यह स्थानिक स्मृति हानि के मूल्यांकन के द्वारा चूहों में अल्जाइमर रोग की नकल करने के लिए एक प्रोटोकॉल है, ंयूरॉन रोग परिवर्तन, ंयूरॉन amyloid बीटा प्रोटीन (Aβ) बोझ, और neurofibrillary पेचीदा एकत्रीकरण, Aβ के इंजेक्शन द्वारा प्रेरित 25-35 संयुक्त एल्यूमीनियम trichloride और रिकॉमबिनेंट मानव बदलने के विकास के कारक-β1 के साथ ।
अल्जाइमर रोग (AD) एक अपरिवर्तनीय, प्रगतिशील दिमाग की बीमारी है कि धीरे से स्मृति को नष्ट कर देता है और ंयूरॉन हानि और संरचना परिवर्तन के साथ है । दुनिया भर में विज्ञापन रोगियों की वृद्धि के साथ, रोग की विकृति और उपचार अंतरराष्ट्रीय दवा उद्योग में एक ध्यान केंद्रित हो गया है । इस प्रकार, प्रयोगशाला में विज्ञापन की नकल करने के लिए पशु मॉडल की स्थापना बहुत महत्व का है ।
यहां, हम एक चूहे जानवर मॉडल में विज्ञापन की नकल हालांकि amyloid बीटा प्रोटीन 25-35 (aβ 25-35) एल्यूमिनियम trichloride (AlCl3) और anterodorsal thalamic नाभिक के साथ संयुक्त के intracerebroventricular इंजेक्शन की स्थापना के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन चूहों को रिकॉमबिनेंट मानव रूपांतरित विकास कारक-β1 (RHTGF-β1) का इंजेक्शन. विज्ञापन के संबंधित मार्करों सहित मापा, थे: स्थानिक स्मृति, ंयूरॉन संरचना और उपसंरचना, ंयूरॉन Aβ, और neurofibrillary पेचीदा (NFT) उत्पादन । इस चूहे मॉडल स्थानिक स्मृति हानि, ंयूरॉन संरचना और उपसंरचना रोग परिवर्तन, ंयूरॉन intracellular Aβ बोझ, और NFT एकत्रीकरण दर्शाता है, और एक बंद की नकल प्रदान करता है न्यूरॉन संरचना और नैदानिक के लिए कार्य विकार विज्ञापन रोगियों । इस प्रकार, प्रस्तुत विज्ञापन चूहे modelprovides ंयूरॉन समारोह, न्यूरॉन पैथोलॉजी, और विज्ञापन की दवा स्क्रीनिंग की खोज के लिए vivo उपकरण में एक मूल्यवान है ।
यह सर्वविदित है कि विज्ञापन एक पुरानी और प्रगतिशील neurodegenerative रोग है, मुख्य नैदानिक सिंड्रोम के रूप में क्रमिक स्मृति हानि के साथ । सामान्य विकृति में, वहाँ तंत्रिका ऊतक शोष, न्यूरॉन और synapse हानि, साथ ही साथ न्यूरॉनल सेलुलर संरचना और समारोह विकारों, जो सभी के विकास और नैदानिक अभिव्यक्ति में शामिल हैं1,2. यह सूचना दी है कि जब जानवरों Aβ के साथ इंजेक्शन intracerebroventricularly थे, कुछ neurotoxic घटनाओं ंयूरॉन नुकसान, कैल्शियम homeostasis व्यवधान, ंयूरॉन apoptosis, और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों के उत्पाद3शामिल मस्तिष्क में होते हैं । हालांकि, कई कारकों विज्ञापन के रोगजनन में शामिल है और इस तरह यह विज्ञापन का एक बेहतर मॉडल स्थापित करने के लिए आवश्यक है ।
एक विस्तृत प्रोटोकॉल यहां aβ 25-35 और AlCl3, के anterodorsal thalamic नाभिक इंजेक्शन के साथ संयुक्त के माध्यम से intracerebroventricular इंजेक्शन में एक vivo नकल विज्ञापन मॉडल की स्थापना के लिए वर्णित है RHTGF-β1 चूहों के लिए । इस चूहे modelhighly की नकल मानव न्यूरॉन समारोह और विज्ञापन की histopathogenesis, स्मृति हानि सहित, ंयूरॉन हानि और संरचना क्षति, apoptosis, intracellular Aβ बोझ, और NFT एकत्रीकरण4,5,6 , 7 , 8 , 9. AlCl3 जमा Aβ घुलनशील Aβ बनाने से रोकता है, और RHTGF-β1 जमा Aβ उत्पादन को बढ़ावा देने और विज्ञापन पुनरावृत्ति10की सुविधा कर सकते हैं । कई कारकों से इस हमले के ंयूरॉन के अनुसार है बहु रोगजनन विज्ञापन के ।
पूरे प्रयोग ८६ दिन फैले: चित्रा 1 पशु शल्य चिकित्सा, पशु मॉडल स्क्रीनिंग, पशु स्थानिक स्मृति परीक्षण, और नमूना तैयारी के समय बिंदु के साथ, प्रयोगात्मक डिजाइन की एक समयरेखा से पता चलता है । आपरेशन के पहले दिन, RHTGF-β1 anterodorsal thalamic नाभिक में microinjected था । आपरेशन के दूसरे दिन पर, aβ 25-35 और AlCl3 पार्श्व निलय दैनिक में सुबह में लगातार 14 दिनों और दोपहर में लगातार 5 दिनों के लिए microinjected थे, क्रमशः । सभी चूहों को ऑपरेशन के बाद ४५ दिनों के लिए ठीक करने की अनुमति दी गई. मॉरिस पानी भूलभुलैया स्मृति हानि के साथ सफल मॉडल चूहों के लिए स्क्रीन करने के लिए और चूहों स्थानिक स्मृति का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चूहों प्रति दिन 2 परीक्षणों के साथ पानी भूलभुलैया प्रशिक्षण के 4 लगातार दिन गुजरा, और प्रशिक्षण के 4 दिन पर, चूहों मॉरिस स्मृति हानि के लिए पानी भूलभुलैया प्रदर्शन के साथ मूल्यांकन किया गया । सभी चूहों को पशु मॉडल स्क्रीनिंग के ३७ दिन बाद खिलाया जाना जारी रहा । चूहों की स्थानिक स्मृति मॉरिस पानी भूलभुलैया में लगातार 7 दिनों में परीक्षण किया गया था, दिन ७९ से ८५ दिन के लिए आपरेशन के बाद । सभी चूहों decapitation द्वारा दिन ८६ पर मस्तिष्क नमूना तैयारी के लिए बलिदान किया गया ।
चित्र 1. प्रायोगिक डिजाइन की समयरेखा । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
यह सर्वविदित है कि सीखने और स्मृति की हानि विज्ञापन रोगियों में प्रमुख नैदानिक लक्षण है2। प्रक्रिया यहां वर्णित vivo में एक विज्ञापन का अध्ययन करने के लिए विधि है; हम एक पहले से प्रकाशित प्रोटोकॉल है कि एक दवा परीक्षण के लिए एक चूहा4मॉडल में स्मृति घाटे और न्यूरॉनिक चोटों को कम अनुकूलित किया है । हमारे प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण विवरण प्रदान करता है मूल्यवान डेटा प्राप्त करने के लिए, साथ ही पशुओं के एक उच्च जीवित रहने की दर है कि सफलतापूर्वक मॉडल आपरेशन, स्मृति घाटे, ंयूरॉन चोटों, Aβ बोझ, और NFT बयान, विज्ञापन नकल करने के लिए (वर्तमान प्रयोग में, जीवित रहने की दर और ऑपरेशन के सफल मॉडल दर से अधिक ९०%) । इन सफल मॉडल चूहों को मॉरिस जल भूलभुलैया परीक्षण के साथ अपने स्थानिक स्मृति उपाय किया गया । पोजिशनिंग नेविगेशन परीक्षण पाया गया कि मिश्रित Aβ चूहे स्मृति अधिग्रहण हानि पैदा कर सकता है; जांच परीक्षण में पाया गया कि कंपोजिट Aβ चूहा स्मृति प्रतिधारण कम कर सकते हैं; और उलटा परीक्षण में पाया गया कि कंपोजिट Aβ का परिणाम चूहे फिर से सीखने में ख़राब कर सकते हैं । इन मॉरिस पानी भूलभुलैया परीक्षण डेटा बताते है कि मिश्रित Aβ चूहा स्थानिक स्मृति पैदा कर सकता है । कुल मिलाकर, AlCl3 और TGF-β1 के साथ संयोजन में aβ 25-35 के साथ चूहों intracerebroventricularly इंजेक्शन प्रयोगशाला के लिए vivo विज्ञापन की तरह पशु मॉडल में एक व्यवहार्य और विश्वसनीय बनाया ।
पिछले अध्ययनों से पता चला है कि विज्ञापन रोगियों में मस्तिष्क की मात्रा 10% स्वस्थ व्यक्तियों की तुलना में कम है । विभिन्न atrophies दृश्य अवलोकन द्वारा मस्तिष्क गोलार्द्ध में पाया जा सकता है । cortical शोष की डिग्री सकारात्मक स्मृति हानि19से संबंधित है । प्रोटोकॉल में, बड़ी संख्या में ंयूरॉन हानि और गंभीर रूपात्मक विकृति सीधे परेशान विज्ञापन रोगियों में स्मृति समारोह20। वर्तमान अध्ययन में, प्रकाश/इलेक्ट्रॉन सूक्ष्म अवलोकन पाया गया कि मिश्रित Aβ के साथ चूहों microinjected नाटकीय neuropathological परिवर्तन प्रदर्शित, ंयूरॉन नुकसान सहित, और न्यूरॉन और उपसेलुलर संरचना व्यवधान. यह परिणाम चूहे स्थानिक स्मृति मिश्रित Aβ द्वारा प्रेरित विकार corroborates, और विज्ञापन रोगियों की स्थिति के समान है ।
यह सर्वविदित है कि मस्तिष्क Aβ बोझ और NFT एकत्रीकरण विज्ञापन में सबसे महत्वपूर्ण histopathogenic लक्षण माना जाता है । वे न्यूरॉनिक संरचना को नष्ट कर सकते हैं, तंत्रिका संकेतन परेशान, न्यूरॉन समारोह को बाधित, और उन्नत मनोभ्रंश17में परिणाम. वर्तमान पशु मॉडल मस्तिष्क में Aβ बोझ और NFT एकत्रीकरण पाया, जो विज्ञापन रोगी राज्य के साथ सहमत हैं । इसलिए, समग्र Aβ द्वारा प्रेरित चूहों में मौजूद न्यूरॉन चोटों के लिए एक मॉडल के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है न्यूरॉन विकृति और विज्ञापन के उपचार रणनीति का अध्ययन.
निंनलिखित विज्ञापन चूहा मॉडल में दवा प्रभाव स्क्रीनिंग के उदाहरण हैं: Zhao एट अल, ने बताया कि दोनों Scutellaria उपजी और पत्तियों (SSF) और Scutellaria बरबटा (SBF) से flavonoids चूहे स्मृति हानि और apoptosis प्रेरित क्षीणन कर सकते है कंपोजिट Aβ8,9. गुओ एट अल., यह भी बताया कि SBF Ser199, Ser214, Ser202, Ser404, और Thr231 पक्ष में NFT एकत्रीकरण और ताऊ प्रोटीन पर फास्फारिलीकरण को बाधित कर सकते हैं, और जीएसके-3β, CDK5, और PKA प्रोटीन और समग्र mRNA में Aβ अभिव्यक्ति की कमी-इलाज चूहों21 . इसके साथ ही, शांग एट अल., भी बताया है कि SBF astrocyte और microglia प्रसार को दबा सकते हैं, और कम Aβ 1-40, Aβ 1-42, और β-साइट APP सट एंजाइम 1 (BACE1) mRNA के मस्तिष्क में अभिव्यक्ति के मिश्रित Aβ चूहों22. उपरोक्त परिणामों के आधार पर, हमारे पशु मॉडल अन्य विज्ञापन की तरह मॉडल है, जो अधिक न्यूरॉन समारोह और संरचना विकार शामिल पर लाभप्रद है.
अंय विज्ञापन की तरह मॉडल, चूहों को Aβ के एकल intracerebroventricular इंजेक्शन के विषय में चूहे स्मृति घाटे, ंयूरॉन हानि, और neurogliocyte प्रसार पैदा कर सकता है, लेकिन हो सकता है या नहीं Aβ और NFT23साठा हो सकता है । उच्च खुराक अल करने के लिए उजागर चूहों एक उच्च सफलता दर के लिए दिखाई देते हैं, विज्ञापन नकल, और एक लागत प्रभावी पशु मॉडल, स्मृति हानि के साथ, ंयूरॉन हानि, neurogliocyte प्रसार, और बूढ़ा पट्टिका (सपा) और मस्तिष्क में NFT एकत्रीकरण । हालांकि, अल की उच्च खुराक चूहे जिगर चोटों और आहार का कारण हो सकता है, कम वजन24के साथ साथ । वृद्ध चूहे एक और विज्ञापन की तरह मॉडल है । वृद्ध चूहों स्मृति घाटे, न्यूरॉन संरचना/उपसंरचना रोग परिवर्तन, lipofuscin जमाव, लेकिन Aβ बोझ और NFT एकत्रीकरण के बिना प्रदर्शित करता है । अधिक से अधिक 24 महीने की उंर के चूहों इस मॉडल के लिए वृद्ध माना जाता है, और इसलिए यह खिला की एक लंबी अवधि की आवश्यकता है और इस तरह लागत उच्च17,25है । SAMP8 और APP ट्रांसजेनिक चूहों के निकटतम विज्ञापन के लिए नकल कर रहे हैं और वे विज्ञापन की जांच के लिए सबसे आदर्श मॉडल हैं. लेकिन दोनों पशु मॉडल उच्च कीमत और26,27प्रयोगशाला में उपयोग करने के लिए सीमित कर रहे हैं । इसके बाद के संस्करण पशु मॉडल के साथ तुलना में, समग्र Aβ इलाज पशु मॉडल के हमारे मॉडल एक कम लागत और उच्च प्रदर्शन है, यह विज्ञापन के अध्ययन के लिए एक आदर्श उपकरण बना रही है ।
अंत में, Aβ 25-35 AlCl3 और TGF-चूहों को β1 के साथ संयुक्त के intracerebroventricular इंजेक्शन vivo पशु मॉडल में एक मूल्यवान बेहतर स्थानिक स्मृति हानि को समझने के लिए प्रदान करता है, न्यूरॉन चोटों, Aβ बोझ, और NFT जमाव अंतर्निहित विज्ञापन । यह मॉडल एक उच्च पशु जीवित रहने की दर और उच्च मॉडल आपरेशन के सफल दर के साथ एक तेजी से और अपेक्षाकृत सरल प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल प्रदान करता है, साथ ही साथ दोहराव की एक उच्च दर है, जो और अधिक आर्थिक हो दिखाया । वर्तमान पशु मॉडल विज्ञापन नकल करने के लिए एक प्रभावी मॉडल है और आगे ही विभिन्न अन्य रोगों की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा द्वारा मान्य कर सकते हैं ।
The authors have nothing to disclose.
इस परियोजना का समर्थन हेबै प्रांतीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (सं. C2009001007, H2014406048), हेबै पारंपरिक चीनी चिकित्सा के प्रांतीय प्रशासन (No. ०५०२७), और हेबै प्रांतीय कॉलेज, चीन के प्रमुख विषय निर्माण परियोजना ।
Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5 |
Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
Zinc phosphate dental cement | Dental Material of Factory Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. China | 201311 |