Summary
قد تم تصميم جيل جديد من المنصات ترجمة النسخ خالية من الخلية لبناء النظم البيوكيميائية في المختبر من خلال تنفيذ الدوائر الجينات. في هذه المقالة، يصف لنا كيف bacteriophages، مثل MS2 و ΦΧ174 و T7، يتم توليفها من الجينوم استخدام نظام تكستل كولاي كل خلية خالية.
Abstract
جيل جديد من نظم خالية من الخلية النسخ الترجمة (تكستل)، إجراء هندسة عكسية لبراعة أكبر ونمطية، توفير قدرات جديدة لأداء العلوم الأساسية والتطبيقية في أنبوب اختبار ردود الفعل. على مدى العقد الماضي، أصبحت خالية من الخلية تكستل تقنية قوية لمجموعة واسعة من البحوث المتعددة التخصصات رواية مجالات البيولوجيا المتعلقة بالكمية والاصطناعية. منصات تكستل جديدة مفيدة بشكل خاص لبناء واستجواب نظم الكيمياء الحيوية من خلال تنفيذ الدوائر الجينات الطبيعية أو الاصطناعية. في المختبر تكستل ثبت مريحة لسرعة النموذج العناصر التنظيمية والشبكات البيولوجية، وكذلك فيما يتعلق بالخص الجزيئية التجميع الذاتي الآليات الموجودة في النظم الحية. في هذه المقالة، يصف لنا كيف المعدية bacteriophages، مثل MS2 (الرنا)، ΦΧ174 (سدنا)، و T7 (dsDNA)، يتم توليفها تماما من على الجينوم في وعاء واحد ردود فعل استخدام جميع الإشريكيّة القولونية، خالية من خلية النظام تكستل. توليف كوليفاجيس ثلاثة هو كمياً باستخدام مقايسة البلاك. علينا إظهار كيف غلة بالعاثية تجميعي يعتمد على إعدادات البيوكيميائية من ردود الفعل. مزاحمة الجزيئية، محاكاة عن طريق تركيز الخاضعة لربط 8000، يؤثر على مقدار فاجيس المركب بأوامر مقادير. كما يصف لنا كيفية تضخيم في phages وكيفية تنقية الجينوم. ينبغي أن يكون المجموعة من البروتوكولات والنتائج المعروضة في هذا العمل من اهتمام الباحثين متعددة التخصصات تشارك في البيولوجيا التركيبية خالية من الخلية والهندسة الحيوية.
Introduction
على مدى العقد الماضي، قد تم تصميم تكنولوجيا الخلية الحرة التعبير بعنوان تطبيقات جديدة في بحوث متعددة التخصصات الناشئة مجالات البيولوجيا المتصلة الاصطناعية والكمية. المستخدمة في الأصل للتعبير عن البروتينات مستقلة عن كائن حي، وضعت نظم تكستل خالية من خلية جديدة لكل العلوم الأساسية والتطبيقية1،2، توسيع نطاق هذه التكنولوجيا إلى حد كبير. تم تصميم الجيل الجديد من منصات تكستل لتكون سهلة الاستعمال، أكثر كفاءة (تصل إلى 2 ملغ/مل البروتين في الوضع الدفعي3)، أكثر تنوعاً على مستوى النسخ4، ووحدات ذلك لأن الاندماج بسهولة في الرواية الطبيعية أو الوظائف التركيبية التي توسيع قدرات النظم البيولوجية الموجودة5،6. على وجه الخصوص، أصبحت خالية من خلية نظم تكستل مفيد للنماذج الأولية السريعة للبرامج الوراثية، مثل العناصر التنظيمية أو الدوائر الصغيرة الوراثية7،،من89، بتقليل التصميم-البناء-الاختبار دورة لبضعة أيام. بشكل ملحوظ، نظم تكستل الجديدة أيضا قادرة على تجهيز البرامج الحمض النووي الكبيرة مثل التوليف كاملة من كوليفاجيس10،11، إثبات قوية الأداء ما يكفي لدعم إعادة تشكيل نشط الجينوم الحمض النووي ترميز الكيانات الحية.
نظم تكستل يقدم العديد من المزايا التقنية مقارنة بالتقليدية في المختبر فحوصات الكيمياء الحيوية البناءة. الخلية الحرة تكستل يربط عملية التعبير الجيني للمنتج النهائي في بيئة مفتوحة وانخفاض، بدلاً من السيتوبلازم تعقيداً من خلية حية. تكستل يستخدم الحمض النووي لإعادة بناء النظم البيوكيميائية في المختبر، مع التقنيات الحديثة من الجمعية الحمض النووي، وأسعار معقولة وسريعة بالإضافة إلى لا تتطلب خطوات تنقية البروتين نيقة. الخلية الحرة التعبير يوفر الوصول المباشر إلى معظم العناصر في التفاعلات الكيميائية الحيوية، وبالتالي السماح تشريح أعمق من التفاعلات الجزيئية12. في رد فعل تكستل، أحد تغيير إعدادات البيوكيميائية والفيزيائية في الإرادة، ويكاد يكون مستحيلاً في خلية حية. ونظرا لهذه المزايا والتحسينات الأخيرة، تكستل التكنولوجيا أصبحت أكثر وأكثر شعبية كمنصة بديلة للبيولوجيا التركيبية والكمية. بينما الأوساط البحثية باستخدام تكستل تنمو بسرعة وأصبحت تكستل تقنية قياسية في الهندسة الحيوية، من الضروري لفهم كيفية استخدام هذه المنصات لتطوير الممارسات الملائمة ذات الصلة بتنفيذ تكستل ردود فعل وإلى تفسير للنتائج.
في هذه المقالة، نحن تصف كيفية استخدام نظام تكستل كولاي جميع توليف، في وعاء واحد من ردود الفعل، باكتيريوفاجيس من على الجينوم11، مثل MS2 (الجيش الملكي النيبالي، 3.4 كيلو بايت)، ΦΧ174 (سدنا، 5.4 كيلو بايت)، و T7 (دسدنا، 40 كيلو بايت). علينا إظهار كيفية توليفها مبلغ فاجيس تغييرات فيما يتعلق ببعض الإعدادات البيوكيميائية من ردود الفعل (تركيزات المغنيسيوم والبوتاسيوم). مزاحمة الجزيئية، محاكاة عن طريق تركيزات تتراوح من شماعة 8000، له تأثير كبير على توليف بالعاثية على عدة أوامر من ضخامة. تحقيق مثل هذه النظم البيوكيميائية الكبيرة في أنبوب اختبار واحد ردود الفعل أن الخص في الوقت نفسه عمليات النسخ، الترجمة، والتجميع الذاتي، من المثير للاهتمام لمعالجة المسائل الأساسية المتعلقة بعلم الأحياء والفيزياء الحيوية 10 (تنظيم الجينات، التجميع الذاتي)، فضلا عن تطوير التطبيقات، مثل repurposing بالعاثية مهام بناء جديد النانو13. بالإضافة إلى عملي في تكستل، نحن نقدم أساليب التضخيم بالعاثية الجينوم استخراج وتنقية والكمي بالعاثية بمقايسة اللوحة. الأساليب التي عرضت في هذه المخطوطة المناسبة للباحثين الذين يستخدمون نظم خالية من الخلية على أساس استخراج كولاي ومهتمون ب bacteriophages.
