Denne protokollen skisserer en enkel metode for å analysere kalsium signaler i planter generert av fôring hemipteran insekter, som bladlus. Arabidopsis thaliana forvandles med GFP kalsium biosensor GCaMP3 gir sanntid i vivo avbilding av kalsium dynamics med høy timelige og romlig oppløsning.
Kalsiumioner er spådd til å bli viktig signalnettverk enheter under biotiske samhandling, med kalsium signalering danner en del av anlegget forsvar svaret mikrobiell elicitors og såret skyldes tygge insekter, fremlokkende systemisk kalsium signaler i planter. Rollen av kalsium i vivo under biotiske stress er imidlertid uklart. Denne protokollen beskriver bruken av en genetisk kodet kalsium sensor å oppdage kalsium signaler i planter under mating av en hemipteran pest. Felles at munndelene som bladlus pierce et lite antall celler med spesialisert, langstrakte suge munndeler, noe som gjør dem ideelle verktøyet å studere kalsium dynamics når en plante står overfor en biotiske stress, som er adskilt fra såret svar. I tillegg er fluorescerende biosensors revolusjonerer målingen signalnettverk molekyler i vivo i både dyr og planter. Uttrykke en GFP-baserte kalsium biosensor, GCaMP3, i modellen fabrikken Arabidopsis thaliana gir sanntid avbilding av anlegget kalsium dynamics under insekt fôring, med en høy romlig og tidsmessige oppløsning. En repeterbar og robust analysen har blitt utviklet ved hjelp av fluorescens mikroskopi frittliggende GCaMP3 blader, tillater for kontinuerlig måling av cytosolic kalsium dynamics før, under og etter insekt fôring. Dette avslører en sterkt lokalisert rask kalsium høyde rundt bladlus mate nettsted som oppstår innen få minutter. Protokollen kan tilpasses andre biotiske påkjenninger, for eksempel insekt vokser mens bruk av Arabidopsis thaliana tillater for rask generasjon av mutanter til rette molekylær analyse av fenomenet.
Kalsium (Ca2 +) er en av de mest utbredte signalnettverk elementene i planter. En forbigående økning i cytosolic Ca2 + konsentrasjon ([Ca2 +]cyt) dekodes av et kompleks nettverk av nedstrøms komponenter og er involvert i svaret til både abiotiske og biotiske påkjenninger1,2. En økning i [Ca2 +]cyt er en av de første svarene å mikrobiell elicitors, danner en vanlig del av anlegget forsvar svar3,4,5. Stiger i [Ca2 +]cyt har også blitt observert svar på såret skyldes tygge insekter, som lepidopterans6,7. Imidlertid potensielle rolle plante Ca2 + signaler Svar å leve biotiske trusler som skade bare noen celler ikke har blitt undersøkt. Den grønne fersken bladlus Myzus persicae er et hemipteran insekt som representerer en betydelig trussel mot verden landbruk8,9, og Ca2 + middelklasseinnbyggere fra ekstracellulære plass er observert i blader infisert med M. persicae10. Denne protokollen beskriver en robust og repeterbare metode for å måle anlegget Ca2 + signaler mens M. persicae feed fra bladene med et fluorescerende Ca2 + biosensor, med både bladlus og GCaMP3 tilbyr romanen verktøy som dissekere rollen av Ca2 + under biotiske interaksjoner.
Ca2 +-selektiv microelectrodes tidligere ble brukt til å måle [Ca2 +] i planter11,12. Flere nylig, bioluminescent og fluorescerende tilnærminger har blitt standardisert. Disse biosensors binder Ca2 + og avgir lys, slik at un paralleled muligheter til å studere Ca2 + dynamikk i både celler og hele vev. Ca2 + biosensors kan injiseres som fargestoffer eller stabilt produsert ved innføring av biosensor koding sekvens i genomet av organismen via transformasjon (dvs. genetisk kodet biosensors). Sistnevnte gir store fordeler av å være enkelt uttrykkes i levende vev og dyktige subcellular lokalisering13. Aequorin protein, isolert fra Aequorea victoria (maneter) var den første genetisk kodet Ca2 + biosensor i planter14. Som en bioluminescent protein krever ikke aequorin magnetisering av eksterne lys, som unngår chromophore bleking og autofluorescence15. Aequorin har blitt brukt til å måle [Ca2 +] flukser i respons på ulike stimuli, inkludert temperatur16, patogener17,18,19, salt stress20 ,21, og såret7. Men er det vanskeligstilte av relativt lav signalstyrke intensiteten, gjør påvisning av [Ca2 +] flukser i individuelle celler og vev med dårlig sensor uttrykk vanskelig13.
Utviklingen av Ca2 + biosensors som kan fluoresce utfylt aequorin ved at for detaljert subcellular og vev-nivå analyse av Ca2 + dynamics. En av de vanligste fluorescerende biosensors er fluorescens resonans energi-overføring (bånd)-basert Cameleons. BÅND Cameleons består av to proteiner, vanligvis CFP og YFP, som er brakt i nærkontakt av conformational endringen av binding av Ca2 + et calmodulin domene i regionen CFP-YFP linker. Denne kontakten kan om overføring av energi fra CFP YFP, og den resulterende forandringen i fluorescens av disse fluorophores gir nøyaktig kvantifisering av [Ca2 +] gjennom beregningen av forholdet mellom fluorescens signalene fra to fluorophores22. BÅND Cameleons er bedre enn aequorin og ikke-ratiometric fluorescerende fargestoffer, som de er mindre påvirket av hvilket uttrykk protein23 og ofte har en større fluorescerende avkastning, tillater for mobilnettet og subcellular tenkelig23. For eksempel har bånd Cameleons nylig brukt til å identifisere langdistanse Ca2 + signaler i planter og løse disse til mobilnettet nivå24,25,26.
Et siste gjennombrudd med fluorescerende GFP-baserte Ca2 + biosensors har vært utviklingen av svært følsom single-fluorophore (single-FP) biosensors. Single-FP biosensors består av en enkelt sirkulært permutated GFP koblet til et calmodulin M13 peptid, med Ca2 + binding til calmodulin, noe som resulterer i en vann-mediert reaksjon mellom calmodulin og GFP så protonere GFP og øke fluorescerende avkastning27,28,29. Single-FP sensorer tilbyr flere fordeler sammenlignet med bånd Cameleons, inkludert enklere eksperimentell design og potensielt høyere timelige oppløsning Imaging30. Selv om single-FP sensorer ikke kan tallfeste absolutt [Ca2 +] som bare som bånd sensorer, de er overlegen for analyse av timelige og romlig dynamikken i Ca2 + signaler5,23. GCaMPs er en av de best etablerte single-FP sensorer28 og har gjennomgått flere endringer for å forbedre deres fluorescerende avkastning, dynamisk område, Ca2 + affinitet og signal-til-støy-forhold31,32 , 33 , 34. the GCaMPs har blitt brukt i dyr systemer, slik som sebrafisk motor neurons35 og frukt fly nevromuskulær veikryss34. Tilfeldig mutagenese av GCaMP3 har resultert i flere klasser av enkelt-FP sensorer, inkludert de ultrasensitive GCaMP636 og GECOs29. GECOs ble nylig brukt i Arabidopsis thaliana (heretter referert til som Arabidopsis) å måle Ca2 + flukser svar på ATP og chitin bakteriell elicitor flg22. Denne studien viste også at R-GECO-biosensor oppnådd bånd Cameleon YC3.6 i maksimal signal endring og signal-til-støy forholdet5.
På grunn av brukervennlighet bruk, høykapasitets fluorescerende og høy midlertidig løsning som kan oppnås med GCaMP biosensors, var GCaMP3 genetisk kodet i Arabidopsis under blomkål mosaikk virus 35S arrangøren. Genetisk verktøyene for Arabidopsis forskning gir detaljert molekylær analyse av Ca2 + signaler målt ved GCaMP3. I tillegg kan GCaMP3 biosensor visualiseres under fluorescens mikroskop snarere enn en dyrere AC confocal system. Denne protokollen gir hele-vev imaging essensielt når gjennomføre eksperimenter med live biotiske påkjenninger. Eksperimentet er utformet slik at frittliggende blader fra 35S::GCaMP3 planter er fløt i vann, å forhindre insekt rømme og begrense fôring til en bestemt vev. Metoden beskrevet i dette dokumentet derfor tillater for analyse av blad Ca2 + dynamics under mating av M. persicae, resulterer i karakterisering av en roman plante signalering svar. Denne metoden kan også tilpasses med andre biotiske påkjenninger, for eksempel insekt vokser og mikrobiell patogener, og med andre plante vev, som røtter.
Metoden beskrevet i dette dokumentet kan for sanntids analyse av Ca2 + signalering under en biotiske stress som insekt fôring. Viser at en av første anlegget svar slike trusler er en lokalisert [Ca2 +]cyt heving rundt fôring området av insekt. Ved hjelp av mutanter, denne metoden vil tillate for den molekylære og fysiologiske karakterisering av slike signaler, som ikke var mulig tidligere. Et viktig skritt i denne protokollen er å sikre at frittliggende bladene ikke er overdrevet forstyrret avdeling (trinn 3.2) eller når du overfører insekter til bladene (trinn 4.5). Gitt at gjeldende protokollen gir en relativ måleenhet for [Ca2 +]cyt i stedet for en absolutt konsentrasjon, er det viktig at innstillingen mikroskop holdes konstant gjennom hele eksperimentet. Det er også muligheten for menneskelig bias under valg av ROIs og analyse av data, og som sådan, anbefales det at eksperimenter er gjennomført dobbelt-blind.
Det er flere viktige fordeler av måler [Ca2 +]cyt under biotiske stress med denne protokollen. Først, bruk av en enkelt fluorophore med en høy fluorescerende avkastning lar avbilding gjennomføres på en stereomicroscope, som er mindre kostnadskrevende enn å bruke en AC confocal mikroskop. Bruk av en enkelt fluorophore gjør også datainnsamling, analyse enkelt, som det er bare ett mål å registrere. I tillegg kan bruken av en stereomicroscope for avbilding av hele blader, som det er viktig at mange biotiske interaksjoner, inkludert plante-bladlus interaksjoner, oppstår romlige stort. Høy timelige oppløsningen til fange mulig med GCaMP3, basert på den raske tilknytningene til Ca2 + fra sensoren etter bindende23,30 og fluorescerende høykapasitets, tillater mål å bli tatt opp til hver 5 s. Videre hindrer blad analysen rømning av insekt, en nøkkel som begrenser skritt for å gjennomføre slike eksperimenter på hele planter (i forberedelse). Frittstående bladene også sikre at insekt strømmer fra en forhåndsdefinert plassering, slik at for analyse av Ca2 + dynamics før, under og etter fôring. Denne protokollen sikrer også at bladene av lignende utviklingsstadier brukes for analyse.
