Syntesen av infektiös bakteriofager i en E. coli -baserade Cell-free uttryck systemet

Summary

En ny generation av cellfria transkription-översättning plattformar har konstruerats för att konstruera biokemiska system i vitro genom utförandet av genen kretsar. I den här artikeln beskriver vi hur bakteriofager, såsom MS2, ΦΧ174 och T7, syntetiseras från deras arvsmassa som använder ett alla E. coli cell-fri TXTL system.

Abstract

En ny generation av cellfria transkription-översättning (TXTL) system, konstruerad så att en större mångsidighet och modularitet, ger nya möjligheter att utföra grundläggande och tillämpad vetenskap i provrör reaktioner. Under det senaste årtiondet blivit cell-fri TXTL en kraftfull teknik för ett brett spektrum av romanen tvärvetenskaplig forskning områden relaterade till kvantitativa och syntetisk biologi. De nya TXTL-plattformarna är särskilt användbara för att konstruera och förhöra biokemiska system genom utförandet av syntetiska eller naturliga gen kretsar. In vitro TXTL har visat sig vara praktiskt att snabbt prototypen reglerande element och biologiska nätverk samt att recapitulate molekylär självmontering mekanismer finns i levande system. I den här artikeln beskriver vi hur smittsam bakteriofager, såsom MS2 (RNA), ΦΧ174 (ssDNA), och T7 (dsDNA), syntetiseras helt från sin arvsmassa i one-pot reaktioner med en alla Escherichia coli, cell-fri TXTL system. Syntesen av de tre coliphages kvantifieras med plack-analys. Vi visar hur avkastningen av syntetiserade phage beror på biokemiska inställningarna av reaktionerna. Molekylär trängsel, emuleras genom en kontrollerad koncentration av PEG 8000, påverkar mängden syntetiserade fagocyt genom beslut av magnituder. Vi beskriver också hur du förstärker Fager och att rena sin arvsmassa. Uppsättningen protokoll och resultat som presenteras i detta arbete bör vara av intresse för tvärvetenskapliga forskare involverade i cellfria syntetisk biologi och bioteknik.

Introduction

Under det senaste årtiondet, har cellfria uttryck tekniken utvecklats till adress nya tillämpningar i framväxande tvärvetenskaplig forskning områden relaterade till syntetiska och kvantitativ biologi. Ursprungligen används för att uttrycka proteiner oberoende av en levande organism, har nya cellfria TXTL system utvecklats för både grundläggande och tillämpad vetenskap^1,2, avsevärt utvidga omfattningen av denna teknik. Den nya generationen av TXTL plattformar har utformats för att vara användarvänlig, effektivare (når 2 mg/mL av proteinsyntesen i batch-läge³), mer mångsidig i nivå med transkription⁴, och modulär så att enkelt integrera roman naturliga eller syntetiska funktioner som utökar funktionerna i befintliga biologiska system^5,6. I synnerhet blivit cellfria TXTL system händig för den rapid prototyping av genetiska program, till exempel föreskrivande element eller små genetiska kretsar^7,8,9, genom att minska det design-build-testet cykla till några dagar. Anmärkningsvärt är är de nya TXTL-systemen också kan bearbeta stora DNA program såsom komplett syntesen av coliphages^10,11, visar stark nog föreställningar till stöd för beredning av aktiv genomisk DNA-kodad levande enheter.

TXTL systems presenterar många tekniska fördelar jämfört med traditionella in vitro- konstruktiv biokemiska analyser. Cell-fri TXTL länkar processen av genuttryck till den slutliga produkten i en reducerad och öppen miljö, i motsats till komplexa cytoplasman i en levande cell. TXTL använder DNA rekonstruera biokemiska system i vitro, vilket med moderna tekniker för DNA-församling, är prisvärd och snabb förutom att inte kräva kräset protein reningssteg. Cellfria uttryck ger direkt tillgång till de flesta komponenter i de biokemiska reaktioner, vilket möjliggör en djupare dissektion av molekylära interaktioner¹². I en TXTL reaktion, kan man ändra de biokemiska och biofysiska inställningarna på vilja, vilket är nästan omöjligt i en levande cell. Med tanke på dessa fördelar och senaste förbättringar, blir TXTL tekniken mer och mer populärt som en alternativ plattform för syntetiska och kvantitativ biologi. Medan forskning gemenskapen med hjälp av TXTL växer snabbt och TXTL blir en standardteknik i bioteknik, är det viktigt att förstå hur man använder sådana plattformar för att utveckla lämpliga metoder relaterade till verkställandet av TXTL reaktioner och till den tolkning av resultaten.

I den här artikeln beskriver vi hur du använder en alla E. coli TXTL systemet för att syntetisera, i one-pot reaktioner, bakteriofager från deras arvsmassa¹¹, såsom MS2 (RNA, 3.4 kb), ΦΧ174 (ssDNA, 5.4 kb), och T7 (dsDNA, 40 kb). Vi visar hur mängden fagocyt syntetiseras ändringarna med avseende på några av de biokemiska reaktionerna (magnesium och kalium koncentrationer). Molekylär trängsel, emuleras genom ett utbud av PEG 8000 koncentrationerna, har en dramatisk effekt på phage syntes över flera tiopotenser. Förverkligandet av sådana stora biokemiska system i enda provrör reaktioner som recapitulate samtidigt processerna för transkription, översättning, och självmontering, är intressant för att ta itu med grundläggande frågor om biologi och biofysik ¹⁰ (genreglering, självmontering), såväl som för att utveckla applikationer, såsom återanvända phage funktioner för att bygga nya nanostrukturer¹³. Förutom en praktisk på TXTL och tillhandahåller vi metoder för phage förstärkning, genomet extraktion och rening och phage kvantifiering av plack analysen. De metoder som presenteras i detta manuskript är lämpliga för forskare som använder E. coli extrakt baserat cellfria system och är intresserad av bakteriofager.

