
。 注: これはサンプルの大半では多くの場合、100 の治療までは 30 サンプル出展成功した解決を見つけること必要があります 。
- に使用したのと同じ時間間隔のピクセル (または mm、知られている場合に変換) 測定尺度と時間枠をクリックして顕微鏡検査中に設定 " 画像 " > " プロパティ " 。
- GFP 解析のための組織の周辺領域 (ROI) を配置、カーソルを使用します
。 注: 現在のプロトコルで 3 場所で使用された直径の円形 ROI 50 ピクセル (0.65 mm): 給餌サイト (Fs)、(Sm)、葉の主脈上の全身領域や全身領域の主脈に隣接するアブラムシ (" 横方向の組織、" Sl) ( 図 2)。- 楕円を描画することによって、投資収益率を作成 (を使用して、" 楕円ツール ")、およびサイズを使用して編集 " 編集 " > " 選択 " > " 指定します " 図 2 を参照してください。 。
- 無処理、処理葉 (すなわち、 処理葉にアブラムシの供給場所として葉の同じ領域) で選択されたものに葉の対等な地域で Roi を選択 ( 図 2).
図 2: GCaMP3 蛍光顕微鏡下での分析します。左: 対照葉。右: アブラムシ処理葉。アブラムシの給餌場は、矢印で示されます。スケール バー = 1 ミリメートル。 (A) 明るいフィールド画像。倍率 7.8 倍、焦点を合わせる:-127.8330 mm、露出: 1 s. (B) GFP イメージ骨董ng ・ ロワの蛍光定量分析に使用します。Fs = 餌サイト、Sm 全身主脈、Sl を = = 全身横組織。倍率 7.8 倍、焦点を合わせる:-127.8330 mm、露出: 1 s。GFP は、450 に 490 nm のメタルハライド ランプを使用して興奮していたし、蛍光発光が 500 と 550 nm の間に捕獲されました。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください
- をクリックして時間シリーズ Analyzer プラグインを使用して " のプラグイン " > " 時間シリーズ ・ アナライザー " ROI の未加工の蛍光値 (F) を時間をかけて分析します。興味の投資収益率を追加 (" 追加 [t] ")。ROI が選択されているかどうかを確かめて選択 " 取得平均; " これは ROI で各フレームの F 値のテーブルが表示されます 。
- このデータをスプレッドシートにコピーします 。
- 最初に選択領域を使用して餌のサイト信号の面積を計算、" フリーハンド選択ツール " 最大の GFP シグナルの概要と、クリックしてこの図形の面積を計算する " 分析 " > " 測定。 " 。
- 餌サイト信号をクリックして MTrackJ プラグインを使用して速度を計算する " プラグイン " > " 追跡 " > " MTrackJ "
- クリックで、" 追加 " ボタンをクリックし、の中心にカーソルをクリック。信号はそれが最初に見える時期。その時点の遠い信号のエッジの広がりを再度クリック。クリックして " メジャー " 信号の速度を計算する 。
6。データ分析
- アブラムシ フィジーの顕微鏡から画像フレームを再生することにより解決のポイントを定義します
。 注: のセトリング時間は、アブラムシの間を 5 分以上のための単一の場所で保持フレームです。イベントの解決の期間は、フィジーの画像から計算することもします 。
- 正規化式 ΔF/F によると F データ (ΔF/F) = (F ・ F 0)/F 0 F 0 は平均ベースライン蛍光は、アブラムシの前に記録の最初の 60 フレーム F の平均値から計算解決しました。未処理のコントロールの繰り返し 。
- は、時間をかけて処理と未処理の葉で ROI の正規化された GFP 蛍光 (ΔF/F) をプロットします。未処理のコントロールが大規模な Ca 2 + トランジェント (すなわち、 上記の 0.2 ΔF/F 上がる) を示している場合はサンプル (両方の葉) を破棄します 。
- 繰り返して、遺伝子あたり、少なくとも 20-30 実行可能なサンプルが分析されている 。
7。時間コース ビデオ作成
- 32 ビットの画像ファイルをクリックして NucMed_Image Lut プラグインを使用してヒートマップなどに変換 " プラグイン " > " NucMed " > " ルックアップ テーブル " ルックアップ テーブル メニューの選択 " 緑赤青。"、ヒート マップにイメージに変換します 。
- 強化アブラムシによる GFP を強調するヒートマップのコントラスト信号を使用して " プロセス " > " コントラストを高める " > " 調整 % 飽和ピクセルします " 。
- をクリックしてタイム スタンパのプラグインを使用して時間情報を追加 " プラグイン " > " タイム スタンパ "。設定、" 開始時間 " で " 0 " と " 間隔 " 顕微鏡 (例えば 5 s) の使用時間間隔に基づいています 。
- は、オーディオ ビデオ インタリーブ (AVI) ファイルとしてこのビデオをエクスポートします