البروتوكولات المقدمة في هذا العمل يمكن تلخيصها كما يلي: 1) بالعاثية التضخيم (يوم 1: إعداد تلقيح الخلايا، يوم 2: واحد البلاك ومتعددة بالعاثية النمو، والتركيز، ويوم 3: تنقية بالعاثية)، 2) استخراج الحمض النووي الجينوم مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل (الفينول/كلوروفورم الاستخراج)، و 3) رد فعل بالعاثية خالية من الخلية والتجربة عيار (1 يوم: لوحة الخلايا المضيفة وجعل لوحات أجار، يوم 2: رد فعل الخلية الحرة والمضيف الخلية 3 الثقافة السابقة، واليوم: عيار الثقافة وبالعاثيه الخلية المضيفة).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ملاحظة: الخطوات التالية التضخيم وطريقة استخراج قابلة للتعميم إلى حد كبير للعديد من بالعاثية الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، مثل عاثية T7, enterobacteria بالعاثية T4 أو enterobacteria بالعاثية λ (L). وهي تستخدم أساسا بالعاثية الجينوم التي ليست متاحة بسهولة للشراء من مصادر تجارية-
1-"التضخيم بالعاثية"
ملاحظة: أسلوب إنتاج بالعاثية (مفروض) لوحة واحدة، ودورة متعددة وصفاً جيدا بالعاثية T4 في تشن, et al. 14 التالية بالعاثية التضخيم والحمض النووي طريقة الاستخراج تعميم للاستخدام مع كولاي فاجيس الحمض النووي المزدوج-الذين تقطعت بهم السبل، مثلاً، T7, T4 أو ل. النجاح النهائي للبروتوكول يعتمد اعتماداً كبيرا على سلالة خلية المضيف المحدد ' s القدرة على الصمود في وجه الظروف عدوى إضافية. إذا كانت الخلايا المضيفة غير مستقرة تحت عدوى إضافية، أو لم يتم التوصل إلى عدوى إضافية، وتحلل ابدأ التوصل إلى هذه المرحلة الحرجة، فمن الأفضل المضي قدما في وضع بروتوكول تحلل المتلاقية. ويشمل هذا الفصل بين الحطام الخلوية عن طريق الطرد المركزي عالية السرعة، والتكوير بالعاثية سرعات تنبيذ فائق. جميع الشروط والمعلمات التالية هي بمثابة نقطة بداية عام. قد تكون الظروف المثلى لخط خلية المضيفة محلية المختلفة؛ تحديد، والتقيد بالشروط المناسبة.
- إعداد تلقيح خلايا
- تطعيم 10 مل بيرتاني لوريا (رطل) وسائط الإعلام في أنبوب ثقافة 15 مل مع الخلايا المضيفة كولاي، مثلاً، ب أو K12-
- مكان في شاكر تعيين إلى 250 دورة في الدقيقة و 37 ° إجازة جيم بين عشية وضحاها ليصل إلى التشبع.
- لوحة واحدة، والنمو بالعاثية دورة متعددة وتركيز
- لتحضير طبق لويحات بالعاثية المختصة، الحارة عدة لوحات أجار رطل في 37 درجة مئوية ح 1، أو بين ليلة وضحاها.
- يعد تخفيف العديد من الأسهم بالعاثية (مثلاً T7 أو T4 L) تركيز المعروفة في رطل، تهدف إلى تحقيق ~ 10 2-10 3 بالعاثية مليلتر.
- إضافة 100 ميليلتر للنمو بين عشية وضحاها من الخلايا المضيفة مركزة لكل لوح.
- اختر أحجام أعد بالعاثية تخفيف المقابلة لمجموعة من 10-100 بالعاثية/لوحة. إضافة وحدة التخزين المطلوبة لتخفيف بالعاثية إلى كل لوحة (مثلاً، 100 ميليلتر بالعاثية 3 10/مل؛ وهذا ينبغي أن تنتج لويحات ~ 100). احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية ويبدأ جهاز ضبط وقت العد إلى أعلى (+ 0 ح). احتضانها ل h. 4-5
- تحضير الوسائط مل 49 رطل في قارورة 250 مل ومكان في الروتاري شاكر تعيين إلى 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
- في + 2.5 ح، تمييع الخلايا 50 x بإضافة 1 مل ثقافة المشبعة الخلية من النمو بين عشية وضحاها إلى قارورة المعالجون مسبقاً تتضمن المتوسطة 49 مل رطل. حالما تصل الخلايا إلى سجل النمو (+ h 4-5)، قياس امتصاص 600 نانومتر (OD 600). تحديد تركيز الخلايا باستخدام تحويل OD 600 1، 0 = 8 × 10 8 خلية/مل.
- ديلوت إلى 2 × 10 7 خلية/مل باستخدام وسائط النمو رطل إضافية. قم بإزالة لوحة أجار تتضمن لويحات بالعاثية من الحاضنة. فورا استخدام نهاية ماصة باستور معقمة بالأساسية وإزالة لوحة واحدة. ضربة على اللوحة في خلايا المخفف واحتضان في 37 درجة مئوية لإضافية 2 ح (+ ح 6-7)-
- اختبار للإصابة الكاملة بأخذ عينة 500 ميليلتر إلى أنبوب 1.5 مل، وإضافة 10 ميليلتر كلوروفورم (شكل 3)، وفورا فورتيكسينج بسرعة عالية. ملاحظة إذا كان الحل قد أوضحت. مجرد تماما من إصابة الخلايا، احتضانها لآخر ح 2 (+ ح 8-9)-
ملاحظة: إذا كانت الخلايا مصابة تماما، أنهم سوف سريعاً (< 2 دقيقة) وتوضيح الحل. وتعتبر النتائج الأخرى في مناقشة الفرع الوارد أدناه. الخلايا سوف سوبيرينفيكتيد ولكن سوف لا تصل إلى هذه النقطة. إذا كان يبدأ تحلل، إضافة الدناز والحصاد بالطرد المركزي يجب أن تبدأ فورا للحيلولة دون تدهور بالعاثية. - "الدناز إضافة" إلى 5 ميكروغرام/مل والطرد المركزي الخلايا في س 8,000 ز عند 4 درجة مئوية بيليه. تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند بيليه في 10 مل كلوريد المغنيسيوم x TRIS 1 (TM) (50 مم من تريس في الأس الهيدروجيني 7.8، 10 مم مجكل 2) المخزن المؤقت مع 5 ميكروغرام/مل الدناز. إضافة 500 ميليلتر من شكل 3 ودوامه بسرعة عالية الخلايا. توضيح عن طريق استخدام الطرد المركزي في 12,000 س ز لمدة 10 دقائق في 4 جيم صب المادة طافية إلى 15 مل الأنبوبة المخروطية ومخزن في 4 ° درجة مئوية.
2. تنقية بالعاثية
ملاحظة: تنقية السكروز يعتمد إلى حد كبير على حجم بالعاثية. اعتبارات لكتلة بالعاثية أن تكون معزولة وسوف يتعين القيام بها وإجراء التعديلات على شروط التدرج. التتر الفيروسية النهائي لما يزيد على 10 13 بالعاثية مليلتر قابلة بسهولة مع هذا الأسلوب.
