Dette er en protokol til at efterligne Alzheimers sygdom hos rotter ved evaluering af rumlig hukommelse værdiforringelse, neuronal patologiske ændringer, neuronal amyloid beta protein (Aβ) byrde, og neurofibrillary tangles sammenlægning, fremkaldt ved injektion af Aβ25-35 kombineret omdanne vækst faktor-B1 med aluminium titantrichlorid og rekombinant human.
Alzheimers sygdom (AD) er en irreversibel, fremadskridende hjernesygdom, der langsomt ødelægger hukommelse og er ledsaget af neuron tab og struktur ændring. Med stigningen af annonce patienter på verdensplan, er patologi og behandling af sygdommen blevet et fokus i den internationale farmaceutiske industri. Etablering af dyremodel til at efterligne annonce i laboratoriet er således af stor betydning.
Her beskriver vi en detaljeret protokol for at etablere en efterligner annonce i en rotte dyr model selv intracerebroventricular injektion af amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) kombineret med aluminium titantrichlorid (AlCl3) og anterodorsal thalamic kerne injektion af rekombinant humant omdanne vækst faktor-B1 (RHTGF-B1) til rotter. Annonce relaterede markører blev målt, herunder: rumlig hukommelse, neuronal struktur og underkonstruktion, neuronal Aβ og neurofibrillary tangles (NFT) produktion. Denne rotte model viser rumlig hukommelse værdiforringelse, neuronal struktur og underkonstruktion patologiske ændringer, neuron intracellulære Aβ byrde og NFT sammenlægning, og giver en tæt efterligner af neuronal struktur og funktion uorden end klinisk AD patienter. Således, den præsenterede AD rotte modelprovides en værdifuld i vivo værktøj til at udforske neuronal funktion, neuronal patologi og stof screening af annonce.
Det er velkendt at annonce er en kronisk og fremadskridende neurodegenerativ sygdom med gradvis hukommelsestab som den vigtigste kliniske syndrom. I den generelle patologi er der nervøse væv atrofi, neuron og synapse tab samt neuronal subcellulært struktur og funktion lidelser, der alle er involveret i udviklingen og kliniske manifestation af annonce1,2. Det forlyder, at når dyrene blev intracerebroventricularly injiceret med Aβ, nogle neurotoksiske hændelser indtræffer i hjernen der involverer neuron tab, calcium homeostase forstyrrelser, neuron apoptose og reaktive ilt arter overproduktion3. Imidlertid flere faktorer er involveret i patogenesen af AD og det er derfor vigtigt at etablere en bedre model af annonce.
En detaljeret protokol er beskrevet her for at etablere en i vivo efterligne annonce model gennem intracerebroventricular injektion af Aβ25-35 og AlCl3, kombineret med anterodorsal thalamic kernen injektion af RHTGF-B1 til rotter. Denne rotte modelhighly efterligner human neuronal funktion og histopathogenesis af annonce, herunder hukommelse værdiforringelse, neuron tab og struktur skader, apoptose, intracellulære Aβ byrde og NFT sammenlægning4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 forhindrer, at den deponerede Aβ danner opløselige Aβ, og RHTGF-B1 kan fremme deponerede Aβ produktion og lette AD forekomst10. Dette angreb fra flere faktorer til neuron er i overensstemmelse med multi patogenesen af annonce.
Hele forsøget strakte sig over 86 dage: figur 1 viser en tidslinje over den eksperimentelle design, med tidspunkt dyr operation, dyremodel screening, animalsk rumlig hukommelsestest og forberedelse af prøver. På den første dag i drift, var RHTGF-B1 microinjected ind i anterodorsal thalamic kernen. På andendagen af operation, var Aβ25-35 og AlCl3 microinjected i den laterale ventrikel dagligt i 14 dage i træk om morgenen og 5 på hinanden følgende dage i eftermiddag, henholdsvis. Alle rotter fik lov til at inddrive for 45 dage efter operationen. Morris vand labyrint blev anvendt til at screene for vellykkede model rotter med hukommelse værdiforringelse og vurdere rats’ rumlig hukommelse. Rotter undergik 4 dage i træk af vand labyrint træning med 2 forsøg pr. dag, og på dag 4 af uddannelse, rotter blev vurderet med Morris vand labyrint ydeevne for hukommelse værdiforringelse. Alle rotter fortsatte med at blive fodret 37 dage efter dyremodel screening. Den rumlige hukommelse af rotter blev testet i Morris vand labyrint over 7 på hinanden følgende dage, fra dag 79 til dag 85 efter operationen. Alle rotter blev ofret ved halshugning på dag 86 for hjernen prøveforberedelse.
Figur 1. Tidslinje for den eksperimentelle design. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Det er velkendt, at tabet af indlæring og hukommelse er store kliniske symptomer i AD patienter2. Proceduren beskrevet her er en i vivo metode til at studere AD; Vi har tilpasset en tidligere udgivne protokol, der har afprøvet en medicin for at afhjælpe hukommelse underskud og neuronal skader i en rotte model4. Vores protokol giver vigtige oplysninger at få værdifulde data, samt en høj overlevelse af dyr, der med held model drift, hukommelse underskud, neuron skader, Aβ byrde og NFT deposition, at efterligne annonce (i den nuværende eksperiment, overlevelsesraten og vellykkede model sats på operation er mere end 90%). Disse vellykkede model rotter blev brugt til at måle deres rumlige hukommelse med Morris vand maze test. GPS navigation retssagen fandt, at den sammensat Aβ kan forårsage rotte hukommelse erhvervelse svækkelse; sonden forsøg konstateret, at den sammensat Aβ kan mindske rotte hukommelse opbevaring; og tilbageførsel forsøg fandt, at den sammensat Aβ kan resultere i rotte re-Learning værdiforringelse. Disse Morris vand maze testdata viser, at den sammensat Aβ kan fremkalde rotte rumlig hukommelse. Generelt, indsprøjtning rotter intracerebroventricularly med Aβ25-35 i kombination med AlCl3 og TGF-B1 lavet en gennemførlig og troværdig i vivo annonce-lignende dyremodel for laboratoriet.