。 注: このビデオを編集し、ことができます他のソフトウェア パッケージ (例えば、 Microsoft ムービー メーカー) でさらにします 。
Representative Results
図 3と図 4 、代表未処理のコントロールとアブラムシ処理葉を比較する実験からの結果します。GFP 蛍光で局所高の増加は、(図 3 aと3 b) Ca2 +動態無処理リーフ滞在が比較的安定しながらサンプルの大半で、数分以内給餌場の周り見ることができます。また、ある実験で (図 3 b) 初期のピーク後の GFP 蛍光で二次の増加を観察することが可能です。処理葉の 50% まででアブラムシが解決しないし、サンプルを破棄する必要があります。どのセトリングが発生したサンプル、サンプルの 27% を示さないの明確な増加 (図 3および表 1) 給餌場周辺の GFP 蛍光でしたがって、定量分析のため 25 30 レプリケーション サンプルを平均する必要があります。領域の可視化と給餌のサイト [Ca2 +]cyt昇格のスピード 6 μ m/s (表 1) で走行約 110 μ m の信号を明らかにする必要があります。さらに、[Ca2 +]cyt標高が検出されません全身アブラムシ治療、全身の中肋 (図 4 a) または全身横組織領域 (図 4 b) のいずれかにリーフ内。ビデオ 1に時間をかけて [Ca2 +]cytダイナミクスの代表的なサンプルを示します。また、数と顕微鏡下で個々 の沈降のイベントの期間を追跡することによってアブラムシ沈降挙動を分析することが可能です。これらの行動の代表的な結果は、アブラムシは、決済前に約 10 分を取るし、彼らは正常に解決を行うとき、これは平均 20 分の期間を示す表 1に表示されます。そのため、昆虫は [Ca2 +]cyt昇格の全体のための単一の場所で解決します。
図 3: GCaMP3 は、アブラムシの検出による Ca に使用できます2 +戸建葉供給地点信号。左: 代表的なトレース (n = 30) 正規化された GFP 蛍光 (ΔF/F) 35S::GCaMP3リーフ.の給餌場周辺のトレースは、25 分後決済まで沈降する前に 5 分を表示します。コントロール = 未処理35S::GCaMP3葉の同じ場所。[Ca2 +]cytの標高は、アブラムシを餌35S::GCaMP3リーフ上のサイトの周りを見ての右: 代表的な顕微鏡画像。GFP の蛍光がはめ込みの規模に応じて色分けされました。白と栄養のサイトに記載されているアブラムシ id は、矢印で示されます。倍率 7.8 倍、焦点を合わせる:-127.8330 mm、露出: 1 s。GFP は、450 に 490 nm のメタルハライド ランプを使用して興奮していたし、蛍光発光が 500 と 550 nm の間に捕獲されました。(A) 大型アブラムシ誘起 [Ca2 +]cyt立面図の例。アブラムシによる平均 [Ca2 +] の例 (B)cyt昇格。(C) アブラムシ誘起 [Ca2 +]cyt高の例。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| パラメーター | 平均 (± SEM) |
| [Ca2 +]cyt昇格 | |
| [Ca2 +]cyt標高を表示するサンプルの割合 | 73% |
| 波面の速度 | 5.9 μ m/s (± 0.6) |
| スプレッドの最大面積 | 110 μ m2 (± 18) |
| アブラムシの行動 | |
| 一段落の数 (> 5 分) | 2 (± 0.1) |
| 一段落 (すべての期間) の合計数 | 3.8 (± 0.4) |
| Bイメージングのため時間に定住 | 20 分 (± 2) |
| 最初の解決cまでの時間 | 11 分 (± 1.4) |
| 決済合計時間のパーセンテージ | 62% (± 3) |
表 1: [Ca2 +]cyt昇格と35S::GCaMP3中にアブラムシの動作パラメーター イメージングします。パラメーターはどの解決の実行可能なサンプルから計算 > 5 分が発生しました。普及の遠いポイントに開始のポイントから目に見えるシグナルの (A) 速度。蛍光分析用初期沈降イベントの (B) の期間です。(C) 画像の先頭と最初のアブラムシの間の時間の長さを解決します。[Ca2 +]以前、植物細胞に送信されたチトクローム標高データ (現在の状態: 初期の QC)。
図 4: GCaMP3 は、給餌場に全身のアブラムシによる Ca2 +信号を検出できません。代表的なトレース (n = 30) 正規化された GFP 蛍光 (ΔF/F) アブラムシのサイトを供給する全身の場所での35S::GCaMP3 の葉します。トレースは、25 分後決済まで沈降する前に 5 分を表示します。コントロール = 未処理35S::GCaMP3葉の同じ場所。(A) ΔF/全身主脈地域で F。(B) ΔF/全身横組織領域で F。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