De protokoll som presenteras i detta arbete kan sammanfattas som följer: 1) Phage amplifiering (dag 1: förbereda inympning celler, dag 2: enda plack, flera phage tillväxt, och koncentration och dag 3: rening av phage), 2) dubbelsträngat arvsmassan DNA-extraktion (fenol/kloroform extraktion), och 3) Cell-free phage reaktion och antikroppnivåns experiment (dag 1: tallrik värdceller och göra agarplattor, dag 2: cellfria reaktion och mottagande cell före kultur och dag 3: värd cell kultur och phage titer).

Protocol

Obs: följande förstärkning kliver, och extraktionen metod är till stor del generaliserbart för många dubbelsträngat DNA phage, t.ex., bacteriophage T7, enterobakterier phage T4 eller enterobakterier phage λ (L). De används huvudsakligen för en phage vars arvsmassa inte är lätt tillgängliga för köp från kommersiella källor.

1. phage förstärkning

Obs: singel-plack, flera cykel (SPMC) phage produktion tekniken är väl beskriven för den T4 fag i Chen, et al. ¹⁴ följande phage förstärkning och DNA extraktionen metod är en generalisering för användning med E. coli dubbelsträngat DNA fagocyt, t.ex., T7, T4 eller L. Den slutliga framgången i protokollet tungt beror på den valda värddator cell stammen ' s förmåga att tåla superinfektion förhållanden. Om de mottagande cellerna är instabil under superinfection, eller superinfektion nås aldrig och lysis nås aldrig detta kritiska skede, är det bäst att gå vidare med ett konfluenta lysis protokoll. Detta inkluderar att separera det cellulära skräpet via höghastighets centrifugering och phage pelletering vid ultracentrifugering hastigheter. Alla följande villkor och parametrar är avsedda som allmän utgångspunkt. De optimala förhållandena för en lokal värd cellinje kan vara olika; fastställa och följa de tillämpliga villkor.

1. Förbereda inympning celler
   1. Inokulera 10 mL Luria-Bertani (LB) media i en 15 mL kultur tub med E. coli värdceller, t.ex., B eller K12.
   2. Plats i en shaker inställd på 250 rpm och 37 ° C. lämna över natten att växa till mättnad.
2. Single-plack, flera cykel phage tillväxt och koncentration
   1. för att förbereda en tallrik av behöriga phage plack, värma flera LB-agar plattor vid 37 ° C i 1 h, eller över natten.
   2. Förbereda flera spädningar av fag lager (t.ex. T7, T4 eller L) av känd koncentration i LB media, sikte för ~ 10 ² -10 ³ phage/mL.
   3. Tillsätt 100 µL av övernattning tillväxt av koncentrerad värdceller att varje platta.
   4. Välj volymer av det beredda phage utspädningar motsvarar ett utbud från 10-100 phage/platta. Lägga till volymen som krävs av phage utspädningar i varje platta (t.ex., 100 µL 10 ³ phage/mL; detta bör producera ~ 100 plack). Inkubera plattorna vid 37 ° C och påbörja en count-up timer (+ 0 h). Inkubera i 4-5 h.
   5. Förbereda 49 mL LB media i en 250 mL kolv och plats i skakapparat inställd på 250 rpm och 37 ° C.
   6. På + 2,5 h, utspädd celler 50 x genom att tillsätta 1 mL mättad cellkultur från övernattning tillväxt i en pre värmde mätkolv som innehåller 49 mL LB medium. När cellerna når loggen tillväxt (+ 4-5 h), Mät absorbansen vid 600 nm (OD ₆₀₀). Bestämma koncentrationen av celler med omvandlingen OD ₆₀₀ av 1.0 = 8 x 10 ⁸ celler/mL.
   7. Dilute till 2 x 10 ⁷ cell/mL använda ytterligare LB tillväxt medier. Ta bort den agarplatta som innehåller phage plack från inkubatorn. Omedelbart använda i slutet av en steril Pasteur-pipett till kärna ur och ta bort en enda plack. Blåsa plack i utspädda cellerna och inkubera vid 37 ° C för en ytterligare 2 h (+ 6-7 h).
   8. Test för full infektion genom provtagning 500 µL i en 1,5 mL tub, lägga 10 µL kloroform (CHCL ₃), och omedelbart vortexa i hög hastighet. Observera om lösningen har klargjort. När cellerna är helt infekterad, inkubera i en annan 2 h (+ 8-9 h).
      Obs: Om cellerna är fullt smittade, de kommer snabbt lyse (< 2 min) och klargöra lösningen. Andra resultat anses i diskussionen avsnitt nedan. Cellerna kommer att vara superinfected men kommer inte lyse fram till denna punkt. Om lysis börjar, tillägg av DNAS och skörd genom centrifugering måste börja omedelbart att förhindra phage nedbrytning.
   9. Lägg till DNAS till 5 µg/mL och centrifugera celler vid 8000 x g vid 4 ° C till pellet. Kassera supernatanten. Återsuspendera pelleten i 10 mL av 1 x TRIS magnesiumklorid (TM) (50 mM Tris vid pH 7,8, 10 mM MgCl ₂) buffra med 5 µg/mL DNAS. Tillsätt 500 µL av CHCL ₃ och vortex i hög hastighet att lysera celler. Förtydliga genom centrifugering vid 12 000 x g under 10 minuter vid 4 ° C. Dekantera supernatanten i en 15 mL koniska rör och förvaras vid 4 ° C.

2. Rening av Phage

Obs: sackaros rening är till stor del beroende av storleken på phage. Överväganden för massan av phage isoleras måste göras och lutningsförhållanden justeringar utförs. Slutliga viral titrar av över 10 ¹³ phage/mL kan lätt uppnås med den här metoden.

1. Förbereda 12 mL 5% och 45% w/v sackaros 1 x TM buffert.
2. Förbered 4 x 5-45% sackaros övertoningar pipettering 2,5 ml av 45% sackaros in 4 ultracentrifugen rören. Toppa med ~ 5% sackaros, stoppa när vätskan når 2 mm från kanten av röret 2,6 mL.
   Obs: Placera pipettspetsen i kontakt med ytan för sackaros och mycket långsamt dispensera vätskan. Den ljusare sackaroslösning kommer att flyta ovanpå tyngre, bildar en skarp gräns. En korrekt skiktad lösning måste ~ 1 mm-gränssnitt om hålls mot bakgrundsljus.
3. Blanda Övertoningarna av tilt-tube rotation med en lutning som bildar instrument för 43 s vid 86° vid 23 rpm. Om det inte omedelbart behövs, täck med paraffin film och förvaras vid 4 ° C.
4. Ta bort 500 µL från toppen av varje beredd sackaros övertoning med en 1 mL vi rekommenderar och balans till inom ± 0,002 g.
5. Pool phage suspensioner från alla rör (steg 1.2.9). Med 1 mL pipett tillsätt 500 µL av suspensionen genom att spetsen i kontakt med flytande ytan och mycket långsamt dispensering volymen till toppen av sackaros övertoningen, vara noga med att inte blanda genom snabba pipettering. Centrifugera vid 70 000 x g under 20 minuter vid 4 ° C.
   Obs: Balans de beredda Övertoningarna till inom ± 0,002 g. mindre fagocyt kan ta upp till 1 h.
6. Ta bort phage banden med en steril spruta och trubbig kanyl.
   Obs: När sedd från sidan, phage bandet kommer att vara tjock och mjölkaktig jämfört med omgivningen, ca 5 mm i höjd, och ligger halvvägs ner centrifugröret.
   1. Sänk en trubbig kanyl i lösningen tills spetsen är centrerad på phage bandet mycket övre kant. Ta bort bandet genom att rita på sprutkolven tills flesta phage band har tagits bort.
7. Lägga till sackaros volymen med den svävande phage i 3-4 ultracentrifugen rör. Lägga till mer än 1,5 mL/tub. Fyllning till ~ 3-4 mm från toppen av röret med kall 1 x TM. Täck med paraffin film och Invertera om du vill blanda. Tillbaka i en ultracentrifugen och spinn på 145 000 x g för 1 h vid 4 ° C till pellet. Mindre fagocyt kan ta upp till 2 h.
8. Snabbt Häll av supernatanten och dränera uppochner på engångständare våtservetter. Torka insidan av röret med steril bomullspinne ta bort överflödig supernatanten.
9. Dela upp 200-400 µL kallt 1 x TM över alla pellets och resuspendera över natten vid 4 ° C, ingen skakning krävs.
   Obs: Om pelleten inte är ren, t.ex., trådiga bitar av membran, DNA, etc., pool och utföra ytterligare centrifugering i en mikrocentrifug på 17.000 x g.
10. Dagen innan att göra titrar, förbereda en kultur av E. coli värdceller i 10 mL LB tillväxt medier och lämna i en skakande inkubator inställd på 250 rpm och 37 ° C under natten. Inkubera lämplig mängd kultur plattorna vid 37 ° C i minst 1 h innan titrar av phage beståndet.
    Anmärkning: Antalet plattor att ruva beror på antalet utspädningar av fag lager att beläggas: varje unik utspädning av fag lager kräver två kultur plattor (t.ex., fyra olika spädningar av fag lager kräver åtta kultur plattor).
11. Bereda 100 mL topp agar genom att lägga till 2,5 g LB och 0,6 g bacto-agar till en 100 mL flaska. Lös upp fasta i avjoniserat vatten i en volym på 100 mL och autoklav. Efter autoklav, långsamt Invertera flaskan 6 - 8 gånger att homogenisera ägarn i hela lösningen. Placera flaskan i 45 ° C vattenbad i 15-20 min temperera temperaturen .
12. Bered seriella utspädningen av fag lager med lösningen LB.
    1. Lägg till 990 µL LB till 10 µL fag lager för en 100-faldig utspädning. Vortex att homogenisera. För utspädningsfaktor 10, tillsätt 100 µL av fag lager till 900 µL LB. Vortex att homogenisera.
    2. Upprepa ovanstående spädningsserien så många gånger som behövs för att erhålla en räknebart antal plack (10-100 plack).
       Obs: För att uppnå detta, späd fag lager 2-3 storleksordningar mindre än den förvänta phage avkastningen i form av phage/mL reaktion. Till exempel om en viss fag lager innehåller 10 ¹¹ smittsamma phage/mL, tallrik phage beståndet en 10 ⁸-faldig eller 10 ⁹-vik spädning.
13. Förbereda ett område för phage titrar av montering 14 mL kultur rör (antalet kultur rör motsvarar antalet fag lager utspädningar till pläteras). Placera de utspädda fag lagerföra proverna från steg 2.12 och värd bakteriecellerna från steg 2.10 på ice.
14. Förbereda en master mix av pipettering 5,25 mL topp agar (steg 2.11), 220 µL utspädd phage prover (steg 2.12) och 50 µL värd bakterieceller (steg 2.10) till en 14 mL-kultur tube. Cap kultur tuben och vortex i hög hastighet.
    1. Den återstående phage förvaras vid 4 ° C.
15. Hämta två kultur plattor (steg 2.10) från 37 ° C inkubatorn. Tillsätt 2,5 mL av master mix långsamt till mitten av den första plattan (utan bubblor). Försiktigt rotera plattan för hand för att fördela huvudmixen jämnt så att det spänner över hela kultur plattan. Upprepa med den andra plattan. Vänta 20 min för att säkerställa solidifiering av topp agar. Inkubera plattorna vid 37 ° C i 4-7 h.
16. Räkna plack och fastställa phage koncentrationen för varje prov som reaktion.
    Obs: Plack visas som 1-2 mm klart cirklar i ogenomskinliga mattan av värdceller. Se figur 1 för representativa resultat. En framgångsrik phage produktion kommer att resultera i slutliga koncentrationer av 10 ¹² -10 ¹³ phage/mL.

