Detta är ett protokoll för att härma Alzheimers sjukdom hos råttor genom utvärdering av rumsliga minnesförsämring, neuronala patologiska förändringar, neuronala beta-amyloid protein (Aβ) börda, och fibrillnystan aggregering, inducerad genom injektion av Aβ25-35 i kombination med aluminium klorid och rekombinant humant omvandla tillväxtfaktor-β1.
Alzheimers sjukdom (AD) är en oåterkallelig, progressiv hjärnsjukdom som sakta förstör minne och åtföljs av neuron förlust och struktur. Med ökningen av AD patienter världen över blivit av patologi och behandling av sjukdomen fokus i den internationella läkemedelsindustrin. Således, inrättandet av den djurmodell att efterlikna AD i laboratoriet är av stor betydelse.
Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för att skapa en härma av AD i en råtta djur modell men intracerebroventricular injektion av amyloid beta protein 25-35 (Aβ25-35) kombinerat med aluminium klorid (AlCl3) och anterodorsal thalamic nucleus injektion av rekombinant humant omvandla tillväxtfaktor-β1 (RHTGF-β1) till råttor. De relaterade markörerna för AD mättes, inklusive: rumsliga minne, neuronala struktur och underkonstruktion, neuronala Aβ och neurofibrillära trassel (NFT) produktion. Denna råtta modell visar nedsatt rumsliga minne, neuronala struktur och underkonstruktion patologiska förändringar, neuron intracellulära Aβ börda och NFT aggregering, och ger en nära härma av neuronala struktur och funktion sjukdomen med kliniska AD patienter. Således, den presenterade AD råtta modelprovides en värdefull i vivo -verktyg för att utforska nervcellernas funktion, neuronala patologi och drogkontroll av AD.
Det är väl känt att AD är en kronisk och progressiv neurodegenerativ sjukdom, med gradvis minnesförlust som huvudsakliga kliniska syndrom. I allmän patologi finns det nervös vävnadsatrofi, neuron och synapsen förlust, samt neuronala subcellulär struktur och funktion störningar, som är alla involverade i utveckling och klinisk manifestation av AD1,2. Det har rapporterats att när djuren var intracerebroventricularly injiceras med Aβ, vissa neurotoxiska händelser inträffar i hjärnan som involverar neuron förlust, kalcium homeostasen avbrott, neuron apoptos och reaktivt syre arter överproduktion3. Men flera faktorer är inblandade i patogenesen av AD och således är det nödvändigt att upprätta en bättre modell av AD.
Ett detaljerat protokoll beskrivs här för att upprätta en i vivo härma annons modell genom intracerebroventricular injektion av Aβ25-35 och AlCl3, kombinerat med anterodorsal thalamic nucleus injektion av RHTGF-β1 till råttor. Denna råtta modelhighly härmar mänskliga nervcellernas funktion och histopathogenesis av annonsen, inklusive nedsatt minne, neuron förlust och struktur skador, apoptos, intracellulära Aβ börda och NFT aggregering4,5,6 , 7 , 8 , 9. the AlCl3 förhindrar att den deponerade Aβ bildar lösliga Aβ, och den RHTGF-β1 kan främja deponerade Aβ produktion och underlätta AD förekomst10. Denna attack från flera faktorer till neuron är enligt flera patogenesen av AD.
Hela experimentet spännas 86 dagar: figur 1 visar en tidslinje av experimentell design, med tiden peka av djur kirurgi, djurmodell screening, djur rumsliga minnestest och provberedning. Den första dagen i drift, var RHTGF-β1 microinjected in i anterodorsal thalamic cellkärnan. Den andra dagen av operation, var Aβ25-35 och AlCl3 microinjected i den laterala ventrikeln dagligen för 14 dagar på morgonen och 5 dagar på eftermiddagen, respektive. Alla råttor tilläts att återvinna för 45 dagar efter operationen. Morris vatten labyrinten användes till skärmen för framgångsrika modell råttor med nedsatt minne och att bedöma råttornas rumsliga minne. Råttorna genomgick 4 dagar av vatten labyrint utbildning med 2 prövningar per dag, och på dag 4 av utbildning, råttorna utvärderades med Morris vatten labyrint prestanda för försämrat minne. Alla råttor fortsatte att matas 37 dagar efter djurmodell screening. Det rumsliga minnet av råttor testades i Morris vatten labyrinten över 7 på varandra följande dagar, dag 79 till dag 85 efter operationen. Alla råttor offrades genom halshuggning på dag 86 för hjärnan provberedning.