ビデオ 1: アブラムシ フィードとして時間 GCaMP3 蛍光で。GFP の蛍光がはめ込みの規模に応じて色分けされました。アブラムシの給餌場の場所は、矢印で示されます。左: 35S::GCaMP3葉モモアカアブラムシ大人にさらされています。右: 35S::GCaMP3いいえアブラムシ対策葉。してくださいここをクリックしてこのビデオを表示します。(右クリックしてダウンロード)
Discussion
このペーパーで説明する方法は工場のリアルタイム分析できます Ca2 +虫餌など生物的ストレス時伝達します。それは、ローカライズされた [Ca2 +]cyt給餌場周辺の標高昆虫であるこのような脅威に最初の植物の応答のいずれかを示します。突然変異体を使用してこのメソッドになります、以前不可能だったそのような信号の分子・生理学的特性。このプロトコルの重要なステップは、戸建の葉がされないように過度に邪魔 (ステップ 3.2) 剥離プロセス中または昆虫を葉 (ステップ 4.5) に転送するときです。現在のプロトコルは、絶対濃度ではなく、[Ca2 +]cytの相対的な測定値を提供することを考える、顕微鏡設定が実験を通じて一定に保たれることが重要です。・ ロワの選択および、データの分析中に人間バイアスの可能性もあるし、はよう、実験は二重盲検を実施をお勧めします。
このプロトコルで生物ストレス中の [Ca2 +]cytの測定のいくつかの重要な利点があります。まず、蛍光収一分子蛍光の使用は、共焦点顕微鏡を使用するよりも安価である、顕微鏡上で実施するイメージングできます。単一分子蛍光の使用も簡単データの収集と分析、記録する 1 つだけの測定があります。さらに、顕微鏡の使用全体の葉のイメージングに不可欠であることを考えると大きな空間スケールで発生するアブラムシ植物相互作用を含む多くの生物的相互作用できます。イメージの高時間分解能 GCaMP3、に基づいてバインディング23,30前後蛍光収率の高い Ca2 +センサーからの急速な解離可能なキャプチャ、測定することまでは、すべての 5 s。さらに、葉の試金は昆虫、 (準備中)全体の植物のような実験を実施するステップを制限するキーの脱出を防止します。戸建葉はまた前の間に、授乳後 Ca2 +動態の解析を可能にする定義済みの場所から昆虫のフィードすることを確認します。このプロトコルでは、同じような発達段階の葉を分析に使用することも保証します。
このプロトコルの主な欠点は、非レシオ メトリック バイオ センサーの使用から起きる。シングル FP バイオ センサーと [Ca2 +]cyt、細胞の pH、動き、またはバイオ センサーの発現レベルの変化など以外の実験変数から GFP の発光の変化があります。これらの問題がない中フレット Cameleons とフレット、YFP に CFP からエネルギーの伝達は、Ca2 +結合のみ発生しますので。個々 の蛍光物質の蛍光特性を変更する他の条件、CFP と YFP、強度の相反する変化を模倣する可能性が高いし、本質的に使用されるレシオ メトリック計算正規化これらの多くのための測定その他光学アイテム23,30には。これは、フレットの Cameleons でより信頼できる絶対 [Ca2 +]cytの推定になります。したがって、それはまだ検出し植物5,(in preparation)の生物学的現象を特徴付ける十分ですが、相対 [Ca2 +]cytを測定するバイオ センサーとしては GCaMP3 は使用最高。したがって、それはコントロールを使用して、Ca2 +Ca2 +を含むため観察された効果があることを示すことが不可欠-関連する遺伝的変異(準備中)または薬理学的 Ca2 +チャネル阻害剤ラ3 + など.シングル FP バイオ センサーが通常表示より蛍光収量と大きなダイナミック レンジを (すなわちCa2 +結合に伴う蛍光の増加) フレット Cameleons23, GCaMP に適して作るよりも重要なは、組織レベルのイメージング、フレット Cameleons は共焦点顕微鏡5,25細胞イメージングのための便利なツール。
このプロトコルの実行中は、いくつかの問題は、トラブルシューティングが必要なことが生じる。たとえばは大 [Ca2 +]cyt標高が制御 (未処理) 葉のディスプレイが (ステップ 6.3) を破棄されたサンプルをお勧めします。このようなトランジェント、顕微鏡による応力の結果可能性が最も高いです。確かに、青い光の Ca を引き出すために2 +信号38,39,40,41, と温度分布と浸透圧応力で高強度の光をもたらすことも知られているどちらの[Ca2 +]cyt標高21,25,42を引き出します。その結果、このような応力を減らすためには、換気、温度管理された部屋で実験を行うと、不必要に長い露出時間を避けるために重要です。また、剥離やタッチを引き出した [Ca2 +]cyt標高43,44,45を防ぐために顕微鏡の際に葉を過度に妨害しないことが重要です。昆虫セトリングと問題を発生も可能性があります。モモアカアブラムシといくつかのサンプルの葉の虫を解決してはいけないが。これは、傷による防御戸葉46,47、または青色光による昆虫の妨害の結果可能性があります。確かに、モモアカアブラムシのビジョンは、490 の nm48のピーク感度で 1 つを含む 3 つの光受容体によって支配されます。顕微鏡の露出を減らすとケアとアブラムシを処理が苦痛を削減し、定住を奨励します。