- إعداد 12 مل من 5% و 45% w/v السكروز في 1 × العازلة TM.
- تحضير التدرجات السكروز 4 × 5-45% من بيبيتينج مل 2.5 من السكروز بنسبة 45% إلى 4 أولتراسينتريفوجي أنابيب. أعلى مع ~ 2.6 مل سكروز 5%، وقف عند السائل يصل إلى 2 مم من حافة الأنبوبة.
ملاحظة: وضع طرف الماصة مع سطح محلول السكروز والاستغناء السائل ببطء شديد. سوف تطفو أخف وزنا من محلول السكروز أعلى أثقل، تشكيل حدود مميزة. حلاً طبقات بشكل صحيح سوف يكون واجهة مم ~ 1 إذا عقد على ضوء خلفية. - ميكس التدرجات بالتناوب إمالة أنبوب استخدام تدرج تشكل أداة ل 43 ثانية في 86° 23 لفة في الدقيقة. إذا لزم الأمر ليس على الفور، تغطية مع الفيلم البارافين وتخزينها في 4 ° C.
- إزالة 500 ميليلتر من الجزء العلوي من كل إعداد التدرج السكروز مع 1 مل بيبيتور والتوازن داخل ± 0.002 غ.
- المعلقات بالعاثية تجمع من جميع الأنابيب (الخطوة 1.2.9). استخدام ماصة 1 مل، إضافة 500 ميليلتر من التعليق بجلب معلومات اتصال مع سطح السائل ببطء شديد الاستغناء عن وحدة التخزين على الجزء العلوي من التدرج السكروز، مع الحرص على عدم خلط عن طريق بيبيتينج السريع. أجهزة الطرد المركزي في 70,000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: التوازن التدرجات المعدة إلى داخل ± 0.002 غ. فاجيس أصغر قد يستغرق تصل إلى 1 h. - إزالة العصابات بالعاثية باستخدام المحاقن المعقمة وقنية كليلة.
ملاحظة: عندما ينظر إليه من الجانب، الفرقة بالعاثية سوف تكون سميكة وحليبي مقارنة بالمناطق المحيطة بها، حوالي 5 مم في الارتفاع، ويقع نصف الطريق إلى أسفل الأنبوب الطرد المركزي.- سوبميرجي قنية كليلة في الحل حتى التلميح يتركز على الحافة العلوية جداً من الفرقة بالعاثية. إزالة الفرقة بالاعتماد على المكبس حقنه حتى تم إزالة معظم الفرقة بالعاثية.
- إضافة إلى حجم السكروز مع بالعاثية مع وقف التنفيذ لأنابيب أولتراسينتريفوجي 3-4. قم بإضافة لا أكثر من 1.5 مل/الأنبوبة. تعبئة إلى ~ 3-4 ملم من الجزء العلوي من الأنبوب مع الباردة 1 × TM. تغطية مع الفيلم البارافين وعكس إلى المزيج. مكان مرة أخرى في أولتراسينتريفوجي وتدور في 145,000 س ز ح 1 في 4 درجات مئوية لبيليه. فاجيس أصغر قد يستغرق مدة تصل إلى 2 حاء
- بسرعة من أجل إيقاف المادة طافية واستنزاف رأسا على المسحات يمكن التخلص منها. يمسح داخل الأنبوب مع مسحه القطن المعقم لإزالة المادة الزائدة طافية.
- تقسيم 200-400 ميليلتر الباردة 1 x TM عبر جميع الكريات وريسوسبيند بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية؛ ولا تهز مطلوب.
ملاحظة: إذا لم يكن بيليه نظيفة، مثلاً، مفتول العضلات بت من الغشاء، الحمض النووي، و ما إلى ذلك، تجمع وإجراء الطرد المركزي الإضافية في ميكروسينتريفوجي في 17,000 غ. س - اليوم السابق مما يجعل التتر، إعداد ثقافة الخلايا المضيفة كولاي في وسائط النمو مل 10 رطل وترك في حاضنة تهتز تعيين 250 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. احتضان المقدار المناسب من لوحات الثقافة في 37 درجة مئوية على الأقل 1 ح قبل إجراء التتر المخزون بالعاثية.
ملاحظة: عدد لوحات لاحتضان يعتمد على عدد تخفيف المخزون بالعاثية يكون مطلي: يتطلب كل تمييع فريدة من نوعها للأسهم بالعاثية هما الثقافة لوحات (مثلاً، أربعة تخفيف مختلفة من الأسهم بالعاثية تتطلب ثمانية الثقافة لوحات).
إعداد - 100 مل أجار أعلى عن طريق إضافة ز 2.5 رطل وغ 0.6 بكتو-أغار على زجاجة 100 مل. تذوب المواد الصلبة في المياه في حجم 100 مل والاوتوكلاف. بعد اﻷوتوكﻻف، ببطء عكس الزجاجة 6-8 مرات مجانسة أجار طوال الحل. ضع الزجاجة في حمام المياه 45 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة حجته درجة الحرارة .
- إعداد المسلسل تمييع الأرصدة بالعاثية مع الحل رطل.
- ميليلتر إضافة 990 رطلا إلى 10 ميليلتر بالعاثية الأسهم لإضعاف 100-fold. دوامة مجانسة. لعامل 10 إضعاف، إضافة 100 ميليلتر من الأسهم بالعاثية إلى ميليلتر 900 "رطل دوامة" مجانسة.
- تكرار سلسلة تمييع أعلاه عدة مرات كما تحتاج للحصول على عدد معدود من لويحات (10-100 لويحات).
ملاحظة: لتحقيق هذا الهدف، تضعف الأسهم بالعاثية 2-3 أوامر من حجم أقل من عائد بالعاثية المتوقعة فيما يتعلق برد فعل بالعاثية مليلتر. على سبيل المثال، إذا كان مخزون بالعاثية خاص يحتوي على 10 11 المعدية بالعاثية مليلتر، لوحة الأسهم بالعاثية في 10 8-إضعاف أو 10 9-إضعاف إضعاف-
- تعد مجالاً التتر بالعاثية بتجميع أنابيب الثقافة مل 14 (عدد أنابيب الثقافة يساوي عدد بالعاثية تخفيف المخزون يكون مطلي). وضع العينات الأسهم بالعاثية المخفف من الخطوة 2.12 والخلايا البكتيرية المضيف من الخطوة 2.10 على مدت إعداد مزيج رئيسي من
- من بيبيتينج مل 5.25 أعلى أجار (الخطوة 2.11)، تضعف ميليلتر 220 بالعاثية عينات (الخطوة 2، 12)، وأنبوب 50 الخلايا البكتيرية المضيف ميليلتر (الخطوة 2.10) إلى ثقافة 14 مل. كاب الأنبوب الثقافة ودوامه بسرعة عالية-
- تخزين الحل بالعاثية المتبقية في 4 ° C.
- استرداد اثنين الثقافة لوحات (الخطوة 2، 10) من حاضنة 37 درجة مئوية. إضافة 2.5 مل مزيج الرئيسي ببطء إلى وسط اللوحة الأولى (بدون فقاعات). بلطف تدوير اللوحة باليد لتوزيع مزيج الرئيسي بالتساوي بحيث أنه يمتد لوحة ثقافة كاملة. كرر مع اللوحة الثانية. الانتظار 20 دقيقة لضمان ترسيخ أجار أعلى. احتضان لوحات في 37 درجة مئوية حاء – 4-7
- عد لويحات وتحديد تركيز بالعاثية لكل عينة رد فعل-
ملاحظة: سوف تظهر لويحات كدوائر واضحة 1-2 مم في السجاد مبهمة للخلايا المضيفة. انظر الشكل 1 للنتائج التمثيلية. سيؤدي إلى إنتاج بالعاثية ناجحة في تركيزات النهائي 13 10 12-10 بالعاثية/مل.
3. مزدوج-الذين تقطعت بهم السبل "استخراج الحمض النووي الجينوم"
ملاحظة: تمييع، تهتز، وخطوات استخدام الطرد المركزي يجب أن يكون الأمثل لوضع طبقة حدود بروتين سميكة ومتينة بين مرحلتي مائي والفينول. وهذا يولد الجينوم نقاوة أعلى خالية من الملوثات البروتين. التخفيف الأولى فيعتمد على عيار بالعاثية النهائي. أسهم بالعاثية عيار عالية للغاية (≥ 10 13 بالعاثية مليلتر) قد تحتاج إلى إضعاف إضعاف-10-20 قبل الاستخراج، بينما مخزونات عيار منخفضة (10-10 ~ 10، 11 بالعاثية/mL) قد تحتاج فقط إضعاف أو بلا. إذا كان من الصعب أن تشكل طبقة صلبة من بروتين في الخطوات اللاحقة أو تعليق مائي لزجة جداً تكون قابلة للتطبيق بسبب ارتفاع تركيز الحمض النووي، النظر في إضعاف أعلى من مخزونات بالعاثية قبل مواصلة الاستخراج. خلال أي خطوة معالجة الجينوم، من المهم استخدام ماصة واسعة تحمل نصائح عند بيبيتينج أي مراحل مائي. كثيرة بالعاثية الجينوم كبيرة جداً ومجزأة بسهولة عن طريق القص ماصة. بالإضافة إلى ذلك، أي فورتيكسينج وينبغي صراحة تجنب هذا سوف شدة القص الجينوم.
- تمييع جزء من مخزون بالعاثية من الخطوة 2.9 إلى 400 ميليلتر مع 1 × TM المخزن المؤقت في أنبوب جديد 1.5 مل. إضافة
- بحجم Tris:Phenol:Chloroform متساوية للتخفيف. اهتز الخليط برفق في مختبر الروك، أو من جهة، للطرد المركزي الحد الأدنى 5 مستحلب الناتجة في 17,000 ز س في benchtop أجهزة الطرد مركزي للحد الأدنى 5-10
ملاحظة: طبقة بروتين متميزة، بيضاء على سطح المرحلة الأساسية الفينول موجود. - إزالة المرحلة المائية العليا إلى أنبوب جديد مع الحرص على عدم الإخلال بالحدود الطور البيني. كرر
- 3.2-3.3 خطوات إضافية 2 مرات لما مجموعة 3 الفينول الاستخراج. نقل المرحلة المائية إلى أنبوب جديد وإضافة وحدة تخزين المساواة تشكل 3. ويهز الطرد المركزي (الخطوة 3، 2). نقل عينات الحمض النووي مائي لأنبوب نظيفة.
- تقدير حجم الحمض النووي المنقي. إضافة مجلدات 0.4 من خلات الصوديوم 3 م (CH 3 كونا) و 3 مجلدات من الإيثانول 95% (EtOH). وضع في الثلاجة-20 درجة مئوية لهطول الأمطار بين عشية وضحاها. أجهزة الطرد المركزي في 17,000 س ز في أجهزة الطرد مركزي benchtop عن 10-15 دقيقة
ملاحظة: الحمض النووي سيتم فورا يذوي وتصبح مرئية ككتلة تعليق في الأنبوب. بيليه الناتج الصحيح الأبيض ومعبأة جيدا ضد الجزء السفلي من الأنبوب.
إزالة - وتجاهل المادة طافية أما عن طريق الصب أو بيبيتينج. إضافة 500 ميليلتر 70% EtOH ويهز الأنبوب بلطف حتى بيليه يعوم مجاناً من الجزء السفلي من الأنبوب. الطرد المركزي في 17,000 س ز لأدنى 5 إزالة وتجاهل EtOH، مع الحرص على عدم إزعاج بيليه.
- كرر الخطوة 3، 6. الهواء الجاف بيليه على benchtop عن 30-60 دقيقة إضافة 50 ميليلتر ddH 2 س لبيليه واحتضانها ح 1 في الرايت أو بين ليلة وضحاها في 4 درجات مئوية ريسوسبيند. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام قياسات الاستيعاب في 280 نانومتر.
ملاحظة: التركيزات المتوقعة هي 0.5-5 ميكروغرام/ميليلتر باستخدام هذا الأسلوب. القسمة على مجموع الوزن الجزيئي الجينوم لتحديد تركيز الجينوم النهائية-
4. الخلية الحرة بالعاثية رد الفعل والتجربة عيار بالعاثية
- إعداد متوسطة ز 25 رطل والصلبة أجار باكتو ز 15 وتصب في زجاجة 1 لتر، وإضافة المياه إلى 1 لام اﻷوتوكﻻف.
- بعد التعقيم، عكس الزجاجة ببطء 6-8 مرات أخذ العناية لتجنب تشكيل الفقاعات. وسوف تجانسه انعكاس زجاجة الصلبة أجار طوال الحل 1 لتر. ضع الزجاجة في حمام مائي 58 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة قبل صرفها على لوحات الثقافة-
- مرة واحدة وقد اكويليبراتيد درجة حرارة الحل رطل-أجار، إعداد لهب بجوار لوحات الثقافة لتعقيم البيئة قرب لوحات الثقافة مفتوحة. الاحتفاظ بزجاجة 1 لتر في حوض ماء لتجنب ترسيخ أجار حين جعل في مختبرين. إضافة 25 مل في لوحة ثقافة 100 ملم × 15 ملم. سوف تنتج 1 لتر 40 ثقافة لوحات.
- جانبا لوح الثقافة واحد والسماح لترسيخ لمالا يقل عن 1 ح في الرايت؛ وسوف تستخدم هذه اللوحة لطلاء الخلايا المضيفة. تمكنك لوحات أخرى الثقافة 39 يصلب لمدة يومين في مخزن الرايت عند 4 درجة مئوية أو استخدامها على الفور لصنع التتر. لوحة
- الخلايا المضيفة قبل streaking الضغط البكتيرية المناسب (مثلاً، المضيف (ب) ل T7) التي تم تخزينها في-80 درجة مئوية، على لوح ثقافة أجار رطل. متواصلة بجوار لهب المكشوف لتجنب التلوث البيئي. تبني بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية. الخلايا المضيفة لها أي مقاومة المضادات الحيوية حيث تعمل في بيئة معقمة ضروري-
- رد فعل الخلية الحرة
ملاحظة: ردود فعل تكستل خالية من الخلية تتألف من 33% استخراج النفط الخام كولاي (8.9 9.9 ملغ/مل بروتين) مع 67% أخرى تتألف من رد فعل المخزن المؤقت وبالعاثيه الجينوم. استخراج النفط الخام مستعدة كما سبق وصف 15 ، 16. شروط الرد النهائي: 8.9 9.9 ملغ/مل من البروتين (من استخراج النفط الخام)، 3-6 مم مغ-غلوتامات، 40-100 مم كغلوتامات، 8000 ربط % 2-4، 3-4 مم من كل من الأحماض الأمينية، أعدت كما هو موضح سابقا 17، وحلا مزيج الطاقة، ووصف سابقا 15، تتألف من 0.33 3.33 مم DTT، 50 مم هيبيس، 1.5 مم ATP وأنشئ، 0.9 مم CTP و UTP، 0.2 مغ/مل الحمض الريبي النووي النقال، 0.26 مم CoA و 0.33 ملم ند، مخيم 0.75 ملم، حامض فولينيك مم 0.068، سبيرمدين 1 مم و 30 ملم 3-الشبكة. الحمض النووي من نوع فاجيس تتطلب الجينوم تركيزات 0.5-10 نانومتر والجيش الملكي النيبالي من نوع فاجيس تتطلب مجموعة من 50-150 نانومتر. هي فريدة من نوعها بالعاثية خاص توليف تركيزات الرد النهائي وسوف تقع ضمن النطاقات المذكورة أعلاه. ينبغي أن تكون وحدات الرد النهائي للأوكسجين المثلى من ردود الفعل، بين 10-20 ميليلتر. هناك اختلافات صغيرة في البروتوكول، وردود الفعل التي تعتمد على شكل الجزيء الجينوم. على سبيل المثال، تتطلب جزيئات جينوم خطي عنصرا إضافيا في رد فعل على تحول دون هضم قطع الدنا الخطي بالانزيم ريكبكد موجودة في استخراج النفط الخام.- كاملة " تفاصيل رد فعل " الباب في الجدول 1 (PhageTXTL_JOVE) بإدخال العدد الإجمالي لردود الفعل والحجم النهائي للرد.
- تصميم التجربة بتحديد عناصر ثابتة وعناصر متغيرة من رد فعل. أدخل النسبة المئوية لحجم كسرى من مزيج الرئيسي، وهو أن نسبة الحجم الكلي لمكونات التفاعل المستمر للمنتج من حجم الرد النهائي وعدد العينات. أدخل الأسهم وتركيزات الكواشف رد فعل في النهائي " "وصفه رد فعل مزيج ماجستير" " القسم في PhageTXTL_JOVE. أدخل الأسهم وتركيزات reagent(s) متغير اختبار نهائي-
ملاحظة: وحدات تخزين مكونات رد فعل تلقائياً ويتم احتساب استناداً إلى حجم مزيج الرئيسي والحجم النهائي لكل رد فعل الفرد. - إزالة المبلغ اللازم لأنابيب (المشار إليه في " أنابيب لإذابة الجليد في " قسم من PhageTXTL_JOVE.xlsx) لاستخراج النفط الخام من الخلية، ومزيج الطاقة المخزن المؤقت، ومزيج من الأحماض الأمينية من-20 درجة مئوية أو-80 درجة مئوية وذوبان الجليد في مدت
ملاحظة: مرة واحدة مذاب، الجمع بين مختبرين متعددة من مثل مكونات (إذا لزم الأمر). - استخراج قاسمة حجم النفط الخام المشار إليه، 33% حجم الرد النهائي، في أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- إعداد مزيج الرئيسي وفقا الجدول 1. مجانسة جميع العناصر تحت " "وصفه رد فعل مزيج الرئيسي" " من فورتيكسينج. إضافة وحدة التخزين المناسبة لكل مكون لاستخراج النفط الخام.
- إذا كان يعمل مع بالعاثية مع خطي جينوم الحمض النووي (مثلاً T7)، إضافة 1 ميكرومتر من البروتين حركة آتشيه الحرة لامدا عاثية إلى رد فعل 11. دوامة مجانسة الحل، ووضع رد فعل على الجليد لمدة 5 دقائق. وهذا يحول دون هضم قطع الحمض النووي الخطية التي ريكبكد المعقدة، الذي الذاتية في استخراج النفط الخام-
- بعد إضافة مكون آخر حسب الجدول 1، مجانسة رد فعل من فورتيكسينج. تقسيم المزيج الرئيسي في أنابيب ميكروسينتريفوجي ن.
ملاحظة: حجم كل تقسيم هو نتاج نسبة حجم كسرى مزيج الرئيسي وحجم الرد النهائي. على سبيل المثال، نسبة حجم مزيج رئيسي كسرى من 90% وحجم الرد النهائي من 12 ميليلتر، حجم كل تقسيم هو 10.8 ميليلتر. - إضافة وحدات التخزين المشار إليها من مكونات متغير صفيف ميكس الرئيسية (انظر الجدول 1). إضافة المياه إلى كل رد فعل للوصول إلى وحدة التخزين المطلوب الرد النهائي. مجانسة رد فعل كل من فورتيكسينج. احتضان هذه الأنابيب ميكروسينتريفوجي في 29 درجة مئوية على الأقل 8 ساعات أو بين عشية وضحاها.
- ثقافة البلد المضيف الخلية قبل
ملاحظة: هي ثقافة ما قبل ليلة وضحاها المخفف 50: 1 التأكد من وجود الخلايا المضيفة التي استخدمت في التجربة عيار في سجل منتصف المرحلة، مما يزيد من كفاءة الإصابة. سجل منتصف الخلايا ثم إعادة مركزة بمقدار 10 إضعاف والمخزنة على الجليد.- باستخدام تلميح ماصة معقمة، تطعيم أنبوب ثقافة مل 5 رطل مع مستعمرات الخلايا المضيفة صحية 3-5. العمل بجوار لهب المكشوف لتجنب التلوث.
- احتضان الأنبوب الثقافة في حاضنة تهتز في 37 درجة مئوية و 250 دورة في الدقيقة 16 ح أو بين عشية وضحاها. الخلايا يمكن أن تصل إلى مرحلة التشبع في اليوم التالي-
- استضافة إعداد خلية الثقافة وعينه لعيار بالعاثية
- الاستغناء عن 50 مل رطل في قارورة Erlenmeyer 500 مل وتغطي برقائق الألومنيوم. الحارة قارورة في 37 درجة مئوية ل 20 دقيقة
- الكوة 1 مل من ثقافة البلد المضيف قبل بين عشية وضحاها الخلية إلى "احتضان رطل" المعالجون مسبقاً ح 3-4 في 37 درجة مئوية وتهز 250 لفة في الدقيقة-
- تجاهل أجهزة الطرد المركزي ثقافة الخلية المضيفة 50 مل لمدة 10 دقائق في 5,000 غ. س رطل
- ريسوسبيند بيليه مع الباردة (4 درجة مئوية) 5 مل رطل والحفاظ على مدت
- ساعة واحدة قبل بدء التجربة عيار، احتضان لوحات الثقافة في 37 درجة مئوية.
ملاحظة: كل فعل بالعاثية فريدة من نوعها (والمقابلة تمييع عامل) سوف تستخدم لوحات اثنين. بالإضافة إلى ذلك، احتضان 4 لوحات لضوابط تجريبية (انظر الشكل 1 للممثل عناصر إيجابية وسلبية). - إعداد 100 مل من أعلى أجار (الخطوة 2.11).
- إعداد إضعاف مسلسل من رد فعل الخلية خالية مع الحل رطل كما هو موضح في المقطع 2.12.
- عيار بالعاثية
ملاحظة: تبدأ لوحة بعد أطباق الثقافة قد المحتضنة لمالا يقل عن 1 ح واجار الأعلى كان في حمام المياه 45 درجة مئوية لمدة 15-20 دقيقة بعد إزالة من اﻷوتوكﻻف.- عيار النهائي الخلية الحرة رطل رد فعل الحل كما هو موضح في القسم 2، خطوات 2.14 2.16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
نعرض أربع نتائج تمثيلية. في الشكل 1، نقدم مجموعة من عناصر سلبية لضمان أن نظام تكستل خالية من الخلية ومخزونات الحمض النووي بالعاثية غير ملوثة بالمعيشة كولاي الخلايا. علينا التحقق من أن النظام تكستل خالية من الخلية خالية من سليمة كولاي الخلية التلوث بالطلاء على حد سواء إلى حل رد فعل غير المحتضنة والمحتضنة باطلة للحمض النووي (الشكل 1A و الرقم 1ب). إذا كانت ملوثة خالية من خلية النظام تكستل مع خلايا كولاي ، أن لاحظ النمو على اللوحة. وعلاوة على ذلك، يمكننا التحقق من أن رد فعل الخلية الحرة، وذلك ليس أي خلايا الملوثات المحتملة، المسؤولة عن تجميع بالعاثية بطلاء ردود الفعل غير المحتضنة والمحتضنة مع الجينوم بالعاثية (الشكل 1ج و 1 الرقمد). لوحة برد فعل غير المحتضنة (الشكل 1ج) يظهر صفر البلاك بينما اللوحة مع رد فعل المحتضنة (الشكل 1د) تظهر اللوحة، التي تشير إلى النظام تكستل خالية من الخلية مسؤولة عن بالعاثية التوليف.
في الشكل 2، قارنا متجانسة مقابل المقايسة البلاك متنافرة. الشكل 2 ب يوضح رج كثافة اللوحة عبر لوحة الثقافة، التي دون المستوى الأمثل بالمقارنة مع كثافة متجانسة لوحة اللوحة في الشكل 2أ. ولاحظ مصدر هذا النتيجة من التبريد السريع لمزيج الرئيسي أعلى الخلايا البكتيرية أجار، وعينه والمضيف عند الاستغناء عن على لوحة ثقافة أثناء الجزء عيار بالعاثية من التجربة. لتجنب انتشار لويحات بالعاثية متنافرة، ضمان أن لوحات الثقافة هي اكويليبراتيد إلى 37 درجة مئوية قبل البدء في التجربة عيار بالعاثية.
خطوة حاسمة لعد فاجيس بشكل صحيح تمييع الحل بالعاثية بما فيه الكفاية للحصول على بين 50 و 200 لويحات كل لوح (الشكل 3). أسفل هذا النطاق، فإنه من الصعب تحديد الإحصاءات الحقيقية، وفوق هذا النطاق، لويحات التداخل، منع دقيقة التهم الموجهة إليه. يعتمد عدد فاجيس توليفها في تكستل على إعدادات الكيمياء الحيوية، مثل تركيز أملاح (البوتاسيوم والمغنيسيوم) ومن كرووديرس الجزيئية والجينوم. في الشكل 4، نعرض أمثلة قليلة من الاختبارات فاجيس T7 و ΦΧ174. بالعاثية التي يتطابق في الحمض النووي، مثل T7، نحتفل كفاءة عالية لتوليف بالعاثية في رد فعل الخلية الحرة: ثلاثة فاجيس المعدية هي توليف كل جزيء الجينوم في رد الفعل. ويمكن للمرء أن يتوقع كفاءة أقل من رد فعل بالعاثية التي لا النسخ المتماثل الحمض النووي، مثل ΦΧ174: نسبة بالعاثية المعدية تجميعي لجزيء الجينوم هي 1:5.
رقم 1: البلاك فحص الضوابط والإنتاج الناجح بالعاثية المعدية باستخدام نظام رد فعل الخلية الحرة (CFR)- (أ) تمت إضافة لا الجينوم وأنجز لا الحضانة (0 دقيقة كوقت الحضانة) من معدل إماتة الحالات. ثم كان مطلي رد فعل دون المضيفة كولاي. وتظهر نتيجة لا قابلة للتطبيق المضيف تلوث الخلية CFR. (ب) إضافة لا الجينوم و CFR المحتضنة ح 12 في 29 درجة مئوية ومطلي بدون المضيفة كولاي. وتظهر النتائج لا قابلة للتطبيق المضيف تلوث الخلية CFR، حتى بعد حضانة. (ج) 1 نانومتر الجينوم المضمنة مع لا حضانة CFR (0 دقيقة كوقت الحضانة) ومطلي مع المضيف كولاي. وتظهر نتيجة أي تلوث بالعاثية الحل الجينوم. (د) 1 نانومتر الجينوم وشملت ومعدل إماتة الحالات المحتضنة ح 12 في 29 درجة مئوية. ومطلي مع المضيف كولاي. وتظهر النتائج الناجحة بالعاثية المعدية النسخ المتماثل في CFR. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : متجانسة مقابل انتشار متنافرة من رد فعل بالعاثية خلال التجربة عيار. تأثير ممكن من أداء من عيار بالعاثية على لوحات الثقافة لا اكويليبراتيد إلى درجة حرارة 37 درجة مئوية هو انتشار متنافرة من رد فعل بالعاثية عبر لوحة الثقافة. ويبين نتيجة جيدة عرض حيز متجانسة من رد فعل بالعاثية (A)، حيث تكون لويحات موزعة بالتساوي عبر سطح اللوحة. يتم عرض نتيجة دون المستوى أمثل في (ب)، حيث تتركز لويحات في الجزء السفلي الأيسر من لوحة الثقافة. يمكن أن يحدث هذا مع الأعلى-أجار، يتم الاستغناء عن بالعاثية رد فعل، ومزيج الرئيسية الخلية المضيفة على لوحة ثقافة التي ليست في درجة حرارة 37 درجة مئوية. يتصلب غالبية مزيج الرئيسي في المنطقة اليسرى، وليس من الممكن انتشار متجانسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : إعداد عامل تخفيف مناسب التتر من رد فعل الخلية الحرة بالعاثية. (أ) طبق هذا يعرض عدد معقول معدود من لويحات. عامل إضعاف المستخدمة للجزء عيار التجربة المخفف العائد من رد فعل بالعاثية ما يكفي ترك عدد معدود من لويحات على اللوحة. على العكس من ذلك في (ب) عامل إضعاف كان منخفضا للغاية فيما يتعلق بعائد بالعاثية المركبة، ويحتاج إلى تعديل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : توصيف لتركيب الخلية الحرة فاجيس ΦΧ174 و T7. (أ) عدد ΦΧ174 المركب وفاجيس T7 (بفو/مل: بلاقوه تشكيل وحدات في المليلتر) كدالة لربط تركيز 8000 في رد فعل الخلية الحرة، تقاس بعد 16 ساعة حضانة في 29 درجة مئوية. (ب) عدد ΦΧ174 المركب وفاجيس T7 كدالة لتركيز غلوتامات المغنزيوم في رد فعل الخلية الحرة، تقاس بعد 16 ساعة حضانة في 29 درجة مئوية. (ج) عدد ΦΧ174 تجميعي بالعاثية كدالة لتركيز جينوم الحمض النووي ΦΧ174 في رد فعل الخلية الحرة، تقاس بعد 16 ساعة حضانة في 29 درجة مئوية. (د) عدد تجميعي T7 بالعاثية كدالة لتركيز T7 DNA المجين في رد فعل الخلية الحرة، تقاس بعد 16 ساعة حضانة في 29 درجة مئوية. جميع أشرطة الخطأ المعروضة هي الانحرافات المعيارية لثلاث محاكمات المتكررة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الجدول 1: تكوين رد فعل- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
اتباع هذا الأسلوب في تشن, et al. 14 للشركة، هو التوصل إلى خطوة حاسمة عند تحديد الشروط المناسبة لعدوى إضافية. المعلمة التي يتحكم أوثق سلالة المضيف القدرة على الصمود في وجه عدوى إضافية هي كثيرا ما تركيز بالعاثية إصابة الأولية. يجب أن تكون الخلايا المضيفة في مرحلة النمو لوغاريتمي قبل الإصابة الأولى مع كمية صغيرة جداً من بالعاثية. في نهاية المطاف، بالعاثية ستصل أيضا نمو لوغاريتمي والهدف السماح لأرقام بالعاثية سرعة تفوق عدد الخلايا، مما يسمح لنسخ متعددة من بالعاثية في كل خلية المضيف. هذا يفرض الخلية في حالة شبه مستقرة حيث سيخضع لا تحلل. إذا لم يتم التوصل إلى هذه الدولة، الخلايا سوف تخضع لتفسخ المتتالية، المتلاقية، والإفراج عن حمولتها الفيروسية. إذا تعذر التوصل إلى عدوى إضافية باستخدام تركيزات الفيروسية الأولية المذكورة أعلاه، أقل تعدد الإصابة الأولى بمقدار عشرة قبل إجراء محاولة لاحقة. إذا كان الخلايا المضيفة قبل موسم الحصاد، ولم يتم التوصل إلى عدوى إضافية، الشروع فورا بإجراء تنقية منفصلة. إضافة الدناز أنا إلى 5 ميكروغرام/مل و 500 ميليلتر تشكل3 لوضع الصيغة النهائية لتحلل كل الخلوية. تواصل دوامة لمدة 5 دقائق إضافية، وثم الطرد المركزي في 10,000 ز x لإزالة الحطام الخلوية. صب والطرد المركزي المادة طافية في 75,000 س ز ح 1-2 بيليه بالعاثية وريسوسبيند بين عشية وضحاها في مل 1 x 1 مجموع TM المخزن المؤقت عند 4 درجة مئوية دون المصافحة. عند إجراء اختبار لعدوى إضافية باستخدام كمية صغيرة من الخلايا، من الممكن قياس كيفية إغلاق الخلايا لتحلل بسرعة أنهم عندما يتعرضون كلوروفورم المضافة. إذا الخلايا ويوضح الحل على الفور تقريبا، جدران الخلية غير مستقرة جداً وينبغي أن تحصد الخلايا فورا لمنع تحلل تتالي على نطاق واسع. إذا كان الاختبار في 1-3 دقيقة، قد يستمر كميات أكبر سوبيرينفيكت ليصل إلى 2 حاء، اعتماداً على سلالة محلية كولاي في الاستخدام. إذا لم الخلايا ضمن 5 دقائق، لا قد اشتعلت بالعاثية النمو إلى نمو كولاي وينبغي أن تستمر الحضانة الأولية. إجراء الاختبار مرة أخرى في 30-60 دقيقة.
عند تنقية بالعاثية على تدرج سكروز مستعدة، سوف تظهر بالعاثية كعصابة سميكة جداً، والنسبة بين ثلث وثلثي الطريق إلى أسفل الأنبوب. افتراض تحلل ناجحة نسبيا، وخطوة تنقية بقايا الخلوية، قد يكون هناك نطاقات أخرى، على ضوء لكن أيا من الكثافة أو حجم مماثل. يحتوي على بالعاثية الفرقة كبيرة ومعتمة ويتم إزالتها من الحل باستخدام المحاقن المعقمة وقنية كليلة.
عند بدء الجزء الثالث من البروتوكول، ورد فعل الخلية الحرة وعيار بالعاثية، فمن الأفضل استخدام لوحات ثقافة جديدة (أقل من أسبوع واحد من العمر) للوحة البكتيريا المضيفة (من الخطوة 3، 5) وأيضا لوحات الثقافة المستخدمة في تحليل عيار (من الخطوة 3.21). وسيعزز هذا أقوى نمو الخلايا البكتيريا المضيفة وأعلى كفاءة الإصابة لعيار بالعاثية. يجب المحتضنة لوحات الثقافة بالعاثية مسبقاً في 37 درجة مئوية للحد ني ح 1 قبل بدء الجزء عيار بالعاثية من البروتوكول. لا البلوتينيوم دون ما قبل حضانة ألواح الثقافة بالعاثية، سوف توزع الحل أعلى-أجار (التي تحتوي على ثقافة الخلية بالعاثية والمضيف تجميعي) عبر سطح لوحة الثقافة. بدلاً من ذلك، سوف البلوتينيوم ترسيخ الحل أجار أعلى على السطح (الشكل 2ب). وهذا يزيد من احتمال فاجيس متعددة محلياً في نفس المكان، الذي يمكن أن يسبب نقلل غلة بالعاثية في رد فعل الخلية الحرة.
ويمثل كل البلاك حدث واحد بالعاثية تجميعي إصابة خلية مضيف، تكرار داخل الخلية المضيفة، وليسينج الخلية المضيفة. لويحات تنمو في الحجم أثناء فترة الحضانة من الخلايا المضيفة الجار إصابة ذرية بالعاثية من الحدث الإصابة الأولى. إذا لوحظت لا لويحات، فمن الممكن أن عامل التخفيف في البروتوكول القسم 4.6 مرتفع جداً أدى إلى احتمال الضعيف أن يصيب أي بالعاثية تجميعي خلية مضيف. لتصحيح هذا الوضع، انخفاض معامل التخفيف من 3-4 من حيث الحجم (أو حسب الحاجة) وكرر التجربة عيار. على العكس من ذلك، يمكن أن تكون عامل إضعاف عالية جداً أدى إلى اللوحات التي تغطي كامل السطح من لوحة الثقافة، مما يجعل من المستحيل على حساب العائد بالعاثية. وفي هذه الحالة، زيادة عامل التخفيف من 3-4 من حيث الحجم (أو حسب الحاجة). بالعاثية تتسم جيدا، سوف يعرف العائد من رد فعل الخلية الحرة وعامل واحد فقط تمييع كل نقطة رد الفعل سيكون ضروريا للتجربة عيار. عندما وصف بالعاثية جديدة، فمن الأفضل أن تدرج 2-3 إضعاف مختلف العوامل كل نقطة رد الفعل، ضمان أن أحد تخفيف ستسفر عن لوحة عد (انظر الشكل 3 للاختلافات بين عدد معدود ولا يحصى من لويحات على لوحة).