Figur 1. Tidslinje av experimentell design. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Det är väl känt att förlusten av inlärning och minne är stora kliniska symptom i AD patienter2. Proceduren som beskrivs här är ett in-vivo -Metod för att studera AD; Vi har anpassat ett tidigare publicerade protokoll som testat en medicin för att lindra minne underskott och neuronala skador i en råtta modell4. Våra protokoll ger viktiga detaljer att erhålla värdefulla data, samt en hög överlevnad av djur som framgångsrikt modell drift, minne underskott, neuron skador, Aβ börda och NFT nedfall, att efterlikna AD (i nuvarande experimentet, överlevnaden ”och framgångsrika modell drift är mer än 90%). Dessa framgångsrika modell råttor användes för att mäta deras rumsliga minne med Morris vatten labyrint test. Den positionering navigering-Studien fann att den blandats Aβ kan orsaka råtta minnesförsämring förvärv; sonden rättegången fann att den blandats Aβ kan minska råtta minne lagring; och återföring rättegång fann att den blandats Aβ kan resultera i råtta re inlärning leverfunktion. Dessa Morris vatten labyrint testdata visar att den blandats Aβ kan inducera råtta rumsliga minne. Sammantaget skapade injicera råttor intracerebroventricularly med Aβ25-35 i kombination med AlCl3 och TGF-β1 en genomförbar och trovärdig i vivo AD-liknande djurmodell för laboratoriet.
Tidigare studier har visat att hjärnvolymen hos AD-patienter är 10% mindre än för friska individer. Olika förtvinar kan hittas i hjärnhalva genom visuell observation. Graden av kortikal atrofi är positivt relaterat till minne nedskrivningar19. I histologin stör det stora antalet neuron förlust och svår morfologisk patologi direkt Minnesfunktionen i AD patienter20. I den aktuella studien hittade ljus/elektron mikroskopisk observation att råttorna microinjected med blandats Aβ visas dramatiska neuropatologiska förändringar, inklusive förlust av neuron och neuronala och subcellulär struktur störningar. Detta resultat bekräftar råtta rumsliga minne sjukdomen framkallas av blandats Aβ och liknar tillståndet i AD patienter.
Det är väl känt att hjärnan Aβ bördan och NFT aggregering anses den viktigaste histopathogenic dragen i AD. De kan förstöra den neuronala strukturen, störa den neurala signalering, störa nervcellernas funktion och resultera i avancerad demens17. Den nuvarande djurmodell hittade Aβ börda och NFT aggregation i hjärnan, som håller med AD patienten staten. Därför kan de nuvarande neuron skadorna hos råttor inducerade av blandats Aβ användas som en modell för att studera neuronala patologi och behandlingsstrategi av AD.
Följande är exempel på screening läkemedelseffekter i AD råtta modeller: Zhao et al., rapporterade att båda flavonoider från Scutellaria stjälkar och blad (SSF) och Scutellaria barbata (SBF) kan dämpa råtta minnesförsämring och apoptos induceras av blandats Aβ8,9. Guo et al., rapporterade också att SBF kan hämma NFT aggregering och tau protein över fosforylering vid Ser199, Ser214, Ser202, Ser404 och Thr231 sida, och minskar GSK-3β, CDK5 och PKA protein och mRNA uttryck i blandats Aβ-behandlade råttor21 . Samtidigt, Shang et al., har också rapporterat att SBF kan undertrycka de Astrocyten och mikroglia spridning, och lägre Aβ1-40, Aβ1-42, och β-site APP klyva enzym 1 (BACE1) mRNA uttryck i hjärnan av blandats Aβ råttor22. Baserat på ovanstående resultat, är vår djurmodell en fördel över andra AD-liknande modell, som innebär mer nervcellernas funktion och struktur sjukdom.
