Dit protocol beschrijft een eenvoudige methode voor het analyseren van calcium signalen in planten die zijn gegenereerd door het voeren van hemipteran insecten, zoals bladluizen. Arabidopsis thaliana getransformeerd met de GFP calcium biosensor GCaMP3 toestaan voor de real-time in vivo imaging van calcium dynamiek met een hoge temporele en ruimtelijke resolutie.
Calciumionen wordt voorspeld dat de belangrijkste signalering entiteiten worden tijdens biotische interacties, met calcium signalering die een gevestigde deel uitmaken van de plant verdediging reactie op microbiële elicitors en tot verwonding veroorzaakt door het kauwen van insecten, aanleiding kunnen geven tot systemische calcium signalen in planten. De rol van calcium in vivo tijdens biotische stress is echter nog onduidelijk. Dit protocol beschrijft het gebruik van een genetisch-gecodeerde calcium sensor calcium signalen in planten tijdens het voeden door een hemipteran plaag te detecteren. Hemipterans zoals bladluizen doorboren een klein aantal cellen met gespecialiseerd, langwerpige zuigende monddelen, waardoor ze de ideale tool om te studeren van calcium dynamiek wanneer een plant is geconfronteerd met een biotische stress, die zich onderscheidt van een verwonding reactie. Bovendien, fluorescerende biosensoren zijn een revolutie in de meting van de signalering moleculen in vivo in zowel planten als dieren. Uiting geven aan een GFP gebaseerde calcium biosensor, GCaMP3, in de model plant Arabidopsis thaliana zorgt voor de real-time beeldvorming van plantaardige calcium dynamiek tijdens insect voederen van dieren, met een hoge ruimtelijke en temporele resolutie. Een herhaalbare en robuuste assay is ontwikkeld met behulp van de fluorescentie microscopie van vrijstaande GCaMP3 bladeren, waardoor voor de continue meting van cytosolische calcium dynamiek vóór, tijdens en na het voederen van insecten. Dit blijkt een uiterst gelokaliseerde snelle calcium hoogte rond de bladluis voederen site die binnen een paar minuten optreedt. Het protocol kan worden aangepast aan andere biotische onderstreept, zoals andere insecten soorten, terwijl het gebruik van Arabidopsis thaliana voorziet in de snelle generatie van mutanten te vergemakkelijken van de moleculaire analyse van het fenomeen.
Calcium (Ca2 +) is een van de meest alomtegenwoordige signalering elementen in planten. Een tijdelijke stijging van cytosolische Ca2 + concentratie ([Ca2 +]cyt) is gedecodeerd door een complex netwerk van downstream-componenten en is betrokken bij het antwoord op beide abiotische en biotische onderstreept1,2. Een stijging van de [Ca2 +]cyt is één van de eerste reacties op microbiële elicitors, die een gemeenschappelijk deel uitmaken van de plant verdediging reactie3,4,5. Stijgingen van de [Ca2 +]cyt zijn ook waargenomen in reactie op de verwonding veroorzaakt door het kauwen van insecten, zoals vlinders6,7. Echter, de potentiële rol van plant Ca2 + signalen aanleiding om te leven van biotische bedreigingen die schade aan slechts een paar cellen toebrengen is niet onderzocht. De groene perzik bladluis Groene perzikluis is een hemipteran insect dat een belangrijke bedreiging voor de wereld landbouw8,9 vertegenwoordigt, en Ca2 + efflux van de extracellulaire ruimte is waargenomen in laat besmet met M. perzikluis10. Dit protocol schetst een robuuste en herhaalbare methode voor het meten van de plant Ca2 + signalen terwijl M. perzikluis feed van bladeren met behulp van een fluorescerende Ca2 + biosensor, met zowel bladluizen en GCaMP3 aanbod nieuwe hulpprogramma’s waarmee de rol van Ca2 + ontleden tijdens biotische interacties.
CA2 +-selectieve microelectrodes waren voorheen gebruikt om te meten [Ca2 +] in planten11,12. Meer recentelijk hebben bioluminescente en fluorescerende benaderingen worden gestandaardiseerd. Deze biosensoren binden Ca2 + en het uitstralen van licht, waardoor voor un-paralleled kansen om te studeren van Ca2 + dynamiek in hele weefsels en cellen. CA2 + biosensoren kunnen worden geïnjecteerd als kleurstoffen of stabiel geproduceerd bij de invoering van de biosensor codering sequentie in het genoom van het organisme via transformatie (dat wil zeggen, genetisch gecodeerd biosensoren). De laatste biedt belangrijke voordelen van het gemakkelijk uitgedrukt in levend weefsel en subcellular localisatie13staat. Het aequorin eiwit, geïsoleerd van Aequorea victoria (kwallen) was de eerste genetisch gecodeerde Ca2 + biosensor ingezet in planten14. Als een bioluminescente eiwit vereist aequorin geen excitatie door externe licht, dat vermijdt chromofore bleken en autofluorescence15. Aequorin is met succes gebruikt om te meten [Ca2 +] fluxen in reactie op verschillende stimuli, met inbegrip van temperatuur16, ziekteverwekkers17,18,19, zout stress20 ,21, en verwonden7. Echter is het nadeel door de relatief lage signaal intensiteit, waardoor de detectie van [Ca2 +] fluxen in afzonderlijke cellen en weefsels met slechte sensor expressie moeilijk13.
De ontwikkeling van Ca2 + biosensoren die kunt lichten heeft aangevuld aequorin doordat voor gedetailleerde subcellular en weefsel-niveau analyse van Ca2 + dynamiek. Een van de meest voorkomende fluorescerende biosensoren zijn de energieoverdracht van de fluorescentie-resonantie (FRET)-op basis van Cameleons. FRET Cameleons zijn samengesteld uit twee proteïnen, meestal GVB en YFP, die in nauw contact met de conformationele verandering geïnduceerd door de binding van Ca2 + aan een Calmoduline domein in de regio van de linker GVB-YFP worden gebracht. Dit contact staat de overdracht van energie van GVB naar YFP, en de resulterende wijzigingen in de fluorescentie van deze fluorophores voorziet in de nauwkeurige kwantificering van [Ca2 +] door middel van de berekening van de verhouding van de signalen van de fluorescentie van de twee fluorophores22. FRET Cameleons zijn superieur aan aequorin en niet-ratiometric TL verfstoffen, zoals ze zijn dat minder beïnvloed door de mate van expressie van het eiwit23 en hebben vaak een grotere fluorescerende rendement, waardoor voor cellulaire en subcellular imaging23. Bijvoorbeeld, hebben FRET Cameleons onlangs gebruikt om te identificeren van interlokale Ca2 + signalen in planten en op te lossen op het cellulaire niveau24,25,,26.
Een recente doorbraak met fluorescerende GFP gebaseerde Ca2 + biosensoren is de ontwikkeling van biosensoren hooggevoelige single-fluorophore (single-FP). Single-FP biosensoren bestaan uit één circulair levenservaringen GFP gekoppeld aan een Calmoduline en M13 peptide, Ca2 + binden aan Calmoduline, wat resulteert in een water-gemedieerde reactie tussen Calmoduline en GFP dus over protonate GFP en verhoging van de fluorescerende opbrengst27,28,29. Single-FP sensoren bieden verschillende voordelen ten opzichte van de FRET Cameleons, met inbegrip van eenvoudiger proefopzet en een potentieel hogere temporele resolutie van30imaging. Hoewel één-FP sensoren kunnen niet absolute [Ca2 +] zo eenvoudig kwantificeren als FRET sensoren, ze zijn superieur voor de analyse van de dynamiek van het temporele en ruimtelijke van Ca2 + 5,23signalen. GCaMPs zijn een van de gevaar single-FP sensoren28 en hebben ondergaan verschillende wijzigingen ter verbetering van hun fluorescerende opbrengst, dynamisch bereik, Ca2 + affiniteit en signal-to-noise ratio’s31,32 , 33 , 34. de GCaMPs hebben al met succes gebruikt in dierlijke systemen, zoals zebrafish motorische neuronen35 en fruit vliegen neuromusculaire kruispunten34. Willekeurige mutagenese van GCaMP3 heeft geresulteerd in extra klassen van single-FP sensoren, met inbegrip van de ultrasensitive GCaMP6-36 en de GECOs29. Het GECOs werden onlangs gebruikt in Arabidopsis thaliana (voortaan Arabidopsis genoemd) voor het meten van Ca2 + fluxen in reactie op de ATP, chitine en de bacteriële elicitor flg22. Deze studie toonde ook aan dat de R-GECO biosensor presteerde beter dan de FRET Cameleon YC3.6 in termen van maximale signaal verandering en signal-to-noise verhouding5.
Vanwege het gemak van gebruik, fluorescerende lucratieve en hoge temporele resolutie die kan worden bereikt met GCaMP biosensoren, was GCaMP3 genetisch gecodeerd in Arabidopsis onder de bloemkool mosaic virus 35S-promotor. De genetische tools beschikbaar voor Arabidopsis onderzoek toestaan voor de gedetailleerde moleculaire analyse van de Ca2 + signalen gemeten door GCaMP3. Daarnaast kan de GCaMP3 biosensor onder een fluorescentie Microscoop in plaats van een duurder confocal systeem worden gevisualiseerd. Dit protocol voorziet in geheel-weefsel imaging, essentieel zijn bij het uitvoeren van experimenten met live biotische onderstreept. Het experiment is zodanig ontworpen dat vrijstaande bladeren van 35S::GCaMP3 planten zijn zweefden in water, om te voorkomen dat insecten ontsnappen en te beperken vervoederen aan een specifieke weefsel. De methode die in dit document worden beschreven daarom voorziet in de analyse van blad Ca2 + dynamiek tijdens het voeden door M. perzikluis, wat resulteert in de karakterisering van een nieuwe plant signalering reactie. Deze methode kan ook worden aangepast om te werken met andere biotische onderstreept, zoals andere insecten soorten en microbiële ziekteverwekkers, en met andere plantaardige weefsels, zoals wortels.
De in dit document beschreven methode voorziet de real-time analyse van plant Ca2 + signalering tijdens een biotische stress zoals insecten voeden. Het toont aan dat een van de eerste reacties van de plant op dergelijke bedreigingen een gelokaliseerde [Ca2 +]cyt hoogte rond het voederen site van het insect is. Door het gebruik van mutanten, deze methode zal toestaan voor de de moleculaire en fysiologische karakterisatie van dergelijke signalen, die niet eerder mogelijk was. Een cruciale stap in dit protocol is te zorgen dat de vrijstaande bladeren niet overdreven gestoord zijn tijdens het detachement (stap 3.2) of bij het overbrengen van insecten naar de bladeren (stap 4.5). Gezien het feit dat het huidige protocol een relatieve meting van [Ca2 +]cyt in plaats van een absolute concentratie biedt, is het essentieel dat de instellingen van de Microscoop, worden gedurende het gehele experiment constant gehouden. Er is ook het potentieel voor menselijke bias tijdens de selectie van ROIs en de analyse van de gegevens, en als zodanig, is het raadzaam dat de experimenten zijn uitgevoerd dubbelblinde.
Er zijn verschillende belangrijke voordelen van meten [Ca2 +]cyt tijdens biotische stress met dit protocol. Eerst, kan het gebruik van een enkele fluorophore met een hoge opbrengst te TL de beeldvorming worden uitgevoerd op een stereomicroscoop, die is minder kostbaar dan het gebruik van een confocal microscoop. Het gebruik van een enkele fluorophore maakt ook gegevensverzameling en analyse eenvoudig, aangezien er slechts één meting om te registreren. Bovendien is het gebruik van een stereomicroscoop zorgt voor de beeldvorming van hele bladeren, die essentieel is, gezien het feit dat vele biotische interacties, met inbegrip van plant-bladluis interacties, op grote ruimtelijke schaal optreden. De hoge temporele resolutie van de afbeelding mogelijk met GCaMP3, gebaseerd op de snelle scheiding van Ca2 + van de sensor na bindende23,30 en de TL hoogrentende vangen, voorziet van de metingen te nemen tot elke 5 s. Bovendien, de blad-bepaling voorkomt het ontsnappen van het insect, een sleutel beperken stap naar dergelijke experimenten op hele planten (in voorbereiding). De vrijstaande bladeren er ook voor zorgen dat het insect vanaf een vooraf gedefinieerde locatie voedt, waardoor voor de analyse van Ca2 + dynamiek vóór, tijdens en na de voeding. Dit protocol zorgt er ook voor dat de bladeren van soortgelijke ontwikkelingsstadia worden gebruikt voor analyse.