Det hovedavdeling ulempen av denne protokollen kommer fra bruk av en ikke-ratiometric biosensor. Med ett-FP biosensors, kan det føre variasjon i GFP utslipp fra experimental variabler enn [Ca2 +]cyt, for eksempel endringer i mobilnettet pH, bevegelse eller hvilket uttrykk i biosensor. Disse problemene er ikke oppdaget med bånd Cameleons under bånd, overføring av energi fra CFP til YFP bare forekommer ved Ca2 + bindende. Andre forhold som endrer fluorescerende egenskapene for den personlige fluorophores er usannsynlig å etterligne de motstridende endringene i intensiteten av CFP og YFP, og ratiometric beregningen som brukes iboende normaliserer målene for mange av disse andre optisk gjenstander23,30. Dette gjør beregninger av absolutt [Ca2 +]cyt mer pålitelig med bånd Cameleons. Følgelig brukes GCaMP3 som en biosensor til å måle relative [Ca2 +]cyt, selv om det er fremdeles nok til å oppdage og karakterisere biologiske fenomener i planter5,(in preparation). Derfor er det viktig å bruke kontroller til å vise at den observerte effekten skyldes Ca2 +, inkludert Ca2 +-relaterte genetiske mutanter(i forberedelse) eller farmakologiske Ca2 + kanal hemmere som La3 + . Viktigere, vise enkelt-FP biosensors vanligvis en større fluorescerende avkastningen og større dynamisk område (dvs. en økning i florescence på Ca2 + bindende) enn bånd Cameleons23, som gjør GCaMP mer egnet til vev-nivå bildebehandling, mens bånd Cameleons er et nyttig verktøy for mobil bildebehandling med en AC confocal mikroskop5,25.
Under kjøring av denne protokollen er det mulig at noen problemer vil oppstå som krever problemløsing. Det anbefales for eksempel som eksempler der kontroll (ubehandlet) blad viser store [Ca2 +]cyt høyder er forkastet (trinn 6.3). Slike transienter er sannsynligvis et resultat av stress indusert av mikroskopi. Faktisk, blått lys kjent å lokke fram Ca2 + signaler38,39,40,41, og høy intensitet lys kan også resultere i temperatur og osmotisk påkjenninger, begge også framprovosere [Ca2 +]cyt høyder21,25,42. Derfor redusere slike påkjenninger, er det viktig å gjennomføre eksperimentet i et godt ventilert og temperaturkontrollerte rom og unngå unødvendig lange eksponeringstider. Det er også viktig å ikke forstyrre bladene overdrevet under avdeling eller under mikroskopi å hindre touch-skapte [Ca2 +]cyt høyder43,44,45. Problemene kan også oppstå med insekt settling. Med M. persicaeslå insekter ikke på bladene i flere prøver. Dette kan være et resultat av såret-skapte forsvar i frittstående blader46,–47, eller forstyrrelse av insekter av blått lys. Faktisk styres synet på M. persicae av tre fotoreseptorer, inkludert ett med en topp følsomhet på 490 nm48. Redusere mikroskopi eksponering og håndtering bladlus med omsorg kan redusere nød og oppmuntre settling.
Protokollen i dagens papir gir ny innsikt på molekylære forståelsen av plante-insekt interaksjoner og plante svaret biotiske stress. Det gir effekten av en av første anlegget svar insekt fôring og forenkler videre undersøkelser ved hjelp av de betydelige Arabidopsis plantegenetiske ressursene tilgjengelig. I tillegg denne protokollen tillater bruk av levende organismer, i motsetning til ut49 eller elicitors50. I fremtiden, kan denne teknikken brukes til andre biotiske påkjenninger, for eksempel insekt vokser og nematoder mikrobiell patogener, og abiotiske stress. GCaMP3 mikroskopi kan også endres for å image andre plante vev, alternativ ROIs på bladet, eller hele planter. Videre er mulig for biosensor å være genetically kodet i flere plantearter. Følgelig har protokollen i dette papiret potensial til undercover molekylær grunnlag av Ca2 + signalering i en rekke romanen biotiske interaksjoner mellom planter og andre arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) for råd om mikroskopi. Forfatterne også ønsker å takke John Innes sentrum hagebruk og entomologi avdelinger for deres hjelp. Dette arbeidet ble støttet av en PhD studentship fra John Innes Foundation (T.V.), gi B/JJ004561/1 fra BBSRC og John Innes Foundation (TV, M.A., JC, S.M., sh, T.M. og DS), et år i bransjen plassering fra John Innes sentrum (M.A.) , en sommer studentship fra biokjemiske Society UK (JC), JST VIPs (Mt) og gir kalt MCB 1329723 og IOS-1557899 fra National Science Foundation (MT og S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |