Denne protokol beskriver en simpel metode til at analysere calciumsignaler i planter genereret ved at fodre hemipteran insekter såsom bladlus. Arabidopsis thaliana omdannet med normal god landbrugspraksis calcium biosensor GCaMP3 giver mulighed for real-time i vivo billeddannelse af calcium dynamics med en høj tidsmæssige og rumlige opløsning.
Calciumioner er forudsagt til at være vigtig signalfunktion enheder under biotiske interaktioner med calcium signalering danner en etableret del af planten forsvar svar mikrobielle elicitors og sårede forårsaget af tygge insekter, fremkalde systemisk calcium signaler i planter. Rollen af calcium i vivo under biotiske stress er imidlertid stadig uklart. Denne protokol beskriver brugen af en genetisk kodet calcium sensor at opdage calciumsignaler i planter under fodring af en hemipteran pest. Hemipterans såsom bladlus gennembore et lille antal celler med specialiserede, aflange sucking mouthparts, hvilket gør dem ideelle værktøj til at studere calcium dynamics, når en plante er konfronteret med en biotiske stress, som adskiller sig fra en såret svar. Derudover revolutionerer fluorescerende biosensorer måling af signalering molekyler i vivo i både dyr og planter. Udtryk for en normal god landbrugspraksis-baserede calcium biosensor, GCaMP3, i model planten Arabidopsis thaliana giver mulighed for real-time imaging af plante calcium dynamics under insekt fodring, med en høj rumlige og tidsmæssige opløsning. En gentagelig og robust assay er blevet udviklet ved hjælp af Fluorescens mikroskopi af fritliggende GCaMP3 blade, giver mulighed for kontinuerlig måling af cytosole calcium dynamics før, under og efter insekt fodring. Dette afslører en stærkt lokaliseret hurtige calcium elevation omkring bladlus fodring site, der forekommer inden for et par minutter. Protokollen kan tilpasses andre biotiske understreger, som yderligere insektarter, mens brugen af Arabidopsis thaliana giver mulighed for den hurtige generation af mutanter at lette den Molekylær analyse af fænomenet.
Calcium (Ca2 +) er en af de mest allestedsnærværende signaling elementer i planter. En forbigående stigning i cytosole Ca2 + koncentration ([Ca2 +]cyt) afkodes af et komplekst netværk af downstream komponenter og er involveret i svaret til begge abiotiske og biotiske understreger1,2. En stigning i [Ca2 +]cyt er en af de første svar til mikrobielle elicitors, danner en fælles del af planten forsvar svar3,4,5. Stigninger i [Ca2 +]cyt er også blevet observeret i svar på såret forårsaget af tygge insekter, såsom lepidopterans6,7. Men den potentielle rolle, plante Ca2 + -signaler i svar til live biotiske trusler, der forårsager skader på kun et par celler ikke er blevet undersøgt. Den grønne fersken bladlus Myzus persicae er en hemipteran insekt, der repræsenterer en væsentlig trussel mod verdens landbrug8,9, og Ca2 + efflux fra det ekstracellulære rum er blevet observeret i blade befængt med M. persicae10. Denne protokol beskriver en robust og repeterbare metode til måling af plante Ca2 + -signaler mens M. persicae feed fra blade med en fluorescerende Ca2 + biosensor, med både bladlus og GCaMP3 tilbyder nye værktøjer til at dissekere rolle af Ca2 + under biotiske interaktioner.
Ca2 +-selektive microelectrodes blev tidligere brugt til at måle [Ca2 +] i planter11,12. For nylig, en bioluminescerende og fluorescerende tilgange er blevet standardiseret. Disse biosensorer binde Ca2 + og udsender lys, gør det muligt for un-paralleled muligheder for at studere Ca2 + dynamics i både celler og hele væv. Ca2 + biosensorer kan injiceres som farvestoffer eller stabilt produceret efter indførelsen af biosensor kodende sekvens i genomet af organismen via transformation (dvs., genetisk kodet biosensorer). Sidstnævnte tilbyder de store fordele ved at være let udtrykt i levende væv og i stand til at subcellulært lokalisering13. Aequorin protein, isoleret fra Aequorea victoria (vandmænd) var den første genetisk kodet Ca2 + biosensor indsat i planter14. Som en en bioluminescerende protein kræver aequorin ikke excitation af ekstern lys, som undgår farvelegeme blegning og autofluorescence15. Aequorin held har været anvendt til at måle [Ca2 +] strømme i respons på forskellige stimuli, herunder temperatur16, patogener17,18,19, salt stress20 ,21, og såret7. Dog er det ugunstigt på grund af den relativt lavt signal intensitet, gør påvisning af [Ca2 +] strømme i enkelte celler og væv med dårlig sensor udtryk vanskeligt13.
Udviklingen af Ca2 + biosensorer, som kan fluorescerer har suppleret aequorin med mulighed for detaljeret subcellulært og væv-niveau analyse af Ca2 + dynamics. En af de mest almindelige fluorescerende biosensorer er fluorescens resonans energioverførsel (FRET)-baseret kamæleoner. FRET kamæleoner er sammensat af to proteiner, typisk FFP og YFP, som er bragt i tæt kontakt med den konformationelle ændring induceret af bindingen af Ca2 + et calmodulin domæne i fælles fiskeripolitik-YFP linker region. Denne kontakt giver mulighed for overførsel af energi fra den fælles fiskeripolitik til YFP, og den deraf følgende ændring i fluorescens af disse fluorophores giver mulighed for nøjagtig kvantificering af [Ca2 +] gennem beregning af forholdet mellem fluorescens signaler fra to fluorophores22. FRET kamæleoner er overlegen i forhold til aequorin og ikke-ratiometric fluorescerende farvestoffer, da de er mindre berørt af udtryk niveau af protein23 og har ofte et større fluorescerende udbytte, giver mulighed for cellulært og subcellulært imaging23. For eksempel, har FRET kamæleoner for nylig anvendt til at identificere langdistance Ca2 + signaler i planter og løse disse til det cellulære niveau24,25,26.
En nylig gennembrud med fluorescerende normal god landbrugspraksis-baserede Ca2 + biosensorer har været udviklingen af meget følsomme single-fluorophore (single-FP) biosensorer. Single-FP biosensorer består af en enkelt cirkulært permutated normal god landbrugspraksis knyttet til en calmodulin og M13 peptid, med Ca2 + bindende til calmodulin, hvilket resulterer i en vand-medieret reaktion mellem calmodulin og normal god landbrugspraksis så protonate normal god landbrugspraksis og stigning fluorescerende udbytte27,28,29. Single-FP sensorer tilbyder flere fordele over FRET kamæleoner, herunder enklere eksperimentelle design og en potentielt højere tidsmæssige opløsning af imaging30. Selv om single-FP sensorer kan kvantificere absolut [Ca2 +] så enkelt som FRET sensorer, de er overlegne for analysen af den tidsmæssige og rumlige dynamik af Ca2 + -signaler5,23. GCaMPs er en af de best-established single-FP sensorer28 og har undergået flere revisioner for at forbedre deres fluorescerende udbytte, dynamikområde, Ca2 + affinitet og signal / støj forhold31,32 , 33 , 34. the GCaMPs har været med succes brugt i animalsk systemer, såsom zebrafisk motoriske neuroner35 og frugt flyve neuromuskulære vejkryds34. Tilfældig mutagenese af GCaMP3 har resulteret i yderligere klasser af single-FP sensorer, herunder de ultrasensitive GCaMP636 og GECOs29. GECOs blev for nylig brugt i Arabidopsis thaliana (herefter benævnt Arabidopsis) til at måle Ca2 + strømme i reaktion på ATP, chitin og bakterielle elicitor flg22. Denne undersøgelse viste også, at R-GECO biosensor udkonkurreret FRET Cameleon YC3.6 med hensyn til maksimal signal forandringer og signal / støj forholdet5.
På grund af brugervenlighed, fluorescerende højtydende, og høj tidsmæssige opløsning, der kan opnås med GCaMP biosensorer, var GCaMP3 genetisk kodet i Arabidopsis blomkålsmosaikvirus 35S promotor. De genetiske værktøjer til rådighed for Arabidopsis forskning giver mulighed for en detaljeret Molekylær analyse af Ca2 + signaler målt ved GCaMP3. Derudover kan GCaMP3 biosensor visualiseres under et fluorescens mikroskop i stedet for en dyrere Konfokal system. Denne protokol giver mulighed for hele-væv imaging, afgørende, når gennemføre eksperimenter med levende biotiske understreger. Forsøget er designet sådan at fritliggende blade fra 35S::GCaMP3 planter er flød i vand, til at forhindre insekt flugt og begrænse fodring af en specifik væv. Metoden beskrevet i denne hvidbog derfor giver mulighed for analyse af bladet Ca2 + dynamics under fodring af M. persicae, hvilket resulterer i en karakterisering af en roman plante signalering svar. Denne metode kan også tilpasses til at arbejde med andre biotiske understreger, som yderligere insektarter og mikrobielle patogener, og med andre plantevæv, såsom rødder.
Metoden beskrevet i denne hvidbog giver mulighed for tidstro analyse af planten Ca2 + signalering under en biotiske stress såsom insekt fodring. Det viser, at en af de første anlæg svar på sådanne trusler er en lokaliseret [Ca2 +]cyt elevation omkring fodring stedet af insektet. Ved hjælp af mutanter, denne metode vil give mulighed den molekylære og fysiologiske karakterisering af sådanne signaler, som ikke var tidligere muligt. Et afgørende skridt i denne protokol er at sikre at de fritliggende blade ikke overdrevent forstyrret under udstationering processen (trin 3.2) eller når du overfører insekter til blade (trin 4.5). Da den nuværende protokol giver en relativ måling af [Ca2 +]cyt snarere end en absolut koncentration, er det afgørende, at indstillingerne mikroskop holdes konstant gennem hele eksperimentet. Der er også potentiale for menneskelige bias under udvælgelsen af ROIs og analyse af data, og som sådan, det anbefales, at forsøgene er udført dobbelt-blind.
Der er flere betydelige fordele ved at måle [Ca2 +]cyt under biotiske stress med denne protokol. Først giver brugen af en enkelt fluorophore med en fluorescerende højtydende billeddannelse skal gennemføres på et stereomikroskop, som er billigere end ved hjælp af en Konfokal mikroskop. Brug af en enkelt fluorophore gør også dataindsamling og analyse simple, da der er bare én måling at optage. Desuden brug af et stereomikroskop giver mulighed for billeddannelse af hele blade, der er afgørende, eftersom mange biotiske interaktioner, herunder plante-bladlus interaktioner, forekommer på en stor rumlig skala. Den høje tidsmæssige opløsning af image capture muligt med GCaMP3, baseret på den hurtige afstandtagen af Ca2 + fra sensoren efter bindende23,30 og de fluorescerende højtydende, giver mulighed for målinger skal tages op til hver 5 s. Derudover forhindrer blad assay udslip af insekt, en nøgle begrænsning skridt til at gennemføre sådanne eksperimenter på hele planter (under forberedelse). Fritliggende bladene også sikre at insektet feeds fra en pre-definerede placering, giver mulighed for analyse af Ca2 + dynamics før, under og efter fodring. Denne protokol sikrer også, at bladene af lignende udviklingsstadier bruges til analyse.
Den største ulempe ved denne protokol stammer fra brugen af en ikke-ratiometric biosensor. Med single-FP biosensorer, kan variation i normal god landbrugspraksis emission skyldes eksperimentel variabler end [Ca2 +]cyt, såsom ændringer i cellulære pH, motion eller udtryk niveau af biosensor. Disse spørgsmål er ikke stødt med FRET kamæleoner under FRET, da overførsel af energi fra den fælles fiskeripolitik til YFP kun sker ved Ca2 + bindende. Andre forhold, der ændrer fluorescerende egenskaberne for de individuelle fluorophores er usandsynligt, at efterligne de modsatrettede ændringer i intensiteten af den fælles fiskeripolitik og YFP, og den ratiometric beregning, der bruges i sagens natur normaliserer målinger for mange af disse andre optiske artefakter23,30. Dette gør skøn over absolut [Ca2 +]cyt mere pålidelige med FRET kamæleoner. Derfor er GCaMP3 bedst brugt som en biosensor til at måle relative [Ca2 +]cyt, selvom det er stadig tilstrækkeligt til at påvise og karakterisere biologiske fænomener i planter5,(in preparation). Derfor er det vigtigt at bruge kontrolelementer til at vise, at den observerede effekt er på grund af Ca2 +, herunder Ca2 +-relaterede genetiske mutanter(under forberedelse) eller farmakologiske Ca2 + -kanal hæmmere såsom La3 + . Vigtigere, viser single-FP biosensorer typisk en større fluorescerende udbytte og større dynamikområde (dvs. en stigning i fluorescens ved Ca2 + bindende) end FRET kamæleoner23, hvilket gør GCaMP mere velegnet til væv-niveau imaging, mens FRET kamæleoner er et nyttigt værktøj for cellulære imaging med en Konfokal mikroskop5,25.
Under udførelsen af denne protokol er det muligt, at nogle spørgsmål vil opstå der kræver fejlfinding. Eksempelvis anbefales det, at prøver, hvor kontrol (ubehandlet) blade viser store [Ca2 +]cyt stigninger er kasseret (trin 6.3). Disse transienter er sandsynligvis resultatet af stress induceret af mikroskopi. Faktisk, blå lys er kendt for at fremkalde Ca2 + signaler38,39,40,41, og høj intensitet lys kan også resultere i temperatur og osmotisk understreger, som begge også fremkalde [Ca2 +]cyt højder21,25,42. For at reducere sådanne understreger, er det derfor vigtigt at foretage eksperiment i et godt ventileret og temperatur-kontrolleret rum og undgå unødigt lange eksponeringstider. Det er også vigtigt at ikke forstyrre bladene overdrevent under udstationering eller under mikroskopi til at forhindre touch-fremkaldte [Ca2 +]cyt stigninger43,44,45. Spørgsmål kan også opstå med insekt afregning. Med M. persicae, har insekter ikke nøjes med på bladene i flere prøver. Dette kunne være et resultat af sår-fremkaldte forsvar i fritliggende blade46,47, eller forstyrrelse af insekter af det blå lys. Faktisk, vision i M. persicae er reguleret af tre fotoreceptorer, herunder en med et peak følsomhed på 490 nm48. Reducere mikroskopi eksponering og håndtering af bladlus med pleje kan reducere angst og fremme afregning.
Den protokol, der er skitseret i den nuværende papir giver ny indsigt på molekylær forståelse af plante-insekt interaktioner og plante svar til biotiske stress. Det giver mulighed for visualisering af en af de første anlæg svar til insekt fodring og letter yderligere undersøgelser ved hjælp af de betydelige Arabidopsis genetiske ressourcer til rådighed. Derudover denne protokol giver mulighed for brug af levende organismer, i modsætning til ekstrakter49 eller elicitors50. I fremtiden, kan denne teknik anvendes til andre biotiske understreger, som yderligere insektarter, nematoder eller mikrobielle patogener, samt til abiotiske understreger. GCaMP3 mikroskopi kan også ændres til billede andet plantevæv, alternative ROIs på blad, eller endda hele planter. Desuden er der potentiale for biosensor være genetiskely kodet i yderligere plantearter. Derfor, den protokol, der er skitseret i dette papir har potentiale til at undercover det molekylære grundlag af Ca2 + signalering i en række roman biotiske interaktioner mellem planter og andre arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Grant Calder (John Innes centrum, U.K.) for den rådgivning vedrørende mikroskopi. Forfatterne også gerne takke John Innes centrum gartneri og entomologi afdelinger for deres bistand. Dette arbejde blev støttet af en PhD studentship fra John Innes Foundation (T.V.), give JJ004561-B-1 fra BBSRC og John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., TM og DS), et år i industriens placering fra John Innes centrum (M.A.) , en sommer studentship fra biokemiske Society UK (JC), JST PRESTO (MT) og tilskud MCB 1329723 og IOS-1557899 fra National Science Foundation (MT og S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |