Этот протокол определяет простой метод для анализа сигналов кальция в растениях, порожденных кормления членистохоботные насекомых, таких как тли. Резуховидка преобразована с GFP биосенсор кальция GCaMP3 позволяют для изображений в реальном времени в vivo кальция динамики с высоким временным и пространственным разрешением.
Ионы кальция, по прогнозам, быть Основные сигнальные подразделения во время биотических взаимодействия с кальция сигнализации, установленные частью реакции обороны завода микробной elicitors и ранив вызванных жевательные насекомых, вызывая системных кальция сигналы в растениях. Однако роль кальция в vivo во время биотического стресса до сих пор неясно. Этот протокол описывает использование генетически закодированный кальция датчика обнаружения сигналов кальция в растениях во время кормления членистохоботные вредителей. Hemipterans как тли проколоть небольшое количество клеток с специализированными, удлиненные, сосание ротовые, что делает их идеальным инструментом для изучения динамики кальция когда растение сталкивается с биотического стресса, который отличается от ранив ответа. Кроме того флуоресцентный биодатчики революционизируют измерения сигнальной молекулы в естественных условиях в животных и растений. Выражая биосенсор на основе GFP кальция, GCaMP3, в модели растение Arabidopsis thaliana позволяет в реальном времени изображений растений кальция динамики во время кормления, с высоким пространственным и временным разрешением насекомых. Надежные и повторяемые пробирного был разработан с помощью микроскопии флуоресцирования отдельностоящий GCaMP3 листьев, позволяя для непрерывного измерения динамики цитозольной кальция до, во время и после кормления насекомых. Это свидетельствует о весьма локализованные быстрого кальция высоты вокруг тля кормления сайта, который происходит в течение нескольких минут. Протокол может быть адаптирована к других биотических стрессов, например дополнительных видов насекомых, в то время как использование Arabidopsis thaliana для быстрого поколения мутантов позволяет облегчить молекулярный анализ этого явления.
Кальций (Ca2 +) является одним из наиболее распространенным сигнальных элементов в растениях. Временный рост в цитозольной Ca2 + концентрации ([Ca2 +]cyt) декодируется в сложной сети компонентов нисходящего потока и участвует в ответ на оба абиотических и биотических стрессов1,2. Рост [Ca2 +]cyt является одна из первых реакций микробной elicitors, формирование общей частью4,3,завод обороны ответ5. Растет в [Ca2 +]cyt наблюдались также в ответ на ранение, вызванные жевательные насекомых, таких как триплоидная6,7. Однако потенциальная роль растений Ca2 + сигналов в ответ жить биотических угроз, которые вызывают повреждения только несколько клеток не были изучены. Зеленый персик тля Myzus persicae членистохоботные насекомое, которое представляет собой значительную угрозу для мирового сельского хозяйства8,9, и Ca2 + измеряем из внеклеточного пространства наблюдается в листья зараженная с . м. persicae10. Этот протокол описывает метод надежные и повторяемые для измерения завод Ca2 + сигналов а . м. persicae кормить из листьев, с использованием флуоресцентных Ca2 + биосенсор, тли и GCaMP3 предлагает новые инструменты для вскрыть роль Ca2 + в биотических взаимодействий.
CA2 +-селективный микроэлектродов ранее использовались для измерения [Ca2 +] в11,растений12. Совсем недавно стали стандартизированных биолюминесцентных и флуоресцентные подходы. Эти биодатчики связывают Ca2 + и испускают свет, позволяя ООН параллельно возможности для изучения Ca2 + динамика в клетки и всей ткани. CA2 + биодатчики может быть вставлен как красители или стабильно производится после введения биосенсор кодирования последовательности в геном организма через преобразования (то есть, генетически закодированный биосенсоры). Последний предлагает основные преимущества легко выражается в живой ткани и способных субцеллюлярные локализации13. Экворин белок, изолированных от Aequorea victoria (медузы) был первым генетически закодированный Ca2 + биосенсор развернуты в растения14. Как биолюминесцентных белков Экворин не требует возбуждения внешний свет, который избегает хромофора отбеливания и аутофлюоресценция15. Экворин успешно используется для измерения [Ca2 +] потоков в ответ на различные стимулы, в том числе температура16, патогенов17,18,19, соль подчеркнуть20 ,21и ранив7. Однако это является неблагоприятном положении относительно низкий сигнал интенсивности, что делает обнаружение [Ca2 +] потоков в отдельных клетках и тканях с плохой датчик выражение трудно13.
Разработка Ca2 + биодатчиков, которые могут флуоресцировать дополняет Экворин, позволяя для детального анализа субцеллюлярные и тканевом уровне Ca2 + динамики. Одним из наиболее распространенных флуоресцентные биодатчики являются передачи энергии резонансной флюоресценции (ЛАДА)-на основе Cameleons. Лада Cameleons состоят из двух белков, обычно CFP и рекламы ЯФП, которые принесены в тесный контакт конформационные изменения, вызванные связывание Ca2 + Кальмодулин домен в регионе компоновщика СЛП-рекламы ЯФП. Этот контакт позволяет рекламы ЯФП передачи энергии от СЛП, и результирующие изменения в флуоресцировании этих флуорофоров позволяет для точного количественного определения [Ca2 +] через расчет коэффициента флуоресценции сигналов от двух флуорофоров22. Лада Cameleons превосходят Экворин и не ratiometric флуоресцентными красителями, как они что меньше влияет на уровень экспрессии белка23 и часто имеют большую доходность флуоресцентные, позволяя на клеточном и субклеточном изображений23. Например лад Cameleons были недавно использовали для определения междугородних Ca2 + сигналов в растениях и решить их на клеточном уровне24,25,26.
Недавний прорыв с флуоресцентные GFP-основе Ca2 + биодатчики была разработка биосенсоров высокочувствительный сингл Флюорофор (сингл FP). Биодатчики сингл-FP состоят из одного циркулярно permutated GFP связан с Кальмодулин и M13 пептид, с Ca2 + привязка к Кальмодулин, что привело к воде опосредованной реакции между Кальмодулин и GFP так protonate GFP и увеличение Флуоресцентный доходность27,,2829. Одноместный-FP датчики предлагают несколько преимуществ над Cameleons ладу, включая проще экспериментальный дизайн и потенциально временным разрешением изображений30. Хотя одно FP датчики не может количественно абсолютной [Ca2 +] как просто как датчики ладу, они превосходят для анализа динамики временных и пространственных Ca2 + сигналов5,23. GCaMPs являются одним из насчитывающий сингл FP датчики28 и претерпели некоторые изменения для повышения их флуоресцентных урожайности, динамический диапазон, Ca2 + близость и соотношения сигнал шум31,32 , 33 , 34. GCaMPs успешно используются в системах животных, таких как данио рерио двигательных нейронов35 и фруктов летать нервно развязок34. Случайные мутагенеза GCaMP3 привело к дополнительные классы сингл FP датчиков, включая сверхчувствительная GCaMP636 и GECOs29. GECOs недавно использовались в проростках Arabidopsis thaliana (далее арабидопсиса) для измерения Ca2 + потоков в ответ СПС, хитин и бактериальных elicitor flg22. Это исследование также продемонстрировал, что R-GECO биосенсор превысил Cameleon YC3.6 ладу с точки зрения максимального сигнала изменения и сигнал шум коэффициент5.
Из-за простоты использования, флуоресцентный высокодоходных и высокой временное разрешение, которое может быть достигнуто с GCaMP биосенсорах GCaMP3 был генетически закодированы в проростках Arabidopsis под вируса мозаики цветной капусты 35S промоутер. Генетической инструменты для выращивания арабидопсиса исследований позволяют для детального анализа молекулярного Ca2 + сигналов измеряется GCaMP3. Кроме того GCaMP3 биосенсор могут быть визуализированы под микроскопом флуоресценции, вместо того, чтобы дороже конфокальный системы. Этот протокол позволяет целом ткани изображений, необходимых при проведении экспериментов с живой биотических стрессов. Этот эксперимент разработан таким образом, что отдельные листья из 35S::GCaMP3 растений плыли в воде, чтобы предотвратить насекомых побег и ограничить питание к конкретной ткани. Метод, изложенных в настоящем документе таким образом позволяет для анализа листьев Ca2 + динамика во время кормления, м. persicae, приводит в характеристике Роман завода сигнализации ответ. Этот метод также может быть адаптирована для работы с других биотических стрессов, таких дополнительных видов насекомых и патогенных микроорганизмов и других растительных тканей, таких как корни.
Метод, описанный в этом документе позволяет в реальном времени анализ растений Ca2 + сигнализации во время биотического стресса, такие как Насекомое кормления. Это показывает, что одним из первых растений ответы на такие угрозы локализованных [Ca2 +]cyt высоты вокруг места кормления насекомых. Благодаря использованию мутантов, этот метод позволит для молекулярных и физиологических характеристик таких сигналов, которого не было возможно ранее. Важнейшим шагом в этом протоколе является обеспечить отдельные листья не чрезмерно нарушается во время процесса отряд (шаг 3.2) или при передаче насекомых на листья (шаг 4.5). Учитывая, что текущий протокол обеспечивает относительное измерение [Ca2 +]cyt , а не абсолютная концентрация, важно, что Микроскоп параметры хранятся постоянно на протяжении всего эксперимента. Существует также потенциал для человека предвзятости в ходе отбора трансформирования и анализ данных, и таким образом, рекомендуется, что эксперименты проводятся двойного слепого.
Есть несколько существенных преимуществ измерения [Ca2 +]cyt во время биотического стресса с настоящим Протоколом. Во-первых использование одного Флюорофор с флуоресцентные высокодоходных позволяет томографии проводиться на стереомикроскопом, который является менее дорогостоящим, чем с помощью конфокального микроскопа. Использование одного Флюорофор также упрощает сбор и анализ данных, как есть только одно измерение для записи. Кроме того использование стереомикроскопом позволяет для визуализации всего листья, который имеет важное значение, учитывая, что многие биотических взаимодействия, включая завод тля взаимодействий, происходят в больших пространственных масштабах. Высокая временное разрешение изображения захвата с GCaMP3, основанный на быстрое отключение Ca2 + от датчика после привязки23,30 и высокодоходных флуоресцентных, позволяет для измерений, которые необходимо принять до каждые 5 s. Кроме того лист assay предотвращает побег насекомое, ограничивая шаг для проведения таких экспериментов на весь растений (в подготовке)ключ. Отдельностоящий листья также убедиться, что насекомое каналы из предопределенные местоположения, позволяя для анализа динамики Ca2 + до, во время и после кормления. Этот протокол также гарантирует, что листья подобные этапы развития используются для анализа.
Основной недостаток этого протокола происходит от использования не ratiometric биодатчик. С одной FP биодатчики вариации в GFP выбросов может быть результатом экспериментальные переменные помимо [Ca2 +]cyt, например изменений в клеточных рН, движения или уровень экспрессии биодатчик. Эти вопросы не встречаются с Cameleons ладу во время МУЧИТЬСЯ, как передача энергии от СЛП рекламы ЯФП происходит только после Ca2 + привязки. Другие условия, которые изменяют флуоресцентные свойства отдельных флуорофоров маловероятно имитировать противоположные изменения в интенсивности CFP и рекламы ЯФП, и расчет ratiometric, используемый изначально нормализует измерения для многих из них другие оптические артефакты23,30. Это делает оценки абсолютной [Ca2 +]cyt более надежной с Cameleons ладу. Следовательно GCaMP3 лучше всего использовать как биосенсора для измерения относительной [Ca2 +]cyt, хотя это все еще достаточно, чтобы обнаруживать и определять характеристики биологических явлений в растений5,(in preparation). Таким образом, важно, чтобы использовать элементы управления, чтобы показать, что наблюдаемый эффект обусловлен Ca2 +, включая Ca2 +-генетических мутантов(в подготовке) или фармакологических Ca2 + канал ингибиторы, такие как La3 + . Важно отметить, что сингл FP биодатчики обычно отображают большую доходность флуоресцентные и более широкий динамический диапазон (т.е. увеличение цветения Ca2 + привязки), чем МУЧИТЬСЯ Cameleons23, что делает GCaMP более подходит для ткани уровня обработки изображений, в то время как Cameleons ладу являются полезным инструментом для сотовых воображения confocal микроскопа5,25.
Во время выполнения этого протокола возможно, будут возникать некоторые вопросы, которые требуют устранения неполадок. Например рекомендуется, что образцы, в котором управления (лечить) лист дисплеи, которые большие фасадыcyt [Ca2 +] отбрасываются (шаг 6.3). Такие переходные процессы являются скорее результатом стресса, вызванного микроскопии. Действительно, синий свет, как известно, вызывают Ca2 + сигналов38,,3940,41, и света высокой интенсивности может также привести к температуры и осмотического подчеркивает, оба из которых также вызывают [Ca2 +]cyt фасады21,25,42. Следовательно чтобы уменьшить такие стрессы, важно провести эксперимент в комнате хорошо проветриваемом и контролем температуры и избежать неоправданно долгих выдержек. Важно также, чтобы не сорвать листья чрезмерно в отряд или во время микроскопии для предотвращения вызвал касания [Ca2 +]cyt высоты43,44,45. Могут также возникнуть проблемы с насекомых урегулирования. С . м. persicaeнасекомых не соглашайтесь на листьях в нескольких пробах. Это может быть результатом раны вызвал обороны в отдельные листья46,47, или нарушение насекомых, синий свет. Действительно видение в . м. persicae регулируется три фоторецепторных клеток, в том числе один с чувствительностью пик 490 Нм48. Уменьшение воздействия микроскопии и обработки тли с осторожностью может уменьшить бедствия и поощрения урегулирования.
Протокола, изложенные в текущем документе дает новые идеи на молекулярных понимания взаимодействия растений насекомых и растений ответ биотического стресса. Это позволяет для визуализации одного из первых реакция растений на Насекомое кормления и облегчает дальнейшие исследования с использованием значительные Arabidopsis генетические ресурсы. Кроме того этот протокол обеспечивает использование живых организмов, в отличие от выдержки5049 или elicitors. В будущем этот метод может быть применен к других биотических стрессов, таких дополнительных видов насекомых, нематоды или патогенных микроорганизмов, а также к абиотическим стрессам. Микроскопия GCaMP3 также могут быть изменены для изображения других растительных тканей, альтернативные ROIs на лист, или даже целые растения. Кроме того есть потенциал для биосенсора быть генетическаялы, закодированные в дополнительных растений. Следовательно протокол, изложенных в настоящем документе имеет потенциал для тайных молекулярные основы Ca2 + сигнализации в диапазоне Роман биотических взаимодействий между растений и других видов.
The authors have nothing to disclose.
Мы хотели бы поблагодарить Грант Calder (Джон Innes центр, Великобритании) для консультации, касающиеся микроскопии. Авторы хотели бы также поблагодарить Джона Innes центр садоводства и энтомологии департаментов за их помощь. Эта работа была поддержана PhD студенчества от Джона Иннес Foundation (т.в.), Грант от Фонда Джона Иннес и СИББН B/JJ004561/1 (т.в., м.а., J.C., с.м., с.х., т.м. и д.с.), в год в промышленности размещения от Джона Иннес Центр (магистр) , летом студенчества от биохимического общества Великобритании (J.C.), JST PRESTO (м.т.) и грантов MCB 1329723 и IOS-1557899 от национального научного фонда (м.т. и с.г.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |