Detta protokoll beskriver en enkel metod för att analysera kalcium signaler i växter som genereras av utfodring Ditropis insekter, såsom bladlöss. Arabidopsis thaliana omvandlas med den GFP kalcium biosensor GCaMP3 möjliggör av realtid i vivo imaging av kalcium dynamics med en hög temporal och spatial upplösning.
Kalciumjoner förutspås vara viktiga signalering enheter under biotiska interaktioner, med Kalciumsignalering bildar en etablerad del av den växt försvar Svaren mikrobiella elicitors och såra orsakas av tugga insekter, framkalla systemisk kalcium signaler i växter. Rollen av kalcium i vivo under biotic spänning är dock fortfarande oklart. Det här protokollet beskriver användningen av en genetiskt-kodade kalcium sensor att upptäcka kalcium signaler i växter vid utfodring av en Ditropis pest. Hemipterans såsom bladlöss pierce ett litet antal celler med specialiserade, långsträckt sugande mouthparts, vilket gör dem till det perfekta verktyget att studera kalcium dynamics när en växt är inför en biotic spänning, som skiljer sig från en skadade svar. Dessutom är fluorescerande biosensorer revolutionera mätning av signalering molekyler i vivo i både djur och växter. Uttrycker en GFP-baserade kalcium biosensor, GCaMP3, i modell växten Arabidopsis thaliana möjliggör realtid bildtagning av växten kalcium dynamik under insekt utfodring, med en hög rumsliga och temporal upplösning. En repeterbar och robust analys har utvecklats med hjälp av fluorescensmikroskopi av fristående GCaMP3 blad, vilket möjliggör kontinuerlig mätning av cytosoliska kalcium dynamics före, under och efter Insekt utfodring. Detta avslöjar en mycket-lokaliserad snabba kalcium höjd runt den Bladlöss utfodring webbplats som uppstår inom några minuter. Protokollet kan anpassas till andra biotiska påfrestningar, som ytterligare insektsarter, medan användningen av Arabidopsis thaliana möjliggör snabb generering av mutanter att underlätta molekylär analys av fenomenet.
Kalcium (Ca2 +) är en av de mest allestädes närvarande signalering element i växter. En övergående ökning av cytosoliska Ca2 + koncentration ([Ca2 +]cyt) avkodas av ett komplext nätverk av nedströms komponenter och är involverad i att bemöta både abiotiska och biotiska betonar1,2. En ökning av [Ca2 +]cyt är en av de första Svaren till mikrobiell elicitors, bildar en gemensam del av anläggningen försvar svar3,4,5. Stiger i [Ca2 +]cyt har också observerats hos på sårbildning orsakas av tugga insekter, som lepidopterans6,7. Dock potentiella roll växt Ca2 + signaler svar att leva biotiska hot att skadar endast några celler inte har undersökts. Den gröna persika bladlöss Myzus persicae är en Ditropis insekt som utgör ett betydande hot mot världens jordbruk8,9, och Ca2 + utflödet från extracellulära har observerats i lämnar angripen av M. persicae10. Denna protokollet beskrivs en robust och upprepningsbar metod för att mäta växt Ca2 + signaler medan M. persicae foder från bladen med en fluorescerande Ca2 + biosensor, med både bladlöss och GCaMP3 erbjuder nya verktyg för att dissekera roll Ca2 + under biotiska interaktioner.
Ca2 +-selektiv mikroelektroder användes tidigare för att mäta [Ca2 +] i växter11,12. Mer nyligen, självlysande och fluorescerande metoder har blivit standardiserade. Dessa biosensorer binda Ca2 + och avger ljus, vilket möjliggör un-paralleled möjligheter att studera Ca2 + dynamik i både celler och hela vävnader. Ca2 + biosensorer kan injiceras som färgämnen eller stabilt produceras av införandet av den biosensor kodande sekvens i genomet hos organismen via omvandling (dvs genetiskt kodade biosensorer). Den senare erbjuder de stora fördelarna med vara enkelt uttryckt i levande vävnad och kunna subcellulär lokalisering13. Proteinet aequorin, isolerade från Aequorea victoria (maneter) var den första genetiskt kodade Ca2 + biosensor distribueras i växter14. Som en självlysande protein kräver aequorin inte excitation av yttre ljus, vilket undviker kromofor blekning och autofluorescens15. Aequorin har framgångsrikt använts för att mäta flöden [Ca2 +] som svar på olika stimuli, inklusive temperatur16, patogener17,18,19, salt stress20 ,21, och skadade7. Dock är det missgynnade av relativt låg signal intensiteten, att göra detektion av [Ca2 +] flussmedel i enskilda celler och vävnader med dålig sensor uttryck svårt13.
Utveckling av Ca2 + biosensorer som kan fluorescera har kompletterat aequorin av möjliggör detaljerad subcellulär och vävnad-nivå analys av Ca2 + dynamics. En av de vanligaste fluorescerande biosensorer är fluorescens resonans energiöverföringen (bandet)-baserat Cameleons. FRET Cameleons består av två proteiner, vanligtvis GFP och YFP, som förs in i Närkontakt av den conformationaländring som induceras av bindningen av Ca2 + till en calmodulin domän i regionen GFP-YFP länkaren. Denna kontakt kan överföringen av energi från GFP till YFP och resulterande förändringar i fluorescensen av dessa fluorophores gör för exakt kvantifiering av [Ca2 +] genom beräkning av förhållandet mellan fluorescens signalerna från två fluorophores22. FRET Cameleons är överlägsna aequorin och icke-proportionerlig fluorescerande färger, eftersom de är mindre påverkad av uttrycket nivån av protein23 och har ofta en större fluorescerande avkastning, vilket möjliggör cellulär och subcellulär imaging23. FRET Cameleons har till exempel använts nyligen att identifiera långdistans Ca2 + signaler i växter och lösa dessa till cellulär nivå24,25,26.
En senaste genombrott med fluorescerande GFP-baserade Ca2 + biosensorer har varit utvecklingen av mycket känsliga singel-fluorophore (singel-FP) biosensorer. Singel-FP biosensorer består av en enda cirkulärt permutated GFP kopplat till calmodulin och M13 peptid, med Ca2 + bindning till calmodulin, vilket resulterar i en vatten-medierad reaktion mellan calmodulin och god Jordbrukarsed så protonate god Jordbrukarsed och öka fluorescerande avkastning27,28,29. Singel-FP sensorer erbjuder flera fördelar över bandet Cameleons, inklusive enklare experimentell design och en potentiellt högre temporal upplösning Imaging30. Även om single-FP sensorer inte kvantifiera absoluta [Ca2 +] så enkelt som bandet sensorer, de är överlägsen för analysen av temporal och spatial dynamik Ca2 + signaler5,23. GCaMPs är en av de översättningsföretag singel-FP sensorer28 och har genomgått flera revideringar för att förbättra deras fluorescerande avkastning, dynamiskt omfång, Ca2 + affinitet och signal-brus-förhållanden31,32 , 33 , 34. the GCaMPs har använts framgångsrikt i djurens system, såsom zebrafisk motoriska nervceller35 och frukt flyger neuromuskulära korsningar34. Slumpmässig mutagenes av GCaMP3 har resulterat i ytterligare klasser av singel-FP sensorer, inklusive den ultrasensitive GCaMP636 och GECOs29. GECOs användes nyligen i Arabidopsis thaliana (hädanefter benämnd Arabidopsis) att mäta Ca2 + flussmedel svar till ATP, kitin och den bakteriella anstränga flg22. Denna studie visade också att den R-GECO biosensor överträffade de FRET Cameleon YC3.6 när det gäller maximal signal förändring och signal-brus-baserat5.
På grund av lätthet av användning, fluorescerande med hög kapacitet och hög temporal upplösning som kan uppnås med GCaMP biosensorer, var GCaMP3 genetiskt kodade i Arabidopsis under blomkålsmosaikviruset 35S arrangören. De genetiska verktyg som finns för Arabidopsis forskning möjliggör detaljerade molekylära analysen av Ca2 + signalerna mätt med GCaMP3. Dessutom kan den GCaMP3 biosensor visualiseras under fluorescens Mikroskop i stället för en dyrare confocal system. Detta protokoll möjliggör hela-vävnad imaging, väsentliga när genomföra experiment med levande biotiska betonar. Experimentet är utformad så att fristående blad från 35S::GCaMP3 växter svävas i vatten, att förhindra insekt fly och begränsa utfodring av en specifik vävnad. Den metod som anges i detta dokument kan därför analysen av blad Ca2 + dynamics under utfodring av M. persicae, vilket resulterar i en karakterisering av en roman växt signalering svar. Denna metod kan också anpassas för att arbeta med andra biotiska påfrestningar, som ytterligare insektsarter och mikrobiella patogener, och med andra växt vävnader, såsom rötter.
Den metod som beskrivs i detta dokument möjliggör realtidsanalys av växt Ca2 + signalering under en biotiska stress såsom Insekt utfodring. Det visar att en av de första växt Svaren till sådana hot är en lokaliserad [Ca2 +]cyt höjd runt webbplatsen utfodring av insekten. Med hjälp av mutanter, denna metod möjliggör den molekylära och fysiologiska karakterisering av sådana signaler, som inte tidigare var möjligt. Ett avgörande steg i detta protokoll är att säkerställa att fristående bladen inte är alltför störd under processen avlossning (steg 3,2) eller när du överför insekter på bladen (steg 4,5). Med tanke på att det nuvarande protokollet ger en relativ mätning [Ca2 +]cyt snarare än ett absolut koncentration, är det viktigt att mikroskopet inställningarna hålls konstant under hela försöket. Det finns också potential för mänsklig partiskhet under valet av ROIs och analys av data, och som sådan, det rekommenderas att experimenten utförs dubbelblind.
I området i närheten finns det flera betydande fördelar av att mäta [Ca2 +]cyt under biotic spänning med detta protokoll. Första tillåter användning av en enda fluorophore med en hög fluorescerande avkastning av imaging ska genomföras på ett stereomikroskop, vilket är billigare än att använda en confocal mikroskopet. Användning av en enda fluorophore gör också datainsamling och analys enkel, eftersom det finns bara en mätning att spela in. Dessutom möjliggör användning av ett stereomikroskop bildtagning av hela blad, som är nödvändigt med tanke på att många biotiska interaktioner, inklusive växt-bladlöss interaktioner, förekomma i stor rumslig skala. Temporal högupplöst bild fånga möjligt med GCaMP3, baserat på den snabba disassociation av Ca2 + från sensorn efter bindande23,30 och hög fluorescerande avkastningen, möjliggör mätningar tas upp till varje 5 s. Dessutom förhindrar leaf analysen flykten av insekten, en nyckel som begränsar steg att genomföra sådana experiment på hela växter (i förberedelse). Fristående bladen också säkerställa att insekten feeds från en fördefinierad plats, vilket möjliggör analys av Ca2 + dynamics före, under och efter utfodring. Detta protokoll garanterar också att bladen av liknande utvecklingsstadier som används för analys.
Den största nackdelen med detta protokoll härrör från användningen av en icke-proportionerlig biosensor. Med singel-FP biosensorer, kan variation i GFP utsläpp resultera från experimentell variabler än [Ca2 +]cyt, såsom förändringar i cellulära pH, motion eller uttryck nivån på biosensor. Dessa frågor är inte stött med bandet Cameleons under bandet, som överföringen av energi från GFP till YFP uppstår endast vid Ca2 + bindning. Andra villkor som ändrar de fluorescerande egenskaperna hos de enskilda fluorophores är osannolikt att efterlikna de motsättande förändringarna i intensitet av GFP och YFP och proportionerlig beräkning som används till sin natur normaliserar måtten för många av dessa andra optiska artefakter23,30. Detta gör uppskattningar av absoluta [Ca2 +]cyt pålitligare med bandet Cameleons. Följaktligen används GCaMP3 bäst som en biosensor för att mäta relativ [Ca2 +]cyt, även om det är fortfarande tillräckligt för att identifiera och karakterisera biologiska fenomen i växter5,(in preparation). Därför är det viktigt att använda kontroller för att visa att den observerade effekten beror på Ca2 +, inklusive Ca2 +-relaterade genetiska mutanter(under utarbetande) eller farmakologiska Ca2 + kanal-hämmare såsom La3 + . Ännu viktigare, visas singel-FP biosensorer normalt en större fluorescerande avkastning och större dynamiskt omfång (dvs. en ökning av Blomningstid vid Ca2 + bindning) än bandet Cameleons23, vilket gör GCaMP mer lämpade för vävnad-nivå imaging, medan bandet Cameleons är ett användbart verktyg för cellulär avbildning med en confocal Mikroskop5,25.
Under genomförandet av detta protokoll är det möjligt att vissa problem kommer att uppstå som kräver felsökning. Exempelvis är det rekommenderat att prover där de kontroll (obehandlad) blad visar stor [Ca2 +]cyt höjder är kasseras (steg 6.3). Sådan transienter är troligen resultatet av stress induceras av microscopyen. Faktiskt, blått ljus är känt för att framkalla Ca2 + signaler38,39,40,41, och högintensiva ljuset kan också resultera i temperatur och osmotisk betonar, som båda också framkalla [Ca2 +]cyt förhöjningar21,25,publiceringsrättigheter för42. Följaktligen, för att minska sådana påfrestningar, det är viktigt att genomföra experimentet i ett välventilerat och temperaturreglerade rum och undvika onödigt långa exponeringstider. Det är också viktigt att inte störa bladen överdrivet under avlossning eller microscopyen att förhindra touch-framkallade [Ca2 +]cyt höjder43,44,45. Problem kan också uppträda med insekt lösa. Med M. persicae, insekter inte nöja sig på bladen i flera prover. Detta kan vara ett resultat av sår-framkallade försvar i den fristående blad46,47, eller störning av insekter av det blå ljuset. Faktiskt, vision i M. persicae styrs av tre fotoreceptorer, däribland en med en peak känslighet på 490 nm48. Minska mikroskopi exponering och hantering av bladlöss med vård kan minska lidande och uppmuntra lösa.
Protokollet beskrivs i aktuella uppsatsen ger nya insikter på molekylär förståelse av växt-insekt interaktioner och växt svar på biotic spänning. Det möjliggör visualisering av en av de första växt Svaren till Insekt utfodring och underlättar ytterligare undersökningar med hjälp av de avsevärda Arabidopsis genetiska resurserna tillgängliga. Dessutom detta protokoll möjliggör användning av levande organismer, i motsats till extrakt49 eller elicitors50. I framtiden, kunde denna teknik tillämpas andra biotiska påfrestningar, såsom ytterligare insektsarter, nematoder eller mikrobiella patogener, liksom abiotisk stress. GCaMP3 microscopyen kan också ändras så för att bilden andra växt vävnader, alternativa ROIs på blad, eller ens hela växter. Dessutom finns det potential för biosensor vara genetiskaly kodade i ytterligare växtarter. Protokollet beskrivs i denna uppsats har därför potential att undercover den molekylära basen för Ca2 + signalering i en rad nya biotiska interaktioner mellan växter och andra arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka Grant Calder (John Innes Centre, U.K.) för de råd om mikroskopi. Författarna vill även tacka John Innes Centre trädgårdsodling och entomologi avdelningar för deras hjälp. Detta arbete stöds av doktorand från den John Innes Foundation (T.V.), bevilja B/JJ004561/1 från BBSRC och stiftelsen John Innes (T.V., M.A., J.C., S.M., S.H., T.M. och D.S.), ett år i branschen placering från John Innes Centre (M.A.) , en sommar STUDENTTILLVARO från biokemiska Society UK (JC), JST PRESTO (MT) och bidrag MCB 1329723 och IOS-1557899 från National Science Foundation (MT och S.G.).
35S::GCaMP3 Arabidopsis | John Innes Centre/Universty of Wisconsin | – | Step 1.1 |
100 mm2 square plastic plates | R & L Slaughter Ltd, Upminster, UK | For growing GCaMP plants (Step 1.1) | |
¼ strength Murashige and Skoog (MS) medium | homemade: 1.1 g Murashige and Skoog medium, 7.5 g sucrose, 10 g Formedium agar, 1 L de-ionised water | – | For growing GCaMP plants (Step 1.1) |
Col-0 Arabidopsis | – | – | For growing aged aphid colony (Step 2.1) |
Myzus persicae(Sulzer) | clone US1L, Mark Stevens, Brooms Barn | – | Orginally from Rothamsted Research, UK (Step 2.1) |
Artist's paintbrush size 2 | Hobbycraft | 610101 | To tranfer aphids (Steps 2.1, 2.4 and 4.6) |
96-well MicrotitreTM plate | ThermoFisher Scientific | 2101 | To contain the detached GCaMP3 leaves (Step 3.2) |
Aluminium foil | Wrap Film Systems, Telford, UK | 26B06 | To cover plates with floating leaves overnight (Step 3.3) |
Clear plastic wrap | SC Johnson & Son, Racine, WI, USA | To cover plates with floating leaves overnight, and to cover leaves during microscopy (Steps 3.3 and 4.7) | |
M205FA stereo microscope | Leica Microsystems | – | For GFP imaging (Step 4.1) |
Leica Application Suite v3.2.0 | Leica Microsystems | Microscope software (Step 4.1) | |
Fiji (Image J) v1.48a | National Institutes of Health, USA) | – | For image analysis (Step 6.1) |