現在の紙に記載されているプロトコルは、植物・昆虫間の相互作用の分子的理解と生物ストレスに対する植物応答に新しい洞察力を与えます。それは昆虫の餌に最初の植物の応答の 1 つの可視化を可能し、利用可能なかなりのシロイヌナズナ遺伝子のリソースを使用して調査がさらに容易になります。さらに、このプロトコルにより、生きている有機体の使用に反対する抽出49またはエリシター50。今後、この技術は、微生物病原体や線虫、昆虫種の追加などの他の生物的ストレスだけでなく、非生物的ストレス適用でした。GCaMP3 顕微鏡を他の植物の組織、葉、または全体の植物の代替・ ロワを画像に変更もできます。さらに、遺伝するバイオ センサーの可能性があります。ly 追加植物種でエンコードします。したがって、このペーパーで説明されているプロトコル Ca2 +植物と他の種と新規生物間相互作用の範囲におけるシグナル伝達の分子基盤アンダー カバーする可能性があります。
Disclosures
著者の利害の衝突を宣言するあります。
Acknowledgments
我々 感謝したい助成金カルダー (ジョン Innes の中心、英国) 顕微鏡をに関する助言のため。著者はまたジョン Innes の中心の園芸、昆虫部門の支援に感謝したいです。BBSRC とジョン Innes 財団から B/JJ004561/1 を付与この仕事に思い立ったジョン Innes 財団 (テレビ) から支えられ (t. v.、修士、j. c.、スウェン、s. h.、T.M.、および D.S.)、産業配置ジョン Innes センター (修士) から年、英国 (j. c.)、科学技術振興機構さきがけ (ティルソン)、、MCB 1329723 と IOS-1557899 (ティルソン ・ イーエックスオー) 全米科学財団からの助成金の生化学会から夏学生の身分。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | - | Step 1.1 |
| 100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
| ¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | - | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
| Col-0 Arabidopsis | - | - | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
| Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | - | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
| Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
| 96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
| Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
| Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
| M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | - | For GFP imaging (Step 4.1) |
| Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
| Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | - | For image analysis (Step 6.1) |
References
- Sanders, D., Pelloux, J., Brownlee, C., Harper, J. F. Calcium at the crossroads of signaling. Plant Cell. 14, S401-S417 (2002).
- Dodd, A. N., Kudla, J., Sanders, D. The language of calcium signaling. Annu Rev Plant Biol. 61, 593-620 (2010).
- Blume, B., Nurnberger, T., Nass, N., Scheel, D. Receptor-mediated increase in cytoplasmic free calcium required for activation of pathogen defense in parsley. Plant Cell. 12 (8), 1425-1440 (2000).
- Lecourieux, D. Proteinaceous and oligosaccharidic elicitors induce different calcium signatures in the nucleus of tobacco cells. Cell Calcium. 38 (6), 527-538 (2005).
- Keinath, N. F., et al. Live cell imaging with R-GECO1 sheds light on flg22- and chitin-induced transient [Ca2+]cyt patterns in Arabidopsis. Mol Plant. 8 (8), 1188-1200 (2015).
- Verrillo, F., Occhipinti, A., Kanchiswamy, C. N., Maffei, M. E. Quantitative analysis of herbivore-induced cytosolic calcium by using a cameleon (YC 3.6) calcium sensor in Arabidopsis thaliana. J Plant Physiol. 171 (2), 136-139 (2014).
- Kiep, V. Systemic cytosolic Ca(2+) elevation is activated upon wounding and herbivory in Arabidopsis. New Phytol. 207 (4), 996-1004 (2015).
- Blackman, R. L., Eastop, V. F. Aphids on the world's crops: an identification and information guide. , John Wiley & Sons, Ltd. (2000).
- Ng, J. C. K., Perry, K. L. Transmission of plant viruses by aphid vectors. Mol Plant Pathol. 5 (5), 505-511 (2004).
- Ren, G. W., Wang, X. F., Chen, D., Wang, X. W., Liu, X. D. Effects of aphids Myzus persicae on the changes of Ca2+ and H2O2 flux and enzyme activities in tobacco. J Plant Interact. 9 (1), 883-888 (2014).
- Brownlee, C., Wood, J. W. A gradient of cytoplasmic free calcium in growing rhizoid cells of fucus-serratus. Nature. 320 (6063), 624-626 (1986).
- Miller, A. J., Sanders, D. Depletion of cytosolic free calcium induced by photosynthesis. Nature. 326 (6111), 397-400 (1987).
- Kanchiswamy, C. N., Malnoy, M., Occhipinti, A., Maffei, M. E. Calcium imaging perspectives in plants. Int J Mol Sci. 15 (3), 3842-3859 (2014).
- Ridgway, E. B., Ashley, C. C. Calcium transients in single muscle fibers. Biochem Biophys Res Commun. 29 (2), 229 (1967).
- Plieth, C. Plant calcium signaling and monitoring: pros and cons and recent experimental approaches. Protoplasma. 218 (1-2), 1-23 (2001).
- Campbell, A. K., Trewavas, A. J., Knight, M. R. Calcium imaging shows differential sensitivity to cooling and communication in luminous transgenic plants. Cell Calcium. 19 (3), 211-218 (1996).
- Mithofer, A., Mazars, C. Aequorin-based measurements of intracellular Ca2+-signatures in plant cells. Biol Proced Online. 4 (1), 105-118 (2002).
- Kwaaitaal, M., Huisman, R., Maintz, J., Reinstadler, A., Panstruga, R. Ionotropic glutamate receptor (iGluR)-like channels mediate MAMP-induced calcium influx in Arabidopsis thaliana. Biochem J. 440 (3), 355-365 (2011).
- Ranf, S., Eschen-Lippold, L., Pecher, P., Lee, J., Scheel, D. Interplay between calcium signalling and early signalling elements during defence responses to microbe- or damage-associated molecular patterns. Plant J. 68 (1), 100-113 (2011).
- Zhu, X. H., Feng, Y., Liang, G. M., Liu, N., Zhu, J. K. Aequorin-based luminescence imaging reveals stimulus- and tissue-specific Ca2+ dynamics in Arabidopsis plants. Mol Plant. 6 (2), 444-455 (2013).
- Kiegle, E., Moore, C. A., Haseloff, J., Tester, M. A., Knight, M. R. Cell-type-specific calcium responses to drought, salt and cold in the Arabidopsis root. Plant J. 23 (2), 267-278 (2000).
- Miyawaki, A., et al. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. Nature. 388 (6645), 882-887 (1997).
- Koldenkova, V. P., Nagai, T. Genetically encoded Ca2+ indicators: properties and evaluation. BBA Mol Cell Res. 1833 (7), 1787-1797 (2013).
- Choi, J. Identification of a plant receptor for extracellular ATP. Science. 343 (6168), 290-294 (2014).
- Choi, W. G., Toyota, M., Kim, S. H., Hilleary, R., Gilroy, S. Salt stress-induced Ca2+ waves are associated with rapid, long-distance root-to-shoot signaling in plants. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (17), 6497-6502 (2014).
- Evans, M. J., Choi, W. G., Gilroy, S., Morris, R. J. A ROS-assisted calcium wave dependent on atrbohd and tpc1 propagates the systemic response to salt stress in Arabidopsis roots. Plant Physiol. 171 (3), 1771-1784 (2016).
- Nagai, T., Sawano, A., Park, E. S., Miyawaki, A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. P Natl Acad Sci USA. 98 (6), 3197-3202 (2001).
- Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
- Akerboom, J., et al. Crystal structures of the GCaMP calcium sensor reveal the mechanism of fluorescence signal change and aid rational design. J Biol Chem. 284 (10), 6455-6464 (2009).
- Okumoto, S. Quantitative imaging using genetically encoded sensors for small molecules in plants. Plant J. 70 (1), 108-117 (2012).
- Ohkura, M., Matsuzaki, M., Kasai, H., Imoto, K., Nakai, J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. Anal Chem. 77 (18), 5861-5869 (2005).
- Tallini, Y. N. Imaging cellular signals in the heart in vivo: cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (12), 4753-4758 (2006).
- Tian, L. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat Methods. 6 (12), 875-881 (2009).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Pedelacq, J. D., Cabantous, S., Tran, T., Terwilliger, T. C., Waldo, G. S. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 24 (1), 79-88 (2006).
- Chen, T. W., et al. Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity. Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).
- Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol Plant. 15 (3), 473-497 (1962).
- Baum, G., Long, J. C., Jenkins, G. I., Trewavas, A. J. Stimulation of the blue light phototropic receptor NPH1 causes a transient increase in cytosolic Ca2+. Proc Natl Acad Sci USA. 96 (23), 13554-13559 (1999).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in plants. Science. 269 (5232), 1863-1865 (1995).
- Johnson, C. H. Circadian oscillations of cytosolic and chloroplastic free calcium in transgenic luminous plants. Plant Physiol. 114 (3), 1408-1408 (1997).
- Harada, A., Shimazaki, K. I. Phototropins and blue light-dependent calcium signaling in higher plants. Photochem. Photobiol. 83 (1), 102-111 (2007).
- Plieth, C., Hansen, U. P., Knight, H., Knight, M. R. Temperature sensing by plants: the primary characteristics of signal perception and calcium response. Plant J. 18 (5), 491-497 (1999).
- Meyerhoff, O., et al. AtGLR3.4, a glutamate receptor channel-like gene is sensitive to touch and cold. Planta. 222 (3), 418-427 (2005).
- Knight, M. R., Campbell, A. K., Smith, S. M., Trewavas, A. J. Transgenic plant aequorin reports the effects of touch and cold-shock and elicitors on cytoplasmic calcium. Nature. 352 (6335), 524-526 (1991).
- Legue, V. Cytoplasmic free Ca2+ in Arabidopsis roots changes in response to touch but not gravity. Plant Physiol. 114 (3), 789-800 (1997).
- Koo, A. J. K., Gao, X. L., Jones, A. D., Howe, G. A. A rapid wound signal activates the systemic synthesis of bioactive jasmonates in Arabidopsis. Plant J. 59 (6), 974-986 (2009).
- Mousavi, S. A., Chauvin, A., Pascaud, F., Kellenberger, S., Farmer, E. E. GLUTAMATE RECEPTOR-LIKE genes mediate leaf-to-leaf wound signalling. Nature. 500 (7463), 422-426 (2013).
- Kirchner, S. M., Doring, T. F., Saucke, H. Evidence for trichromacy in the green peach aphid, Myzus persicae (Sulz.) (Hemiptera : Aphididae). J Insect Physiol. 51 (11), 1255-1260 (2005).
- Prince, D. C., Drurey, C., Zipfel, C., Hogenhout, S. A. The leucine-rich repeat receptor-like kinase BRASSINOSTEROID INSENSITIVE1-ASSOCIATED KINASE1 and the cytochrome P450 PHYTOALEXIN DEFICIENT3 contribute to innate immunity to aphids in Arabidopsis. Plant Physiol. 164 (4), 2207-2219 (2014).
- Chaudhary, R., Atamian, H. S., Shen, Z. X., Brigg, S. P., Kaloshian, I. GroEL from the endosymbiont Buchnera aphidicola betrays the aphid by triggering plant defense. Proc Natl Acad Sci USA. 111 (24), 8919-8924 (2014).