3. Dubbelsträngat arvsmassan DNA-extraktion

Obs: utspädning, skakningar, och centrifugering steg måste optimeras för att utveckla en tjock, fast protein gränsskikt mellan fenol och vattenhaltiga faser. Detta genererar högsta renhet genomen som är fritt från föroreningar i protein. Den första spädningen är beroende av den slutliga phage titern. En extremt hög titer fag lager (≥ 10 ¹³ phage/mL) kan behöva en 10-20-faldig utspädning före extraktion, medan låg titer bestånd (~ 10 ¹⁰ -10 ¹¹ phage/mL) kanske bara behöver en 2-faldig eller none. Om det är svårt att bilda ett fast protein-lager i efterföljande steg eller vattenhaltiga suspensionen är alltför klibbig att vara genomförbart på grund av den höga DNA-koncentrationen, överväga en högre utspädning av fag lager innan du fortsätter extraktion. Under varje genomet-hantering steg, det är viktigt att använda wide-bore pipettspetsar när pipettering någon aqueous faser. Många phage genomen är ganska stora och lätt fragmenterad genom pipett klippning. Dessutom någon vortexa uttryckligen undvikas eftersom detta kommer att kraftigt skeva genomen.

1. Späd en del av fag lager från steg 2,9 till 400 µL med 1 x TM buffert i en fräsch 1,5 mL tub.
2. Lägga en lika stor volym av Tris:Phenol:Chloroform till utspädning. Skaka blandningen försiktigt på ett laboratorium rocker, eller för hand, för 5 min. Centrifugera resulterande emulsionen vid 17 000 x g i en bänkmonterade centrifug för 5-10 min.
   Obs: Ett distinkt, vit protein skikt på ytan av den underliggande fenol-fasen är närvarande.
3. Ta bort övre vattenfasen till en ny tub utan för att störa interphase gränsen.
4. Upprepa steg 3,2-3.3 ytterligare 2 gånger för totalt 3 fenol extraktioner. Överföra vattenfasen till en frisk slang och tillsätt en motsvarande volym av CHCl ₃. Skaka och centrifugera (steg 3,2). Överföra det aqueous DNA-provet till en ren tube.
5. Uppskatta volymen av renade DNA. Lägga till 0.4 volymer 3 M natriumacetat (CH ₃ COONa) och 3 volymer av 95% etanol (EtOH). Placera i-20 ° C frys för övernattning nederbörd. Centrifugera vid 17 000 x g i en bänkmonterade Centrifugera i 10-15 min.
   Obs: DNA kommer omedelbart torka ut och bli synlig som en massa i suspension i röret. Ordentlig resulterande pelleten är vit och väl packade mot botten av röret.
6. Avlägsna och Kassera supernatanten antingen genom dekantering eller pipettering. Tillsätt 500 µL 70% EtOH och försiktigt skaka röret tills pelleten flyter gratis från botten av röret. Centrifugera vid 17 000 x g i 5 min. ta bort och kassera EtOH, noga med att inte störa pelleten.
7. Upprepa steg 3.6. Luft torka pelleten på bänkmonterade för 30-60 min. Tillsätt 50 µL ddH ₂ O att pelleten och inkubera i 1 h på RT eller övernattning på 4 ° C för att resuspendera. För att bestämma DNA koncentration med absorption mätningar vid 280 nm.
   Obs: De förväntade koncentrationerna är 0,5-5 µg/µL med denna teknik. Dela upp av den totala genomisk molekylvikten att avgöra den slutliga genom koncentrationen.

4. Cellfria Phage reaktion och Phage Titer Experiment

1. förbereda 25 g LB medium och 15 g bacto-agar solid, häll i en 1 L flaska och Tillsätt avjoniserat vatten till 1 L. autoklav.
2. Efter sterilisering, Invertera flaskan långsamt 6 - 8 gånger med omsorg för att undvika bildandet av bubblor. Flaska inversionen kommer att homogenisera agar fast hela 1 L lösningen. Placera flaskan i 58 ° C vattenbad för 20 min före dispensering på kultur plattor.
3. När temperaturen i LB-agar lösningen har jämviktas, förbereda en flamma bredvid kultur plattorna att sterilisera miljön nära öppen kultur plattorna. Håll flaskan 1 L i vattenbadet att undvika solidifiering av agar samtidigt alikvoter. Tillsätt 25 mL till en platta med 100 x 15 mm i kultur. 1 L kommer att producera 40 kultur plattor.
4. Upphäva en kultur plattan och låt stelna i minst 1 h i RT; denna platta kommer att användas för plätering vara värdcellerna. Låt andra 39 kultur plattorna stelna i 2 dagar på RT. butik vid 4 ° C eller använda omedelbart för att göra titrar.
5. Tavla värdcellerna av strimmor den lämpliga bakteriestam (t.ex. värd B för T7) som förvarades vid-80 ° C, på LB-agarplatta med kultur. Strimma bredvid en öppen eld att undvika miljöförorening. Inkubera över natten vid 37 ° C. De mottagande cellerna har ingen antibiotikaresistens så det är viktigt att arbeta i en steril miljö.
6. Cell-free reaktion
   Obs: De cell-free TXTL reaktionerna består av 33% rå E. coli extrakt (8,9-9,9 mg/mL protein) med andra 67% består av reaktion buffert och phage genomet. Den råa extraktet är beredd som tidigare beskrivits ^{15 , 16}. Slutliga reaktion villkor är: 8,9-9,9 mg/mL protein (från rå extrakt), 3-6 mM Mg-Glutamat, 40-100 mM K-Glutamat, 2-4% PEG 8000, 3-4 mM för varje aminosyra, förberedda som tidigare beskrivna ¹⁷ och en mix energilösning, beskrivs tidigare ¹⁵, sammansatt av 0,33-3,33 mM DTT, 50 mM HEPES, 1,5 mM ATP och GTP, 0.9 mM CTP och UTP, 0,2 mg/mL tRNA, 0,26 mM CoA, 0,33 mM NAD, 0,75 mM cAMP, folinsyra 0,068 mM, 1 mM spermidine och 30 mM 3-PGA. DNA-typ fagocyt kräver genomet koncentrationer av 0,5-10 nM och RNA-typ fagocyt kräver en rad 50-150 nM. Slutliga reaktion koncentrationer är unika för den särskilda phage syntetiseras och faller inom det intervall som beskrivs ovan. För optimal syresättning av reaktioner, ska slutliga reaktion volymer vara mellan 10-20 µL. Det finns små variationer i protokollet reaktion, som beror på form av genomisk molekylen. Exempelvis kräver linjär genomet molekyler en extra komponent i reaktionen att hämma nedbrytning av linjära DNA-bitar av enzymet recBCD närvarande i den råa extraktet.
   1. Komplett den " reaktionen Detaljer " avsnitt i tabell 1 (PhageTXTL_JOVE) genom att ange det totala antalet reaktioner och slutlig volym av reaktion.
   2. Design experimentet genom att bestämma de konstant komponenter och rörliga delar av reaktionen. Ange procentandelen fraktionerad volym master mix, som är förhållandet mellan den totala volymen av konstant reaktion komponenter till produkten av den slutliga reaktionsvolym och antal prover. Ange lager och slutliga koncentrationer av reaktion reagenserna i den " Master Mix reaktion recept " avsnitt i PhageTXTL_JOVE. Ange lager och slutliga koncentrationer av de variabla reagenserna testas.
      Obs: Volymerna av reaktion komponenter automatiskt beräknas utifrån den master mix-volymen och sista volymen av varje individuell reaktion.
   3. Ta bort den nödvändiga mängden rör (som anges i den " rör Tina " avsnitt av PhageTXTL_JOVE.xlsx) av rå cell extrakt, buffert energimix och aminosyra mix från-20 ° C eller -80 ° C och Tina på ice.
      Obs: En gång tinade, kombinera flera portioner av liksom komponenter (om nödvändigt).
   4. Alikvot angivna volymen av rå extrakt, 33% av den slutliga reaktion volymen, i en mikrocentrifug rör.
   5. Förbereda huvudmixen enligt tabell 1. Homogenisera alla komponenter under " Master Mix reaktion recept " av vortexa. Lägga till lämplig volym av varje komponent i den råa extraktet.
   6. Om arbetar med en phage med linjära DNA-genomet (t.ex. T7), lägga till 1 µM av proteinet gam av bacteriophage lambda reaktion ¹¹. Vortex att homogenisera lösningen, och placera reaktionen på is för 5 min. Detta hämmar nedbrytning av linjära DNA bitarna av recBCD komplex, som är inneboende i den råa extraktet.
   7. Efter tillägger den sista komponenten enligt tabell 1, homogenisera reaktionen av vortexa. Dela huvudmixen in n mikrocentrifugrör.
      Obs: Volymen av varje split är produkten av procentandelen fraktionerad huvudmixen volym och sista volymen av reaktion. Exempelvis för fraktionerad huvudmixen volymprocent av 90 procent och volymen slutliga reaktion på 12 µL, volymen av varje split är 10,8 µL.
   8. Lägga till de angivna volymerna av de rörliga delarna i arrayen master mix (se tabell 1). Tillsätt vatten till varje reaktion på når den önska slutliga reaktion volymen. Homogenisera varje reaktion genom vortexa. Inkubera i mikrocentrifugrör vid 29 ° C i minst 8 tim eller över natten.
7. Värd före cellkultur
   Obs: natten före kulturen är utspädda 50: 1 för att vara värdcellerna används för titer experimentet ska i mitten av log fas, vilket ökar infektion effektivitet. Mitten av log cellerna sedan åter koncentreras genom 10-faldigt och lagras på is.
   1. Med hjälp av en steril pipettspetsen, Inokulera en kultur tub 5 mL LB med 3-5 friska värd cell kolonier. Arbete vid en öppen eld att undvika kontaminering.
   2. Inkubera kultur röret i en skakande inkubator vid 37 ° C och 250 rpm för 16 h eller över natten. Celler kan nå mättnad fas nästa dag.
8. Värd cell kultur och prov förberedelse för phage titer
   1. fördela 50 mL LB i en 500 mL-Erlenmeyerkolv och täck med aluminiumfolie. Värm kolven vid 37 ° C i 20 min.
   2. Alikvotens 1 mL värd över natten före cellkulturen i den pre värmde LB. Inkubera under 3-4 timmar vid 37 ° C och skaka vid 250 rpm.
   3. Centrifugera 50 mL värd cellkulturen i 10 min på 5000 x g. Kassera LB.
   4. Återsuspendera pelleten med kallt (4 ° C) 5 mL LB och hålla på ice.
   5. En timme före start titer experimentet, inkubera kultur plattorna vid 37 ° C.
      Obs: Varje unik phage reaktion (och motsvarande utspädningsfaktor) kommer att använda två plattor. Dessutom, inkubera 4 tallrikar för experimentell kontroller (se figur 1 för representativa positiva och negativa kontroller).
   6. Bereda 100 mL topp agar (steg 2.11).
9. Preparera en seriell utspädning av cellfria reaktionen med LB lösning som beskrivs i avsnitt 2.12.
10. Phage titer
    Obs: Börja plattan efter kultur rätter har inkuberas i minst 1 h och den översta agar var i 45 ° C vattenbad i 15-20 min efter borttagning från autoklaven.
    1. Titer de slutliga cellfria reaktion-LB lösning som beskrivs i avsnitt 2, steg 2.14-2.16.

Representative Results

Vi visar fyra representativa resultat. I figur 1, presenterar vi en uppsättning negativa kontroller för att säkerställa att det cell-free TXTL systemet och phage DNA bestånden inte är smittade med levande E. coli celler. Vi verifierar att det cell-free TXTL systemet är gratis intakt E. coli cell kontaminering av plätering både en icke ruvade och inkuberas reaktion lösning som ogiltig av genomisk DNA (figur 1A och figur 1B). Om cell-fri TXTL systemet var förorenat med E. coli celler, skulle tillväxt observeras på plattan. Dessutom verifierar vi att cellfria reaktionen, och därför inte någon möjligt främmande celler, är ansvarig för syntesen av phage av plätering icke ruvade och inkuberas reaktioner med phage genomet (figur 1C och Figur 1D). Plattan med icke ruvade reaktionen (figur 1C) visar noll plack medan plattan med ruvade reaktionen (figur 1D) visar plack, som anger det cell-free TXTL systemet var ansvarig för phage syntes.

I figur 2jämför vi en homogen kontra inhomogena plack assay. Figur 2 B illustrerar en gradient av plack över kultur plattan, som är optimal i jämförelse med en homogen plack densitet på plattan i figur 2A. Källan till detta observerade resultatet är från för snabb kylning av master mix av topp agar, prov och värd bakterieceller när expedieras på en kultur plattan under phage titer delen av experimentet. För att undvika en inhomogena spridning av phage plack, säkerställa att kultur plattorna är utjämnad till 37 ° C innan phage titer experimentet.

Ett avgörande steg korrekt räkna Fager är att späda ut phage lösningen tillräckligt för att få mellan 50 och 200 plack per platta (figur 3). Nedanför detta intervall, det är svårt att avgöra sann statistik och ovan detta intervall, plack överlappa, förhindra korrekt räknas. Antalet fagocyt syntetiseras i TXTL beror på biokemiska inställningar, till exempel koncentrationen av salter (kalium och magnesium), molekylär crowders och av arvsmassan. I figur 4visar vi några exempel på tester för fagocyt T7 och ΦΧ174. För en phage som replikerar sitt DNA, såsom T7, vi observerar en hög effektivitet av phage syntes i cellfria reaktionen: tre smittsamma fagocyt syntetiseras per genomet molekyl i reaktionen. Man kan förvänta sig en lägre verkningsgrad på reaktion för en phage som inte replikerar dess DNA, såsom ΦΧ174: förhållandet mellan syntetiserade smittsamma phage att genomet molekyl är 1:5.

Figur 1: Plack assay kontroller och framgångsrika smittsamma phage produktion använder cellfria reaktion (CFR). (A) ingen genomet har lagts till och inga inkubation (0 min som inkubationstid) av CFR utfördes. Reaktionen var då klädd utan värd E. coli. Resultatet visar ingen livskraftig värd cell kontaminering av CFR. (B) ingen genomet lades och CFR var inkuberas 12 h på 29 ° C och förkromad utan värd E. coli. Resultaten visar ingen livskraftig värd cell kontaminering av CFR, t.o.m. efter inkubation. (C), 1 nM genomet medföljer ingen inkubering av CFR (0 min som inkubationstid) och klädd med värd E. coli. Resultatet visar ingen phage kontamination av genomet lösningen. (D), 1 nM genomet ingår och CFR inkuberas 12 h på 29 ° C. och pläterade med värd E. coli. Resultaten visar framgångsrika smittsamma phage replikering i CFR. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 : Homogen kontra inhomogena spridningen av phage reaktion under titer experiment. En möjlig effekt av utför en phage titer på kultur plattor inte jämviktas till en temperatur av 37 ° C är inhomogena spridningen av phage reaktion över kultur plattan. Ett bra resultat visar en homogen spridning av phage reaktion visas i (A), där plack är jämnt fördelade över ytan av plattan. Ett optimalt resultat visas i (B), där plack är koncentrerade i den nedre vänstra delen av kultur plattan. Detta kan ske med den topp-agar, phage reaktion och mottagande cell master mix är förpackat på en kultur plattan som inte är vid en temperatur av 37 ° C. Majoriteten av huvudmixen stelnar i regionen nedre vänstra och en homogen spridning är inte möjligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 : Ange en lämplig utspädningsfaktor för titrar av cellfria phage reaktion. (A) Denna platta visar ett rimligt räknebart antal plack. Utspädningsfaktorn används för titer del av experimentet utspädd avkastningen av phage reaktionen tillräckligt att lämna ett räknebart antal plack på plattan. Omvänt i (B) utspädningsfaktorn var för låg med hänsyn till avkastningen av syntetiserade phage och behöver justeras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 : Karakterisering av cellfria syntesen av Fager ΦΧ174 och T7. (A) antal synthesized ΦΧ174 och T7 Fager (PFU/mL: plaque bildar enheter per milliliter) mätt som en funktion av PEG 8000 koncentration i cellfria reaktionen, efter 16 timmars inkubation vid 29 ° C. (B) antal synthesized ΦΧ174 och T7 Fager som en funktion av magnesium-glutamat i cellfria reaktionen, mätt efter 16 timmars inkubation vid 29 ° C. (C) antal synthesized ΦΧ174 phage som en funktion av ΦΧ174 DNA-genomet koncentration i cellfria reaktionen, mätt efter 16 timmars inkubation vid 29 ° C. (D) antalet syntetiserade T7 phage som en funktion av T7 DNA-genomet koncentration i cellfria reaktionen, mätt efter 16 timmars inkubation vid 29 ° C. Alla felstaplar visas är standardavvikelser tre upprepade försök. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: reaktion sammansättning. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Efter tekniken i Chen, o.a. ¹⁴ för SPMC, ett kritiskt steg uppnås vid fastställandet av rätt förutsättningar för superinfektion. Parametern som närmast styr en värd Stams förmåga att motstå superinfektion är ofta den ursprungliga koncentrationen av den infekterande phage. De mottagande cellerna måste vara i logaritmisk tillväxtfas innan första infektion med en mycket liten mängd phage. Så småningom phage når också logaritmisk tillväxt och målet är att tillåta phage nummer till snabbt överträffa det celltalet, vilket möjliggör flera kopior av phage i varje mottagande cell. Detta tvingar cellen i en kvasi stabilt tillstånd där det inte genomgår lysis. Om detta tillstånd inte nås, kommer cellerna genomgå cascading, konfluenta Lys, och släppa sin virusmängd. Om superinfektion inte kan nås med hjälp av ovanstående inledande viral koncentrationerna, lägre inledande multiplicityen av infektion med en faktor tio innan du gör en efterföljande försök. Om de mottagande cellerna lysera innan skörd och superinfektion inte nås, omedelbart gå vidare med ett separat rening förfarande. Lägg till DNAS I till 5 µg/mL och 500 µL CHCl₃ att slutföra alla Lys. Fortsätta att snurra i en ytterligare 5 min och sedan Centrifugera 10 000 x g ta bort cellulära skräp. Dekantera och Centrifugera supernatanten vid 75 000 x g för 1-2 h till pellet phage och återsuspendera över natten i 1 mL totalt 1 x TM buffert vid 4 ° C utan att skaka. När testning för superinfektion med en liten volym av celler, är det möjligt att mäta hur nära celler till lys av hur snabbt de lyse när utsätts för den extra kloroform. Om cellerna lyse och lösningen klargör nästan omedelbart, cellväggarna är mycket instabila och celler bör skördas omedelbart för att förhindra storskaliga cascade lysis. Om testet lyserar inom 1-3 min, kan de större volymerna fortsätta att superinfect för upp till 2 h, beroende på de lokala stammen av E. coli används. Om cellerna inte lyse inom 5 min, phage tillväxt har inte hunnit upp till E. coli tillväxten och primära inkubation bör fortsätta. Utför testet igen i 30-60 min.

När renande phage på en förberedd sackaros lutning, visas phage som en mycket tjock, pärlemorskimrande band mellan en tredjedel och två tredjedelar av vägen ner röret. Förutsatt att en relativt framgångsrik lysis och cellulära kvarleva reningssteg, kan det finnas andra, lätta band men ingen av liknande densitet eller storlek. Stora, ogenomskinlig bandet innehåller phage och ska tas bort från lösningen med en steril spruta och trubbig kanyl.

När du startar den tredje delen av protokollet, cellfria reaktionen och phage titer, är det bäst att använda färska kultur plattor (mindre än en vecka gamla) för värd bakterier plattan (från steg 3.5) och också kultur plattorna används för titer analysen (från steg 3.21). Detta kommer att främja starkare tillväxt av bakterier värdceller och högre infektion effektivitet för phage titern. Phage kultur plattor måste före inkuberas vid 37 ° C i minst 1 h innan den phage titer del av protokollet. Utan före inkubering av phage kultur pläterar, topp-agar lösningen (innehållande syntetiserade phage och värd cellkulturen) kommer inte homogent att distribuera över ytan av kultur plattan. I stället kommer top-agar lösningen homogeneously stelna på ytan (figur 2b). Detta ökar sannolikheten för flera fagocyt lokalisera i samma plats, vilket kan orsaka en underskattning av phage avkastning i cellfria reaktionen.

Varje plack representerar i händelse av en syntetiserade phage infekterar en värdcell, replikera inom värdcellen och lyseringslösning värdcellen. Plack växer i storlek under inkubationstiden från avkomma phage infekterande granne värdcellerna från händelsen initial infektion. Om inga plack observeras, är det möjligt att utspädningsfaktorn gjort i protokollet avsnitt 4.6 är för hög vilket resulterar i en låg sannolikhet att någon syntetiserade phage infekterar en värdcell. För att åtgärda detta, minska utspädningsfaktorn med 3-4 tiopotenser (eller vid behov) och upprepa titer experimentet. Omvänt kan utspädningsfaktorn vara för hög vilket resulterar i plack som spänner över hela ytan av kultur plattan, vilket gör det omöjligt att räkna phage avkastningen. I detta fall öka utspädningsfaktorn med 3-4 tiopotenser (eller vid behov). För en välkarakteriserad phage, avkastningen av cellfria reaktionen kommer att vara kända och endast en utspädningsfaktor per reaktion punkt blir nödvändigt för titer experimentet. När karaktärisera en ny phage, är det bäst att ta 2-3 olika utspädningsfaktorer per reaktion punkt, att säkerställa att en av spädningarna kommer att ge en uppräknelig plack (se figur 3 för skillnader mellan ett kvantifierbart och oräkneliga antal plack på en platta).

Om ingen plack observeras efter ändra utspädningsfaktorn för phage titern, kan detta tyda att cellfria reaktionen var misslyckade däri genuttryck uteblev. En möjlig förklaring till detta kan vara strukturella skador av reagenser/phage DNA på grund av homogenisering av cellfria reaktionen av vortexa. För att åtgärda problemet, upprepa reaktionen och homogenisera genom att försiktigt knacka reaktionsröret fem till sju gånger med ett finger, eller långsamt blandning reaktionen med pipett fem till sju gånger.

Cellfria reaktion systemet påbörjar från E. coli och innehåller endogent både E. coli RNA-polymeras och den primära faktorn sigma, sigma 70, som tillsammans utgör holoenzyme nödvändigt att erkänna den största promotor konsensus sekvenser av E. coli gener. Dessutom kan systemet cellfria reaktion sammanfatta hela sigma faktor transkription systemet av exogent levererar sex andra E. coli sigma faktor gener arrangören samförstånd ordningsföljden av sigma 70. Detta tillåter förmåga att syntetisera alla bakteriofager vars arvsmassa är kompatibla med E. colitranskription och översättning maskiner. Detta lämnar ut en delmängd av bacteriophage som inte kan studeras eller syntetiseras med cellfria reaktion systemet utnyttjas här.

Cellfria transkription och översättning plattformen möjliggör en imponerande nivå av kontroll och flexibilitet av reaktion villkor jämfört med i vivo metoder av studien. Vi kan fint ställa många biokemiska och genetiska komponenter i en phage reaktion och direkt observera effekterna i mindre än 24 h, som visas i figur 4 för molekylär trängsel. Effekterna av molekylär crowders, såsom PEG, på den självmontering av makromolekylära komplex har varit teoretiskt beskrivs och visat in vitro-^18,19,20. Molekylär utträngning är en entropi driven mekanism som ökar konstanten association av stora Biomolekylär strukturer. Det cell-free tillvägagångssättet tillåter forskaren sond komplicerade biologiska processer som biofysisk självmontering med modellsystem, som bakteriofager, utan de inneboende begränsningarna i vivo arbete.

Denna plattform kan också för utredning av nyttan av Fager i tillämpad fält. Komponenter av phage genom kan repurposed och snabbt testas i ett cellfria reaktion system med målet att införliva resultaten till romanen nanostrukturer. Bakteriofager kan ändras för att öka selektiviteten i mottagande cell infektion, vilket skulle främja verktyget phage behandling som ett alternativ för antibiotikaresistenta bakterier.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ultracentrifugation tubes	Beckman Coulter	344057
Conical tubes	Falcon	352070
Gradient maker	BioComp Gradient Master	see Anal Biochem. 1985 Jul;148(1):254-9.
Syringe and Blunt Cannula	Monoject	8881513918 and 888202017
Wide-bore pipette tips	Fischerbrand	02-707-134
Plaque counter	New Brunswik Scientific	Colony Counter Model C-110
Culture tubes	Fischerbrand	14-961-33
Cell-free system	Mycroarray Inc	Mytxtl
BioComp Gradient Master	BioComp Instruments	Model 105ME
LB agar plate recipe			25 g/L Luria-Bertani medium (LB Broth, Miller - Fisher BioReagents product number BP1426) and 15 g/L Bacto-Agar solid (Brenton, Dickenson and Company - product number 214010).