Summary
Пьезоэлектрический операция привела к повышению в человека стоматологических и челюстно-лицевой хирургии. Мы разработали протокол для оптимизации пьезоэлектрический хирургии для окно черепной хирургии в мышей.
Abstract
Multiphoton микроскопии широко адаптирована для визуализации нейронов в естественных условиях. Повторяющихся изображений требует имплантации черепной окна или неоднократные истончение черепа. Черепной окно операции обычно выполняется с высокой скорости поворотного дрель, и многих детективов найти его сложно предотвратить дрель от повреждения тонкий Дура и кровеносных сосудов. Интенсивное обучение и практика необходима для удаления кости без ущерба для основной ткани и таким образом окно черепной хирургии может быть сложным, трудоемким и производят повреждение тканей. Пьезоэлектрический хирургии, который широко используется для стоматологических и челюстно-лицевой хирургии, использует ультразвуковых колебаний для удаления кости без повреждения мягких тканей. Мы разработали метод применения пьезоэлектрический хирургии для улучшения черепной окна хирургии в мышах в рамках подготовки к multiphoton изображений. Сравнение в нашей лаборатории найти метод требует меньше времени, хирургии и имеет более низкий средний уровень осложнений дурального кровотечения, чем окно черепной хирургии с Ротари бур.
Introduction
Черепной окно хирургии для подготовки грызунов multiphoton изображений в естественных условиях стала важным методом в неврологии. Удаление или истончение костей необходимо подготовить мышь для оптических изображений с микроскопом multiphoton. Эта операция производится полное удаление области кости для предоставления базовой Дура1или истончение региона кости без полного удаления из Дура2. Тонкий череп подход может производить меньше воспаления и активации микроглии3 но обеспечивает глубины резкости изображений, меньший размер окна изображения (200 мкм) и ограниченного периода времени в течение которого окно можно образы из-за кости отрастания2 . Добавление полированной и армированного стекла окна (порты) может увеличить размер изображений и изображений период, но трудно выполнить4.
Обе текущих операций использовать высокая скорость Ротари бур для тонких или удалить кости черепа. Техника тонкого череп также использует скальпель после упражнения для дальнейшего тонкая кость2. Порты техника требует дополнительный шаг высокой скорости, полировки с зернистостью4. В высокой скорости Ротари дрель, турбины воздуха питание или электродвигатель приводит сверло для спина на высокой скорости. Как Ротари сверла раздел костей и мягких тканей, существует риск повреждения Дура и кровеносных сосудов. Успех операции зависит от мастерства хирурга. Помимо этих окон, подготовленных с механическим хирургические методы химический метод оптически очистки черепа с различными решениями был развитых5,6. Однако поскольку пьезоэлектрический хирургии является механический метод хирургии, наши сравнения здесь будет ограничена другими механическими методами.
Пьезоэлектрический хирургические приборы используют ультразвуковой вибрации, чтобы сломать минерализованных кости без повреждения основной мягких тканей и таким образом предлагают подход быстро тонких большой площади кости. В пьезоэлектрической хирургические наконечника турбина заменяется на стек керамических дисков и вибрировать когда тока применяется, диски на ультразвуковых частотах. Колебания передаются через наконечник алмазов с покрытием советы, чтобы прорваться через кости без повреждения мягких тканей, преимущество над Ротари упражнения, которые не делают различий между типами ткани. Пьезоэлектрический хирургии был первоначально разработан для использования в человека Tomaso Vercellotti и привело к улучшениям в стоматологии и черепно максилофациальной хирургии7,8,9,10,11 .
Пьезоэлектрический хирургии был использован для создания остеотомия в крыс Вистара и был найден, магнитно-резонансная томография (МРТ) и гистология производить значительно меньший ущерб, чем традиционной стоматологической дрель12. Авторы пришли к выводу, что пьезоэлектрические хирургии было безопасно для удаления кости вблизи мягкой мозговой ткани. Мышей, однако, тоньше Дура, которая повреждена более легко, и что исследования не подготовка windows к хронической оптических изображений. Хронический изображений требует, чтобы сосуды не повреждены и что под окном не образуют сгустки крови. Повреждение Дура приводит к воспаление, которое вызывает окно в облаке, и активирует Микроглия и распространение реактивной астроциты. Здесь мы оптимизировали пьезоэлектрический хирургии для мышей для создания тонкой череп и кости полное удаление черепной windows подходит для хронических изображений. Мы сравнили этой хирургической техники черепной окно операций подготовлен с высокой скорости поворотного дрель.
Protocol
Все процедуры, которые были проведены с участием животных согласно стандартам установленным Колумбийского университета медицинский центр институциональных животное уход и использование Комитет (IACUC). Эвтаназия была выполнена через шейки матки дислокации под наркозом с кетамина 100 мг/кг и ксилазина 10 мг/кг внутрибрюшинно вводили. Все хирургические процедуры выполнялись на основе стерильной (хирург был одет голову шапку, маска, стерильные перчатки и чистые одноразовые лаборатории пальто) и хирургические инструменты были газобетона между каждым использованием.
1. Прехирургическая шаги
- Автоклав всех хирургических инструментов для обеспечения стерильности.
- Анестезировать C57bl6 мышей с изофлюрановая (4% для индукции и 1,5-2% для хирургии). Щепотка задних ног каждые 10 мин для обеспечения надлежащего глубины анестезии. Если видели вокализации или задних конечностей Ретракция увеличьте анестезии.
- Смазать ветеринарных глаза в глаза для предотвращения высыхания.
- Удалите волосы на волосистой части головы с применением 3 мин для удаления волос или бритья с электрической бритвой.
- Поместите указатель мыши в стереотаксической рамы на грелку или калиброванные воды рециркуляции одеяло набор до 38° C.
- Администрировать бупренорфин (0,1 мг/кг) подкожно предоставлять Прехирургическая анальгезии.
- Дезинфекция кожи головы с трех чередующихся приложениями хлоргексидина или betadine и 70% этанол, с использованием хлопок наконечником аппликатором.
- Придать 100 мл бупивакаин разбавленный 50% в солевой раствор под кожу головы, чтобы предоставить местной анестезии.
2. пьезоэлектрический черепной окно хирургия
- Использование автоклавного стерильные хирургические инструменты, удалите 1 см окружность головы над черепа, резки с Ножницы хирургические в круговую диаграмму. Поднимите головы покинуть подвергая надкостницы ткани через кости черепа.
- Используйте кончик щипцы выскоблить подвергаются кости ясно любых оставшихся ткани надкостницы. Это имеет важное значение для обеспечения что стоматологического цемента будет не падать позже.
- Установите блок пьезоэлектрический хирургии для того чтобы вибрировать на самом низком настройки. Обратите внимание, что выше параметры могут разорвать кровеносные сосуды из-за интенсивной вибрации.
- Зафиксировать кончик стерильных циркуляр для наконечника.
Примечание: Кончик циркуляр 4 мм хорошо подходит для кабинетов. Размер большой совет способствует скорость операции как все окно можно разбавлять одновременно. - Заполните шприц 10 мл с лед холодной искусственных спинномозговой жидкости (ФАГО) и держите его в руке, не держа пьезоэлектрический наконечника.
- Орошения черепа, капает фаго из шприца череп со скоростью 1 мл/мин в качестве альтернативы, использовать Перистальтический насос расположен над черепа для свободного использования другой стороны.
Примечание: Орошение холодной фаго имеет важное значение для предотвращения перегрева из-за трения от высокочастотной вибрации. - Осторожно применять кончик вибрирующий хирургические черепа с легкими круговыми движениями (3 кругов за 1 s) и тонкая кость на желаемую глубину для выполнения тонких череп подготовки (5-10 мин).
Примечание: Здесь, 4 мм windows были сделаны которые были разбавлять до 20 мкм. Однако размер окна будет изменяться с размером кончик хирургического. Толщина кости могут корректироваться на нужную глубину, основанное на продолжительности времени, затраченного применения кончик к черепу. - Аккуратно регулировать угол рукоятки и изменить угол кончика при применении давления с черепом тонкой черепа равномерно.
- Для выполнения полного костей удаления не выходя из любой тонкой кости позади, тонкие кости до тех пор, пока трещины видны вокруг области окна. Удалите оставшиеся хлопья тонкие кости с щипцами без повреждения основной Дура.
- Замочите 1 мм кусок пены гемостаза коллагена в холодной фаго. Держите влажной пеной с щипцами и поместите его на тонкие черепа. Позволить ему сидеть на тонкой черепа около 30 s, чтобы остановить любые микро кровоточит из развивающихся.
- Используйте щипцы coverslip стекла 4 мм боково над окном, которое был растворен в кости.
- Использование задней части небольшой пластиковой или деревянной хлопок наконечником аппликатором для применения приблизительно 100 мкл стоматологических акрил к черепа, чтобы держать окно на месте.
3. после хирургической помощи
- Удаление мыши из хирургического аппарата и поместите его в клетке с подогревом для восстановления. Контролировать его непрерывно до тех пор, пока он обрел полное сознание (нормальной подвижности, походка и оценку поведения).
- Оцените животных дважды в день в течение трех дней для проявления послеоперационные боли, включая снижение активности, уход, питание и потребление воды, охрана поведение (например хромает или Сгорбленная осанка) или повышенной агрессии. Не вернуть животное в компании других животных, до тех пор, пока он полностью выздоровел.
- Администрировать бупренорфин (0,05-0,1 мг/кг) подкожно как болеутоляющее 8-12 ч после операции в течение 3 дней. Контролировать области окна, близко после хирургии для зияние, воспаления и признаки инфекции. Если животное не вернуться к базовой линии кормления и ухода поведения, проконсультируйтесь с ветеринаром относительно возможного вмешательства или эвтаназии.
Representative Results
Прежде чем приступить с пьезоэлектрический хирургии, удалите любые остаточные надкостницы от черепа. После того, как черепа является непрозрачной и гладкой (рис. 1а), хирург может начать пьезоэлектрический хирургии. При удалении кости с вибрирующей пьезо кончиком, это важно для орошения черепа с льдом холодной фаго. Надлежащего орошения достигается, когда нижней 1 мм кончика погружен в Фаго (рис. 1b). Без надлежащего орошения кость от перегрева и повреждения мозга. После черепа были разбавлять до желаемой глубины выбираются хирург, могут существовать некоторые остаточные кровотечение из кровеносных сосудов, расположенных в кости. Для того, чтобы быстро прекратить все кровотечение, примените небольшой 1 мм кусок пены коллагена, пропитанной фаго в область окна. Пусть коллаген сидеть на черепе для приблизительно 30 s (рис. 1С). После удаления пены коллагена, окно будет появляться полупрозрачный, позволяя четкой визуализации кровеносных сосудов в Дура. Дура будет неизменной без значительного кровоподтеки. (Рис. 1 d). Если Дура выглядит красной и воспаленной, это скорее всего из-за сломанной кровеносных сосудов с слишком много давления на кончик во время операции. Чтобы защитить новое окно и подготовить его к хронической изображений, coverslip стекла должны быть помещены над районом. Coverslip правильно прикладной стекла осторожно будет сидеть в верхней части окна и не будет наносить ущерб в районе. Coverslip стекла должны охватывать все окно. Если стекло coverslip должным образом применяется к черепу, окно останется полупрозрачный под стеклом. Все кровеносные сосуды в Дура будет по-прежнему видны (Рисунок 1e). Стоматологическая акрил должен быть применен вокруг стекла coverslip постоянно придерживаться поверхности черепа. По краям стекла coverslip также должны быть покрыты в стоматологической акриловые (Рисунок 1f).
Мы обнаружили, что пьезоэлектрические операции обычно намного быстрее, чем традиционные черепной окна, принимая около 10-12 мин в хирургии (рисунок 2A). Мы также обнаружили, что там было меньше осложнений Дура синяки и кровотечения, как заметил на глаз (Рисунок 2Б). Должным образом подготовлена окно позволит multiphoton изображений люминесцентных индикаторов в корковых нейронов в естественных условиях. Мы выбрали для изображения индикатор красный кальция JRGECO1a в клетки тела нейронов коркового слоя 4 (рис. 3A-3В). Мы могли наблюдать кальция переходные процессы в этих клеток органов через окно, подготовлен с использованием фазового.
Рисунок 1: пьезоэлектрический хирургия. () череп после него был надлежащим образом подготовлен для фазового. Периостальный ткани был удален, оставляя поверхность гладкой и чистой. (b) образ представителя PHASOR в прогресс. Внизу 1 мм вибрирующих хирургические наконечник погружен в лед холодной фаго. Жидкости применяется к черепу со скоростью 1 мл/мин. Легкие круговые движения применяется к черепа и кости разбавлять через ультразвуковыми колебаниями. (c) после того, как разбавлять черепа, 1 мм круглые кусок пены коллагена замачивают в холодной, разрешенного фаго почивать на окно, чтобы остановить любые микро кровоточит от кости. (d) A успешный окно с полупрозрачными Дура отображает все нетронутыми кровеносных сосудов. Существует никаких видимых повреждений или кровоподтеки на поверхности мозга. (e coverslip стекло помещается поверх окна для защиты поверхности головного мозга. (f) Стоматологическая акрил применяется к черепа окончательно исправить coverslip стекло над окном. Масштаб 1 мм во всех изображениях.
Рисунок 2. Сравнение успеха в подготовке кадров для фазового или стоматологические сверлить хирургии. (A) среднее время хирургии была ниже для фазового Стоматологическая буровых операций (p < 0,05, две хвостатые t-тест) n = 30 хирургических операций для каждой группы и среднем 10 операций в хирург. (Б) процент успешных операций (определяется как не кровотечения или видимые повреждения Дура как наблюдением глаз хирурга через цели, поставленной для 350 X зум) был выше для фазового Стоматологическая буровых операций (n = 30 хирургических операций для каждой группы, один Хвостатые z тест). Планки погрешностей Показать ур.
На рисунке 3. Multiphoton изображений в естественных условиях через окно черепной разбавлять PHASOR. (A) кальция, что переходные процессы, наблюдается с красным кальция индикатор JRGECO1a были отражаться в пирамидных нейронов слоя 4 в мышиных моторной коры в естественных условиях. Шкалы бар = 100 µm. (B) то же окно, но разных регионе слой 4 моторной коры. Headfixed мышь с 3 мм окно приготовленные PHASOR. Шкалы бар = 30 мкм. Imaged с микроскопом multiphoton, 40 X цели, длина волны возбуждения 1040 Нм.
Discussion
Операция может быть изменена путем изменения кончик хирургического. Есть много различных размеров наконечника, который может быть применен для наконечника. Изменить размер или форму кончика приведет в различных размеров окна. В дополнение к 4 мм кончика мы также попытался отзыв 3 мм и обнаружил, что он также работал хорошо. Даже с орошением со льдом холодной фаго, мы не смогли получить хорошие результаты с советами, которые были слишком узкими (примерно 0,25 мм) Благодаря концентрированной вибрации, вызывая слишком много тепла и сжигание кости, ведущих к повреждению к базовой Дура. Мы не пробовали множество других советов, которые доступны, и мы ожидаем, что другие лаборатории могут найти новых приложений для этих различных советов. Хотя хирургии является относительно простым, мы обнаружили, что есть несколько шагов, которые могут потребовать устранения неполадок. Во-первых, что вибрирующие кончик производит много турбулентности в фаго, который снижает видимость и создает трудности в установлении глубины кости в кости, истончение шаг хирургии. Мы рекомендуем, чтобы, если это слишком трудно увидеть, как тонкая кость, взять перерыв, чтобы высушить череп и окна, применяя стерильным ватным тампоном в сторону кости. Не применять ватным тампоном непосредственно к окну, так как шероховатая поверхность наносит ущерб тонкие кости. После проверки глубины, повторно фаго и продолжите операцию. Мы также обнаружили, что если есть повреждения Дура, это обычно связано хирург, слишком много давления на чаевые. Удерживая наконечник более нежно и применения менее силой, скорее всего, решить эту проблему. Если хирург насильственно выскабливание кончик на кости, он будет причиной перерыва в тонких костей и повреждения черепа. Наконец если после истончение костей, основной Дура ушиб, вполне вероятно, из-за избыточного тепла от вибрации. Увеличение скорости потока фаго будет исправить эту проблему.
Основное ограничение PHASOR является что наконечник может тонкие кости, но не может удалить все кости над Дура. Кончик алмаза с покрытием имеет небольшие грубые неровности. Растирание, необходимых для тонкой черепа бы истирает Дура и вызвать кровотечение, если это были использованы, чтобы удалить все кости. Таким образом чтобы удалить оставшиеся тонкий слой требуется использования щипцов. Хотя есть текущие дебаты на ли изображений через тонкий череп производит меньше воспаления и меньше распространение Микроглия и реактивной астроциты, в некоторых случаях окно с оставшихся без костей является предпочтительным, например, обеспечить большую глубину визуализации3 .
Мы оптимизировали черепной окно подготовки к multiphoton изображений в мышах. PHASOR является, насколько нам известно, первое применение пьезоэлектрический технику для грызунов черепной окно хирургии для оптических изображений. Мы находим, что использование пьезоэлектрической хирургии в мышах разделяет преимущества повышенной скорости и снижение неблагоприятных событий, которые также зарегистрированы в людей7,8,9,10. Использование пьезоэлектрические устройства привели к быстрее операции (рисунок 2A) и меньше неблагоприятных событий кровотечений по сравнению с высокоскоростной роторный сверла (рис. 2B). Мы также нашли, в нашей лаборатории, что фазовый было проще для новых хирургов узнать, чем традиционные подходы к черепной окна хирургии. Преимущества скорость и простота использования являются скорее всего отличаются среди хирургов. Тонкий череп препараты обычно требуют 30-45 мин тонкие кости с сверла и скальпеля2, в то время как фазовый подход обычно требует меньше чем 10 мин.
Мы обнаружили, что в windows, приготовленные PHASOR мы могли изображения кальция переходные процессы в слой 4 пирамидных нейронов моторной коры, который был transfected с вирусом адено связанные кодирования кальция индикатора JRGECO1a (AAV9. Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40). Мы также обнаружили, что, по сравнению с тонкой череп черепа окно приготовленные роторный буровой и скальпеля, изображений региона была больше, хотя тонкий черепа, приготовленные Ротари бур и скальпеля визуализации окна диаметром 20 мкм2 . С PHASOR мы смогли быстро тонкой области 3-4 мм. Это похоже на окно визуализации, сообщили с портами4. Это больше окно сохраняет преимущество быстрого изображений для тонких череп windows приготовленные Стоматологическая дрели и скальпеля. Кроме того окно, приготовленные PHASOR может быть немедленно imaged, в отличие от традиционных кости удаления windows, которые могут потребовать недель, чтобы залечить до того, как окно может быть оптимально imaged3.
Этот метод может быть применен для изучения изменения кровотока в сосудах под Дура. Важным будущего исследования-сравнить иммунореактивности PHASOR с другими методами черепной окна. Это было бы важно, чтобы определить, если ИЗМЕРЕННЫЕ производит меньше воспаления по сравнению с существующими методами. Мы надеемся, что пьезоэлектрические хирургической техники, документально здесь позволит более лаборатории для выполнения черепной windows и успешно использовать multiphoton изображений в естественных условиях.
Убедитесь, что наконечник установлено для того чтобы вибрировать на самом низком настройки и что в настоящее время орошается фаго с постоянной скоростью. Ледяной фаго должны применяться постоянно, или он будет тепло и повредить Дура. Мы обнаружили, что фаго должны применяться в размере менее 1 мл/мин либо шприцем в руке, или использовать Перистальтический насос, вместо встроенных орошения в наконечник. Ирригационная система в наконечник слишком насильственно изгонять фаго и производит слишком много потрясений, который будет значительно ухудшить видимость.
Disclosures
Существует без информации.
Acknowledgments
Тамара Zeric за помощь получить multiphoton образ в этом документе. Поддержке мозг и поведение, Паркинсона и JPB фондов, R01 MH108186 и R01 DA07418. F31 стипендий 1F31MH109293-01A1 с S.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Piezosurgery Touch | Mectron | 5120062 | Piezosurgery GP model has the same settings |
| Circular 4mm flat piezosurgery tip (# OT11) | Mectron | 3370019 | This tip was ideal for our windows but there are many other tips of different sizes availible. |
| Stereotax frame | Kopf | 963 | |
| Mouse adaptor | Stoelting | 51625 | |
| Peristaltic pump for irrigation. | Cole-Parmer | WU-77120-42 | Makes it easier to irrigate and frees up the other hand to provide stability. Irrigation can be performed by hand with a syringe if necessary. |
| Avitene Ultrafoam | Bard-Davol | 1050020 | Important to stop any minor bleeding instantly. |
| C&B Metabond | Parkell | S380 | Much stronger than regular dental acrylic. |
| Artificial cerebro spinal fluid (ACSF) | Tocris | 3525 | |
| Puralube opthalmic ointment | Dechra | 17033-211-38 | |
| Mice | JAX | 664 | |
| Prairie Ultima multiphoton microscope | Bruker | ||
| JRGECO1a (AAV9.Syn.NES-jRGECO1a.WPRE.SV40) | UPENN Vector Core |
References
- Holtmaat, A., et al. Long-term, high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window. Nat Protoc. 4, 1128-1144 (2009).
- Yang, G., Pan, F., Parkhurst, C. N., Grutzendler, J., Gan, W. Thinned-skull cranial window technique for long term imaging of the cortex in live mice. Nat protoc. 12, 213-220 (2010).
- Dorand, D. R., Barkauskas, D. S., Evans, T. A., Petrosiute, A., Huang, A. Y. Comparison of intravital thinned skull and cranial window approaches to study CNS immunobiology in the mouse cortex. Intravital. 3, e29728-1-e29728-8 (2014).
- Drew, P. J., et al. Chronic optical access through a polished and reinforced thinned skull. Nat Methods. 7, 981-984 (2010).
- Wang, J., Zhang, Y., Xu, T. H., Luo, Q. M., Zhu, D. An innovative transparent cranial window based on skull optical clearing. Laser Physics Letters. 9, (2012).
- Yang, X., et al. Skull Optical Clearing Solution for Enhancing Ultrasonic and Photoacoustic Imaging. IEEE Trans Med Imaging. 35, (2016).
- Vercellotti, T. Piezoelectric surgery in implantology: a case report--a new piezoelectric ridge expansion technique. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 358-365 (2000).
- Vercellotti, T., De Paoli, S., Nevins, M. The piezoelectric bony window osteotomy and sinus membrane elevation: introduction of a new technique for simplification of the sinus augmentation procedure. Int J Periodontics Restorative Dent. 6, 561-567 (2001).
- Vercellotti, T., Podesta, A. Orthodontic microsurgery: a new surgically guided technique for dental movement. Int J Periodontics Restorative Dent. 4, 325-331 (2007).
- Stubinger, S., Stricker, A., Berg, B. I. Piezoelectric surgery in implant dentistry. Clin Cosmet Investig Dent. 7, 115-124 (2015).
- Basheer, S. A., Govind, R. J., Daniel, A., Sam, G., Adarsh, V. J., Rao, A. Comparative Study of Piezoelectric and Rotary Osteotomy Technique for Third Molar Impaction. J Contemp Dent Pract. 18, 60-64 (2017).
- Pavlikova, G., et al. Piezoelectric surgery prevents brain tissue damage: an experimental study on a new rat model. Int J Oral Maxillofac Surg. 40, 840-844 (2011).