När det gäller andra AD-liknande modell, enda intracerebroventricular injektion av Aβ till råttor kan orsaka råtta minne underskott, neuron förlust och neurogliocyte spridning, men kan eller kan inte ha Aβ och NFT nedfall23. Råttor som utsätts för hög dos Al verkar ha en hög framgång, härma AD och en kostnadseffektiv djurmodell, med försämrat minne, neuron förlust, neurogliocyte spridning, och senila plack (SP) och NFT aggregering i hjärnan. Men den höga dosen av Al kan orsaka råtta lever skador och anorexi, tillsammans med minskade vikt24. År råtta är en annan AD-liknande modell. År råttorna visar minne underskott, neuronala struktur/underkonstruktion patologiska förändringar, lipofuscin nedfall, men utan Aβ börda och NFT aggregering. Råttor i mer än 24 månader anses åldern för denna modell, och därför kräver en längre period av utfodring och därmed kostnaden är högre17,25. SAMP8 och APP transgena möss är den närmaste härma till AD och de är de mest perfekta modeller för att utreda AD. Men både djurmodeller prissätts högre och är begränsat till användning i laboratorium26,27. Vår modell av blandats Aβ-behandlade djurmodell jämfört med de ovan djurmodeller, och har en lägre kostnad och hög prestanda, vilket gör det ett idealiskt verktyg för att studera AD.
Avslutningsvis intracerebroventricular injektion av Aβ25-35 kombinerat med AlCl3 och TGF-β1 till råttor ger en värdefull i vivo djurmodell för att bättre förstå den rumsliga minnesförsämring, neuronala skador, Aβ börda och NFT nedfall underliggande AD. Denna modell ger en snabb och relativt enkla experimentella protokoll med en hög djur överleva hastighet och hög modell framgångsrika andelen drift, samt en hög frekvens av dubbelarbete, vilket visade sig vara mer ekonomisk. Den nuvarande djurmodell är en effektiv modell för att efterlikna AD och kan ytterligare validera sig av som används för att efterlikna olika andra sjukdomar.
The authors have nothing to disclose.
Projektet stöddes av Hebei provinsiella naturvetenskap Foundation (nr. C2009001007, H2014406048), Hebei provinsiella administrationen av traditionell kinesisk medicin (nr 05027) och det viktiga ämne byggprojektet Hebei Provincial College, Kina.
Sprague-Dawley rat | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd, China | SCXK(Jing) 2012-0001 | 300–350 g |
Morris water maze | Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical Research Institute, China | No | |
Movable small animal anesthesi | RWD Life Science Co., Ltd. China | R580 | |
Brain Stereotaxic Apparatus | RWD Life Science Co., Ltd. China | 68001 | |
Flexible bone drill | Shanghai Soft Long Technology Development Co., Ltd. China | BW-sD908 | |
Transmission electron microscope | Japan Co., Ltd. Japan | JEM-1400 | |
Two channel microinjection pump | RWD Life Science Co., Ltd. China | RWD202 | |
EM microtome | Hitachi Co., Ltd. China | H-7650 | |
Dummy cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62001 | 0.D.0.64×I.D.0.0.45mm/M3.5 http://www.rwdls.com/English/Product/3985102014.html |
Guide cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62101 | 0.D.0.40mm/M3.5 |
Internal cannula | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62201 | 0.D.0.41×I.D.0.25mm/M3.5 |
Tighten the nut | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62501 | 0.D.5.5mm/L7.5mm/M3.5 |
Fixing screw | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62514 | M1.2×L2.0mm(100BAO) |
The screwdriver | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62999 | 45*1mm |
PE Tubing | RWD Life Science Co., Ltd. China | 62302 | |
Amyloid beta 25-35 | Sigma Aldrich Co. USA | SCP0002-5MG | |
Recombinant human transforming growth factor-β1 | PeproTech Inc. USA | 100-21 | |
Aluminium trichloride | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3011080 | |
Congo red | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd. China | 3010016 | |
Silver nitrate | Sinopharm Chcmical Reagent Co., Ltd. China | 20150720 | |
Zinc phosphate dental cement | Dental Material of Factory Shanghai Medical Instruments Co., Ltd. China | 201311 |