Dette er en protokoll for å etterligne Alzheimers sykdom i rotter ved evaluering av romlige hukommelse verdifall, neuronal patologiske forandringer, neuronal amyloid beta protein (Aβ) byrden, og neurofibrillary ledninger aggregering, indusert av injeksjon av Aβ25-35 kombinert med aluminium trichloride og rekombinant humant omforming vekst faktor-β1.
Alzheimers sykdom (AD) er en uhelbredelig, progressive hjernesykdom som sakte ødelegger minne og ledsages av Nevron tap og strukturen endringen. Med økningen av AD pasienter over hele verden blitt patologi og behandling av sykdommen fokus i den internasjonale farmasøytiske industrien. Dermed er etableringen av dyr modellen å etterligne annonse i laboratoriet av stor betydning.
Her beskriver vi en detaljert protokoll for å etablere en etterligne annonse inne en rotten dyr modell om intracerebroventricular injeksjon av amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) kombinert med aluminium trichloride (AlCl3) og anterodorsal thalamic kjernen injeksjon av rekombinant humant omforming vekst faktor-β1 (RHTGF-β1) rotter. Relaterte markører annonsen ble målt, inkludert: romlige hukommelse, neuronal struktur og underlaget, neuronal Aβ og neurofibrillary ledninger (NFT) produksjon. Denne rotte modell demonstrerer romlig minne verdifall, neuronal struktur og underlaget patologiske forandringer, Nevron intracellulær Aβ byrden og NFT aggregering, og gir en tett etterligne av neuronal struktur og funksjon uorden som i klinisk AD pasienter. Dermed den presentert AD rotte modelprovides en verdifull i vivo -verktøy for å utforske neuronal funksjonen neuronal patologi og narkotikarelaterte screening av Annonsen.
Det er velkjent at Annonsen er en kronisk og progressiv nevrodegenerative sykdommer, med gradvis hukommelsestap som det viktigste klinisk syndromet. I den generelle patologien finnes det nervøse vev atrofi, Nevron og synapse tap, samt neuronal subcellular struktur og funksjon lidelser, som er alle involvert i utvikling og klinisk manifestasjon av AD1,2. Det er rapportert at når dyr var intracerebroventricularly injisert med Aβ, noen nevrotoksiske hendelser oppstår i hjernen som involverer Nevron tap, kalsium homeostase avbrudd, Nevron apoptose og reaktive oksygen arter overproduksjon3. Imidlertid flere faktorer er involvert i patogenesen av Annonsen og dermed er det viktig å etablere en bedre modell av Annonsen.
En detaljert protokoll beskrives her for å etablere en i vivo etterligne AD modellen gjennom intracerebroventricular injeksjon av Aβ25-35 og AlCl3, kombinert med anterodorsal thalamic kjernen injeksjon av RHTGF-β1 rotter. Dette rotten modelhighly etterligner menneskelige neuronal funksjon og histopathogenesis annonse, inkludert minne verdifall, Nevron tap og struktur skade, apoptose, intracellulær Aβ byrden og NFT aggregering4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 forhindrer det avsatt Aβ dannes løselig Aβ og RHTGF-β1 kan fremme avsatt Aβ produksjon og tilrettelegge AD forekomst10. Dette angrepet fra flere faktorer til Nevron er flere patogenesen av Annonsen.
Hele eksperimentet spredte 86 dager: figur 1 viser en tidslinje av eksperimentell design, med tidspunktet dyr kirurgi, dyremodell screening, dyr romlig minnetest og prøve forberedelse. På den første dagen i operasjonen, ble RHTGF-β1 microinjected i anterodorsal thalamic kjernen. På den andre dagen av drift, var Aβ25-35 og AlCl3 microinjected i laterale ventrikkel daglig for 14 sammenhengende dager i morgen og 5 dager på ettermiddagen, henholdsvis. Alle rotter kunne komme i 45 dager etter operasjonen. Morris vann labyrinten ble brukt til skjermen for vellykkede modellen rotter med minne svekkelse og å vurdere rotter romlig minne. Rotter gjennomgikk 4 dager med vann labyrint med 2 forsøk per dag, og på dag 4 av trening, rotter ble evaluert med Morris vann labyrint ytelse for minne verdifall. Alle rotter fortsatte å bli matet 37 dager etter dyremodell screening. Romlig minne rottene ble testet i Morris vann labyrinten 7 påfølgende dager, fra daglige 79 85 etter operasjonen. Alle rotter ble ofret ved halshogging dag 86 for hjernen eksempel forberedelse.
Figur 1. Tidslinje av eksperimentell design. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Det er velkjent at tapet av læring og hukommelse er store kliniske symptomer i AD pasienter2. Fremgangsmåten som er beskrevet her er en i vivo metode å studere annonse; Vi har tilpasset en tidligere publiserte protokoll som testet medisiner for å lindre minne underskudd og neuronal skader i en rotte modell4. Våre protokollen gir viktige detaljer å få verdifulle data, samt en høy overlevelse av dyr som vellykket modell operasjon, minne underskudd, Nevron skader, Aβ byrden og NFT deponering, å etterligne AD (i nåværende forsøket, overlevelse og vellykkede modellen frekvens operasjon er mer enn 90%). Disse vellykkede modellen rotter ble brukt til å måle deres romlige hukommelse med Morris vann labyrint test. Posisjonering navigasjon rettssaken fant at composited Aβ kan forårsake rotte minne oppkjøpet verdifall; prøveversjon av sonden funnet at composited Aβ kan redusere rotte minne bevaring; og tilbakeføring av prøve funnet at composited Aβ kan resultere i rotte re-læring verdifall. Disse Morris vann labyrint testdata viser at den composited Aβ kan indusere rotte romlig minne. Total, injisere rotter intracerebroventricularly med Aβ25-35 i kombinasjon med AlCl3 og TGF-β1 opprettet en mulig og troverdig i vivo AD-lignende dyr modell for laboratoriet.
Tidligere studier har vist at hjernen volumet i AD pasienter er 10% mindre enn friske individer. Ulike atrofier finnes i cerebral halvkulen av visuell observasjon. Graden av kortikale atrofi er positivt knyttet til minne verdifall19. I histology forstyrre det store antallet Nevron tap og alvorlig morfologiske patologi direkte funksjonen minne i AD pasienter20. I studien fant lys/electron mikroskopiske observasjon at rottene microinjected med composited Aβ vises dramatiske neuropathological endringer, inkludert Nevron tap og neuronal og subcellular avbrudd. Dette resultatet bekrefter rotte romlig minne uorden av composited Aβ, og er lik i delstaten AD pasienter.
Det er velkjent at hjernen Aβ byrden og NFT aggregering anses som de viktigste histopathogenic trekkene i Annonsen. De kan ødelegge neuronal strukturen, forstyrre nevrale signalene, forstyrre funksjonen neuronal og føre til avanserte demens17. Den nåværende dyremodell fant Aβ byrden og NFT aggregering i hjernen, som er enig med AD pasienten staten. Derfor kan nåværende Nevron skader i rotter indusert av composited Aβ brukes som modell neuronal patologi og behandling strategi annonse.
Følgende er eksempler på screening narkotika effekter i AD rotte modeller: Zhao et al., rapporterte at begge flavonoider fra Scutellaria stengler og blader (SSF) og Scutellaria barbata (SBF) kan attenuere rotte minne verdifall og apoptose indusert av composited Aβ8,9. Guo et al., rapporterte også at SBF kan hemme NFT aggregering og tau protein over fosforylering i Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 og Thr231 side, og redusere GSK-3β, CDK5 og PKA protein og mRNA uttrykk i composited Aβ-behandlet rotter21 . Samtidig, Shang et al., har også rapportert at SBF kan undertrykke astrocytter og microglia spredning, og lavere Aβ1-40, Aβ1-42, og β-site APP cleaving enzym 1 (BACE1) mRNA uttrykket i hjernen composited Aβ rotter22. Basert på ovennevnte resultatene, er våre dyremodell en fordel over andre AD-lignende modell, som involverer flere neuronal funksjon og struktur lidelse.
Om andre AD-lignende modell, enkelt intracerebroventricular injeksjon av Aβ rotter kan forårsake rotte minne underskudd, Nevron tap og neurogliocyte spredning, men kan eller kan ikke ha Aβ og NFT deponering23. Rotter utsatt for høy dose Al synes å ha en høy suksessrate, etterligne annonse og en kostnadseffektiv dyremodell, med minne verdifall, Nevron tap, neurogliocyte spredning, og senil plakk (SP) og NFT aggregering i hjernen. Men den høye dosen av Al kan forårsake rotte lever skader og anoreksi, sammen med redusert vekt24. Alderen rotta er en AD-lignende modell. Alderen rotter viser minne underskudd, neuronal struktur/underkonstruksjonen patologiske forandringer, lipofuscin avsetning, men uten Aβ belastning og NFT aggregering. Rotter av mer enn 24 måneders alder anses alderen for denne modellen, og derfor krever lengre fôring og dermed kostnadene er høyere17,25. De er mest ideelle modeller for å undersøke AD SAMP8 og APP transgene mus er den nærmeste etterligne annonsen. Men begge dyremodeller er høyere priset og er begrenset til bruk i laboratoriet26,27. Sammenlignet med modellene ovenfor dyr, har vår modell av composited Aβ-behandlede dyr modellen en lavere pris og høy ytelse, noe som gjør det til et ideelt verktøy for å studere AD.
Avslutningsvis intracerebroventricular injeksjon av Aβ25-35 kombinert med AlCl3 og TGF-β1 rotter gir en verdifull i vivo dyr modell for å forstå den romlige hukommelse verdifall, neuronal skader, Aβ byrden og NFT avsetning underliggende annonse. Denne modellen gir en rask og relativt enkle eksperimentelle protokoll med en høy dyr overleve hastighet og høy modell vellykket rate drift, samt en høy grad av duplisering, som viste seg for å være mer økonomisk. Den nåværende dyremodell er en effektiv modell å etterligne AD og videre kan validere selv ved brukes til å etterligne ulike andre sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
Prosjektet ble støttet av Hebei provinsielle Natural Science Foundation (nr. C2009001007, H2014406048), Hebei provinsielle administrasjonen av tradisjonell kinesisk medisin (nr. 05027) og viktige emnet byggeprosjektet Hebei Provincial College, Kina.
Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5 |
Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
Zinc phosphate dental cement | Dental Material of Factory Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. China | 201311 |