Tidligere undersøgelser har vist, at hjernen volumen i AD patienter er 10% mindre end for raske personer. Forskellige hentærer kan findes i cerebral halvkugle ved visuel observation. Graden af kortikal atrofi er positivt relateret til hukommelse værdiforringelse19. I histologi forstyrrer det store antal af neuron tab og alvorlige morfologiske patologi direkte hukommelsesfunktion i AD patienter20. I den foreliggende undersøgelse fundet lys/elektron mikroskopisk observation, at rotterne microinjected med sammensat Aβ vises dramatiske neuropatologiske ændringer, herunder neuron tab og forstyrrelser af neuronal og subcellulært struktur. Dette resultat bekræfter den rotte rumlig hukommelse lidelse induceret af sammensat Aβ, og svarer til tilstanden af annonce patienter.
Det er velkendt, at hjernen Aβ byrde og NFT sammendragning behandles de vigtigste histopathogenic træk i Annoncen. De kan ødelægge neuronal struktur, forstyrrer de neurale signaler, forstyrre funktionen neuronal og resultere i fremskreden demens17. Den nuværende dyremodel fundet Aβ byrde og NFT sammenlægning i hjernen, som er enige med den annonce patienterne tilstand. Derfor, de nuværende neuron skader i rotter induceret af sammensat Aβ kan bruges som model til at studere neuronal patologi og behandlingsstrategi annonce.
Følgende er eksempler på screening narkotika effekter i annonce rotte modeller: Zhao et al.rapporterede, at begge flavonoider fra Scutellaria stængler og blade (SSF) og Scutellaria barbata (SBF) kan dæmpe rotte hukommelse værdiforringelse og apoptose induceret af sammensat Aβ8,9. Guo et al., også rapporteret at SBF kan hæmme NFT sammenlægning og tau protein over fosforylering på Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 og Thr231 side, og mindske GSK-3β, CDK5 og PKA protein og mRNA udtryk i sammensat Aβ-behandlede rotter21 . Samtidig, Shang et al., har også rapporteret at SBF kan undertrykke astrocyte og mikroglia spredning, og lavere Aβ1-40, Aβ1-42, og β-site APP når enzymet 1 (BACE1) mRNA udtryk i hjernen af sammensat Aβ rotter22. Baseret på de ovennævnte resultater, er vores dyremodel fordel over andre AD-lignende model, som indebærer flere neuronal funktion og struktur lidelse.
Hvad angår andre AD-lignende model, enkelt intracerebroventricular injektion af Aβ til rotter kan forårsage rotte hukommelse underskud, neuron tab og neurogliocyte spredning, men måske eller måske ikke har Aβ og NFT deposition23. Rotter udsat for høj dosis Al synes at have en høj succesrate, efterligner AD og en omkostningseffektiv dyremodel med hukommelse værdiforringelse, tab af neuron, neurogliocyte spredning, og senil plaque (SP) og NFT sammenlægning i hjernen. Men den høje dosis af Al kan forårsage rotte lever skader og anoreksi, ledsaget med nedsat vægt24. Alderen rotten er en anden annonce-lignende model. Alderen rotter viser hukommelse underskud, neuronal struktur/underkonstruktion patologiske ændringer, lipofuscin deposition, men uden Aβ byrde og NFT sammenlægning. Rotter i mere end 24 måneder anses alderen for denne model, og derfor det kræver en længere periode af fodring og dermed omkostningerne er højere17,25. SAMP8 og APP Transgene mus er den nærmeste efterligner annonce og de er den mest ideelle modeller for at undersøge annonce. Men begge dyremodeller prissættes højere og er begrænset til brug i laboratoriet26,27. Sammenlignet med de ovenstående dyremodeller, har vores model af sammensat Aβ-behandlede dyr model en lavere omkostninger og høj ydeevne, hvilket gør det et ideelt værktøj til at studere annonce.
Afslutningsvis intracerebroventricular injektion af Aβ25-35 kombineret med AlCl3 og TGF-B1 til rotter tilbyder en værdifuld i vivo dyr model for bedre at forstå den rumlige hukommelse værdiforringelse, neuronal skader, Aβ byrde og NFT deposition underliggende annonce. Denne model giver en hurtig og relativt enkle forsøgsplan med en høj dyr overleve sats og høj model vellykket sats på operation, samt en høj sats for overlapning, som viste for at være mere økonomisk. Den nuværende dyremodel er en effektiv model at efterligne annonce og kan yderligere validere sig selv ved at være brugt til at efterligne forskellige andre sygdomme.
The authors have nothing to disclose.
Projektet blev støttet af Hebei provinsen Natural Science Foundation (nr. C2009001007, H2014406048), Hebei provinsielle Administration af traditionel kinesisk medicin (nr. 05027), og centrale emne byggeprojekt Hebei Provincial College, Kina.
Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5 |
Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
Zinc phosphate dental cement | Dental Material of Factory Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. China | 201311 |