إذا لوحظ لا اللوحة بعد تعديل عامل التخفيف من عيار بالعاثية، قد يشير هذا إلى أن رد فعل الخلية الحرة لم تنجح في هذا التعبير الجيني لم يحدث. ويمكن تفسير محتمل لهذا الضرر الهيكلي من الكواشف/بالعاثية الحمض النووي نظراً لتجانس رد فعل الخلية خالية من فورتيكسينج. لتصحيح هذه المشكلة، كرر رد فعل وتجانسه بلطف التنصت على أنبوب رد فعل خمس إلى سبع مرات بأصبع أو بالاختلاط ببطء رد فعل مع ماصة خمس إلى سبع مرات.
النظام رد فعل الخلية الحرة تنبع من كولاي ويحتوي على اندوجينوسلي كولاي رنا بوليميراز والعامل الأساسي سيغما، سيغما 70، التي تجتمع لتشكل هولوينزيمي اللازمة للاعتراف بتوافق الآراء المروج الرئيسي تسلسل الجينات كولاي . بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن الخص النظام رد فعل الخلية الحرة مخطط كامل سيغما عامل النسخ من مناشئ توريد ستة جينات عامل سيغما كولاي أخرى تحت تسلسل توافق مشجع سيجما 70. وهذا يتيح القدرة على تجميع جميع bacteriophages الجينوم التي تتوافق مع كولايالنسخ/الترجمة الآلية. وهذا يترك مجموعة فرعية عاثية يمكن دراستها أو توليفها مع النظام رد فعل الخلية الحرة المستخدمة هنا.
برنامج الترجمة/النسخ خالية من الخلية يسمح بمستوى هائل من التحكم والمرونة في شروط رد فعل في فيفو أساليب الدراسة بالمقارنة. ونحن ناعما لحن العديد من المكونات البيوكيميائية والوراثية لفعل بالعاثية ومباشرة مراقبة الآثار في أقل من 24 ساعة، كما هو موضح في الشكل 4 للزحام الجزيئي. آثار كرووديرس الجزيئية، مثل ربط، على التجميع الذاتي من مجمعات الجزيئات كانت نظرياً الموصوفة، وأظهرت في المختبر18،،من1920. مزاحمة الجزيئية هو انتروبيا التوجه إليه أن يزيد ثابت رابطة الهياكل الجزيئية البيولوجية الكبيرة. يسمح نهج الخلية الحرة الباحث للتحقيق في العمليات البيولوجية المعقدة مثل الفيزياء الحيوية للتجميع الذاتي مع نظم نموذجية، مثل باكتيريوفاجيس، دون القيود المتأصلة في فيفو العمل.
كما يسمح هذا المنبر للتحقيق في مدى فائدة فاجيس في المجالات التطبيقية. يمكن إعادة توجيه الغرض منه مكونات الجينوم بالعاثية واختبارها بسرعة في نظام رد فعل الخلية الحرة بالهدف إدماج نتائج للنانو الرواية. يمكن تعديل bacteriophages بغية زيادة القدرة الانتقائية لعدوى الخلية المضيفة، مما يعزز جدوى العلاج بالعاثية كبديل للبكتيريا المقاومة للمضادات الحيوية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن interest(s) المالية المتنافسة التالية: مختبر نويرو يتلقى أموال البحث من ميكرواراي، موزع من أدوات التعبير خالية من الخلية البروتين ميتكستل.
Acknowledgments
هذه المواد يستند إلى العمل المدعوم من "مكتب البحوث البحرية" جائزة الرقم N00014-13-1-0074 (ف. ن)، "برنامج العلوم الحدود البشرية" منح رقم RGP0037/2015 (ف. ن)، و "مؤسسة العلوم ثنائية" تمنح 2014400 (ف. ن).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ultracentrifugation tubes | Beckman Coulter | 344057 | |
| Conical tubes | Falcon | 352070 | |
| Gradient maker | BioComp Gradient Master | see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9. | |
| Syringe and Blunt Cannula | Monoject | 8881513918 and 888202017 | |
| Wide-bore pipette tips | Fischerbrand | 02-707-134 | |
| Plaque counter | New Brunswik Scientific | Colony Counter Model C-110 | |
| Culture tubes | Fischerbrand | 14-961-33 | |
| Cell-free system | Mycroarray Inc | Mytxtl | |
| BioComp Gradient Master | BioComp Instruments | Model 105ME | |
| LB agar plate recipe | 25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010). |
References
- Carlson, E. D., Gan, R., Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free protein synthesis: Applications come of age. Biotechnol Adv. , (2011).
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: Thinking outside the cell. Metab Eng. , (2011).
- Caschera, F., Noireaux, V. Synthesis of 2.3 mg/mL of protein with an all Escherichia coli cell-free transcription-translation system. Biochimie. 99, 162-168 (2014).
- Shin, J., Noireaux, V. An E. coli cell-free expression toolbox: application to synthetic gene circuits and artificial cells. ACS Synth Biol. 1 (1), 29-41 (2012).
- Chemla, Y., Ozer, E., Schlesinger, O., Noireaux, V., Alfonta, L. Genetically expanded cell-free protein synthesis using endogenous pyrrolysyl orthogonal translation system. Biotechnol Bioeng. , (2015).
- Hong, S. H., Kwon, Y. C., Jewett, M. C. Non-standard amino acid incorporation into proteins using Escherichia coli cell-free protein synthesis. Frontiers in Chemistry. 2, (2014).
- Noireaux, V., Bar-Ziv, R., Libchaber, A. Principles of cell-free genetic circuit assembly. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (22), 12672-12677 (2003).
- Sun, Z. Z., Yeung, E., Hayes, C. A., Noireaux, V., Murray, R. M. Linear DNA for Rapid Prototyping of Synthetic Biological Circuits in an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free System. Acs Synthetic Biology. 3 (6), 387-397 (2014).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. , (2015).
- Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction. ACS Synthetic Biology. 1 (9), 408-413 (2012).
- Garamella, J., Marshall, R., Rustad, M., Noireaux, V. The All E. coli TX-TL Toolbox 2.0: A Platform for Cell-Free Synthetic Biology. ACS Synth Biol. , (2016).
- Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system. Phys Rev Lett. 106 (4), 048104 (2011).
- Daube, S. S., Arad, T., Bar-Ziv, R. Cell-free co-synthesis of protein nanoassemblies: tubes, rings, and doughnuts. Nano Lett. 7 (3), 638-641 (2007).
- Chen, X., et al. An immunoblot assay reveals that bacteriophage T4 thymidylate synthase and dihydrofolate reductase are not virion proteins. J Virol. 69 (4), 2119-2125 (1995).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. J Vis Exp. (79), e50762 (2013).
- Shin, J. N. V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. J Biol Eng. , (2010).
- Caschera, F., Noireaux, V. Preparation of amino acid mixtures for cell-free expression systems. Biotechniques. 58 (1), 40-43 (2015).
- Minton, A. P. How can biochemical reactions within cells differ from those in test tubes. J Cell Sci. 119, Pt 14 2863-2869 (2006).
- Minton, A. P. Implications of macromolecular crowding for protein assembly. Curr Opin Struct Biol. 10 (1), 34-39 (2000).
- Zimmerman, S. B., Minton, A. P. Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu Rev Biophys Biomol Struct. 22, 27-65 (1993).