Het grootste nadeel van dit protocol is afkomstig van het gebruik van een niet-ratiometric biosensor. Met single-FP biosensoren, kan variatie in GFP emissie voortvloeien uit experimentele variabelen dan [Ca2 +]cyt, zoals veranderingen in cellulaire pH, beweging of het niveau van de expressie van de biosensor. Deze kwesties zijn niet ondervonden met FRET Cameleons tijdens FRET, zoals de overdracht van energie van GVB naar YFP treedt alleen op bij Ca2 + bindend. Andere voorwaarden die de fluorescerende eigenschappen van de individuele fluorophores wijzigen zijn onwaarschijnlijk om na te bootsen de conflicterende wijzigingen in de intensiteit van het GVB en YFP, en de berekening van de ratiometric die inherent wordt gebruikt normaliseert de metingen voor veel van deze andere optische artefacten23,30. Dit maakt de schattingen van de absolute [Ca2 +]cyt betrouwbaarder met FRET Cameleons. Bijgevolg, GCaMP3 het best gebruiken als een biosensor voor het meten van relatieve [Ca2 +]cyt, hoewel er nog steeds voldoende om te detecteren en karakteriseren van biologische fenomenen in planten5,(in preparation). Het is daarom essentieel om besturingselementen te gebruiken om te laten zien dat de waargenomen effect veroorzaakt door Ca2 + wordt, met inbegrip van Ca2 +-gerelateerde genetische mutanten(in voorbereiding) of farmacologische Ca2 + kanaal remmers zoals La3 + . Nog belangrijker is, weer single-FP biosensoren meestal een grotere fluorescerende rendement en een groter dynamisch bereik (dat wil zeggen, een toename van bloeien op Ca2 + bindende) dan FRET Cameleons23, waardoor de GCaMP meer geschikt voor weefsel-niveau imaging, terwijl FRET Cameleons een nuttig instrument voor cellulaire beeldbewerking met een confocal microscoop5,25 vormen.
Tijdens de uitvoering van dit protocol is het mogelijk dat sommige kwesties waarvoor het oplossen van problemen zullen ontstaan. Bijvoorbeeld, is het raadzaam dat monsters waarin het besturingselement (onbehandeld) blad bevat grote [Ca2 +]cyt waterstand zich bevinden verwijderd (stap 6.3). Dergelijke transiënten zijn waarschijnlijk het gevolg van stress veroorzaakt door de microscopie. Inderdaad, blauw licht is bekend te ontlokken van Ca2 + signalen38,39,40,41, en de hoge intensiteit licht kan ook resulteren in temperatuur en osmotische benadrukt, die beide ook uitlokken [Ca2 +]cyt waterstand21,25,42. Daarom, ter beperking van dergelijke benadrukt, is het belangrijk om uit te voeren van het experiment in een goed geventileerde en temperatuurgevoelig kamer en om te voorkomen dat onnodig lange belichtingstijden. Het is ook belangrijk dat het niet verstoren van de bladeren overdreven tijdens detachement of tijdens de microscopie ter voorkoming van touch-ontlokte [Ca2 +]cyt waterstand43,44,45. Problemen kunnen ook optreden met insect regelen. Met M. perzikluis, doen de insecten niet vestigen op de bladeren in verschillende monsters. Dit zou een gevolg van wond-ontlokte verdediging in de vrijstaande bladeren46,47, of de verstoring van de insecten door het blauwe licht. Inderdaad, visie in M. perzikluis wordt beheerst door drie researchdieren, waarvan één met een piek gevoeligheid van 490 nm48. De microscopie blootstelling te beperken en de behandeling van de bladluizen met zorg kunnen verminderen van nood en moedigen regelen.
Het protocol beschreven in het huidige document geeft nieuwe inzichten op het moleculaire begrip van plant-insect interacties en de reactie van de plant op biotische stress. Het stelt voor de visualisatie van een van de eerste reacties van de plant op het voederen van insecten, en vergemakkelijkt verder onderzoeken door middel van de aanzienlijke Arabidopsis genetische hulpbronnen beschikbaar. Bovendien, dit protocol voorziet in het gebruik van levende organismen, in tegenstelling tot extraheert49 of elicitors50. Deze techniek kan in de toekomst worden toegepast op andere biotische onderstreept, zoals andere insecten soorten nematoden en microbiële ziekteverwekkers, alsmede op abiotische benadrukt. De microscopie van GCaMP3 kan ook worden gewijzigd naar image andere plantaardige weefsels, alternatieve ROIs op het blad, of zelfs hele planten. Bovendien, er is het potentieel voor de biosensor als genetischely gecodeerd in extra plantensoorten. Bijgevolg, het protocol beschreven in dit document heeft de potentie om undercover de moleculaire basis van Ca2 + signalering in een bereik van roman biotische interacties tussen planten en andere soorten.
The authors have nothing to disclose.
We zouden graag bedanken Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) voor naar de raadgeving over microscopie. De auteurs ook bedank het John Innes Centre tuinbouw en entomologie afdelingen voor hun hulp. Dit werk werd ondersteund door een PhD studententijd van het John Innes Foundation (T.V.), het verlenen van B/JJ004561/1 van de BBSRC en de John Innes Foundation (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. en D.S.), een jaar in de industrie plaatsing van het John Innes Centre (M.A.) , een zomer studententijd van de biochemische Society of de UK (J.C.), JST PRESTO (M.T.) en subsidies MCB 1329723 en IOS-1557899 van de National Science Foundation (M.T. en S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |