Summary
Les cellules affichent différentes morphologies et établissent une variété d’interactions avec leurs voisins. Ce protocole décrit comment révéler la morphologie des cellules individuelles et d’étudier les interactions cellule-cellule en utilisant le système d’expression de Gal4/UAS bien établi.
Abstract
Les cellules affichent différentes morphologies et relations anatomiques complexes. Comment les cellules interagissent avec leurs voisins ? Les interactions diffèrent-ils entre les types de cellules ou même au sein d’un type donné ? Quels types de règles spatiales ils suivent ? Les réponses à ces questions fondamentales in vivo ont été entravés jusqu'à présent par un manque d’outils pour l’étiquetage de cellule unique de haute résolution. Ici, un protocole détaillé pour cibler les cellules individuelles avec une technique de FlpOut MultiColor (MCFO) est fourni. Cette méthode s’appuie sur trois marqués différemment reporters (HA, drapeau et V5) sous contrôle de l’UAS qui restent silencieux d’un terminateur transcriptionnel, flanqué de deux sites FRT (FRT-stop-FRT). Une impulsion de choc thermique induit l’expression d’une recombinase Flp de chaleur d’induite par le choc, qui enlève au hasard les cassettes de FRT-stop-FRT dans des cellules individuelles : expression se produit uniquement dans les cellules qui expriment également un pilote de GAL4. Cela conduit à une matrice de cellules colorées différemment d’un type donné de cellules qui permet la visualisation des morphologies de cellules individuelles à haute résolution. À titre d’exemple, la technique MCFO est cumulable avec les pilotes de GAL4 gliales spécifiques pour visualiser les morphologies des différents sous-types gliales dans le cerveau adulte de la drosophile .
Introduction
Glia, la population de cellules non neuronales du système nerveux (NS), ont longtemps cru à fournir un cadre statique pour les neurones et n’ont donc pas été étudiées en détail. Cependant, chez les humains, cellules gliales constituent la grande majorité des cellules dans le NS (~ 90 %) et entrent dans plusieurs catégories, y compris les astrocytes, les oligodendrocytes, la microglie et les cellules de Schwann. Chez la drosophile, cellules gliales constituent environ 10 % des cellules dans le NS. Curieusement, leurs morphologies et leurs fonctions sont remarquablement similaires à ceux trouvés chez les vertébrés1,2. Leurs morphologies comprennent la barrière hémato - encéphalique (BHE) formant des épithéliums, engainantes et cellules semblables à des astrocytes.
Drosophila système nerveux central (SNC) se compose des structures principales suivantes : régions de cortex qui contiennent les corps cellulaires neurones ; neuropils hébergeant des connexions synaptiques ; tracts axon petits et grands qui relient les différents neuropiles ; nerfs périphériques qui se connectent les organes sensoriels et les muscles avec le système nerveux central (Figure 1). Cellules gliales se trouvent associés à toutes ces structures anatomiques : Cortex cellules gliales (CG) dans les régions corticales, astrocyte ressemblant cellules gliales (ALG) et engainantes glia (EG) dans les régions de neuropile, engainantes glia sont aussi associés aux tracts axon central et périphérique nerfs (EGN) et enfin, deux feuillet glia, périneurale glia (PG) et subperineurial (SPG), qui ensemble forment une couche contigue qui recouvre l’ensemble NS (Figure 2).
Des études antérieures ont montré que glia jouent un rôle important dans le développement de la NS ; elles surveillent nombre de cellules neuronales en réagissant à la circulation systémique insuline-like peptides, soutiennent trophique aux neurones, tels que la navette de lactate astrocyte-neurone et éliminer les neurones mourants par phagocytose3,4 , 5 , 6. dans le NS mature, cellule gliale maintenir la BHE, relever les neurotransmetteurs et maintenir l’homéostasie ionique, agissent comme les grandes cellules immunitaires dans le NS, étant donné que les macrophages ne peuvent violer la BHE et moduler l’activité synaptique comme comportement animal6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Si les différents sous-types gliales fonctions spécialisées importante question reste ouverte. Cependant, une analyse systématique de tout le génome des cellules gliales, surtout chez l’adulte, a été entravée par un manque d’outils génétiques appropriés pour leur manipulation. Ici, on présente une méthode qui permet la caractérisation facile et efficace des formes cellulaires pour étudier les interactions cellule-cellule complexe. Cette technique a été utilisée pour caractériser la morphologie des différents sous-types gliales dans le cerveau de drosophile adulte, mais, selon le pilote spécifique de GAL4 utilisé, il pourrait être adapté pour étudier les neurones12,13 , tout type de cellules entremêlant et en principe n’importe quel tissu dans des stades de développement.
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Protocol
1. préparation des mouches pour expériences MultiColor FlpOut (MCFO)
Remarque : MCFO le technique se réfère à une version modifiée de l’excision de cassette Flp-mediated arrêt ce qu’on appelle (FlpOut). Transgéniques MCFO mouches portent un promoteur de choc thermique (hsp)-recombinase Flp et différents journalistes sous SAMU de contrôle. Chaque journaliste est constitué d’une ossature commune d’une myristoylated (myr) super dossier vert fluorescent protéine (sfGFP), dont 10 exemplaires d’une balise de l’épitope (e.g., HA, drapeau ou V5) ont été insérés. Les protéines fluorescentes qui en résultent sont nommées " monstre en spaghettis sexes " (smGFPs) 14 et peuvent être détectés en utilisant des anticorps spécifiques contre les épitopes différents tags.
- Cross vole avec la cassette MCFO et le PIH-Flp (hsp-Flp ; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) à gliales GAL4 conducteur lignes appropriées (voir Table des matières) .
- Comme le PSH est déjà actif à 25 ° C et peu de cellules peut-être subir une recombinaison conduisant à un marquage non spécifique, mis en place des croisements à 18 ° C afin d’éviter la perméabilité du système. Attendre environ 20 jours à 18 ° C pour obtenir la génération F1. Après la chaleur de choc (voir étape 2), de maintenir les mouches à 25 ° C ( Figure 3).
2. Choc thermique
Remarque : selon le site d’insertion, l’efficacité de la PIH-Flp peut-être différer ; par conséquent, le temps du choc thermique optimal doit être optimisé. Pour ce protocole, un stock de mouche MCFO dans laquelle le PSH-Flp a été inséré sur le chromosome X a été utilisé (voir Table des matières).
- Transfert la progéniture de la Croix à l’étape 1.1 (oiseau de génération F1, âgés de 3 à 4 jours) dans les nouveaux flacons contenant des aliments et la chaleur de leur choc à 37 ° C dans un bain d’eau.
Remarque : Les jeunes mouches (1-2 jours) sont très sensibles aux chocs thermiques. Attendre 1 ou 2 jours de plus avant d’effectuer le choc thermique afin de réduire le taux de mortalité causé par le traitement. Utilisation de certains de la génération F1 vole comme un contrôle, sans choc thermique. - Pendant le choc thermique, maintenir les mouches en flacons normales avec de la nourriture afin de diminuer le taux de mortalité induite par le stress. Mettre les femmes et les hommes dans des flacons séparés.
- Veillez à plonger le flacon entier dans l’eau pour assurer un choc thermique homogène. Utiliser un choc de 5-8 min comme point de départ approprié pour l’étiquetage clairsemée des cellules gliales de nombreuses lignes de pilote GAL4 ; la durée du choc doit être optimisée pour chaque pilote et expérience (temps de choc thermique plus ou moins longue peuvent être nécessaires).
- Après le choc thermique, poser les flacons horizontalement sur le banc pendant quelques minutes afin de permettre les mouches à récupérer du choc thermique.
Remarque : Il n’est pas nécessaire de changer les flacons de. - Maintenir les mouches à 25 ° C et disséquer (Voir l’étape 3 et 4) les 2 jours ou plus après le choc de la chaleur pour l’expression du Rapporteur optimale.
3. Préparation de la dissection et de la Solutions
- le jour de la dissection, préparer la solution de fixation fraîche dans des tubes PCR 200 µL en mélangeant 180 µL de milieu de culture cellulaire S2 avec 20 µL de paraformaldéhyde (PFA) pour obtenir une solution PFA de 2 % à 20 %. Maintenir la solution de fixation sur la glace avant et Pendant la dissection.
ATTENTION : PFA est toxique et doit être manipulé avec soin.
NOTE : Mélanger 160 µL de milieu de culture cellulaire S2 avec 40 µL de paraformaldéhyde (PFA) dans un tube PCR de 200 µL pour préparer une solution PFA de 4 % au lieu d’une solution de 2 % à 20 %. - Utiliser un tube PCR par génotype avec un maximum de 8-10 cerveaux par tube pour des résultats optimaux de coloration.
- Préparer le cerveau adulte, solution de lavage : 0,5 % d’albumine sérique bovine, 0,5 % Triton X-100 dans du PBS.
Remarque : Selon la coloration, une solution contenant 1 % Triton X-100 peut-être être nécessaires. Une concentration plus élevée de Triton X-100 augmente la pénétration de l’anticorps dans les tissus et il faut des régions de tache qui se trouvent à l’intérieur du tissu (par exemple, les régions synaptiques dans le cerveau adulte de la drosophile). - Préparer la solution de blocage : sérum de chèvre normal de 3 %, 3 % de sérum d’âne normal et 0,5 % Triton X-100 dans du PBS.
- Le cerveau adulte solution et la solution de blocage de lavage peut être stocké à 4 ° C pendant plusieurs semaines.
- Mettre la plaque de verre pour le puits profond de la dépression sur la glace et remplir chaque bien avec les solutions suivantes : l’un avec l’éthanol à 70 %, l’un avec du PBS et un avec milieu de culture cellulaire S2.
4. Dissection de cerveau adulte
- positionner un 3 cm plat de dissection sur la scène d’un stéréomicroscope et remplissez-le avec froid S2 un milieu de culture cellulaire. Effectuer toutes les dissections dans ce milieu pour s’assurer que le tissu reste sain pendant la procédure de dissection.
Remarque : Utilisez un plat dissection bordé de plusieurs millimètres de silicone noir qui offre un bon fond contraste (dans les images) et préserver la pince pendant la dissection. - Anesthésier les mouches du génotype désiré en CO 2.
- Avec une pince, saisir à la volée par les ailes et lavez-le à l’éthanol 70 % froid pendant 30 s, puis avec du PBS froid pour 30 supplémentaires s.
- Transférer la mouche dans la profonde dépression bien rempli avec un milieu de culture cellulaire S2.
- Répétez la même procédure pour toutes les mouches du même génotype et maintenir au froid milieu de culture cellulaire S2 jusqu'à dissection, qui permettra de préserver le tissu.
NOTE : Anesthésier seulement le nombre de mouches qui peut être disséqué en un laps de temps d’environ 30 min. de longs délais d’incubation dans un milieu de culture cellulaire S2 peut endommager les tissus. - Prenez la mouche avec une pince et, sous un stéréomicroscope, submerger la volée dans un milieu de culture cellulaire S2.
- Détacher la tête du reste du corps. Jeter le corps et garder la tête immergée dans un milieu de culture cellulaire S2. Il est extrêmement important de tenir la tête avec une pince pour toute la durée de la dissection. Si la tête commence à flotter, il sera difficile de le récupérer sans agresser le tissu.
- Commencer la dissection en tirant sur un œil, tout en tenant la tête avec une pince au moins une en tout temps. Assurez-vous que l’extrémité de la pince est juste en dessous de la rétine pour éviter d’endommager le tissu sous. Tirez sur l’autre oeil et commencer à retirer la cuticule jusqu'à ce que le cerveau semble.
- Supprimer tous les tissus trachéal et cuticule autour du cerveau jusqu'à ce que le tissu semble propre. Veillez à enlever tous les tissus trachéale autour du cerveau pour des résultats optimaux de coloration ; les tissus sont maintenant prêtes à être fixées et colorées.
- Maintenir tous les cerveaux disséqués en S2 froid milieu de culture de cellules avant de les transférer dans la solution PFA pour l’étape de la fixation du temps.
5. Coloration de cerveau adulte
< ol>Remarque : Les temps d’incubation peuvent varier selon le type d’anticorps utilisé. Des incubations plus longues peuvent être nécessaires.
- Pour l’étiquetage des trois marqueurs MCFO, incuber les cerveaux avec anti-HA (1/500), Anti-Flag (épitope DYKDDDDK) (1/100) et les anticorps primaires anti-V5.
- Primaire directement conjugués anticorps pourraient être utilisés au lieu de la combinaison normale de primaire + secondaire (p. ex.., anti-549 V5:DyLight (1 : 200)). Dans ce cas, traiter l’anticorps conjugué directement comme anticorps secondaires.
Remarque : Pour chaque génotype, garder quelques cerveaux comme des contrôles pour vérifier la spécificité de la coloration. Ignorez l’incubation de l’anticorps primaire et passez directement à l’étape suivante.
Remarque : exemples d’anticorps appropriés : AlexaFluor 488 (1/250), anti-549 V5:DyLight (1 : 200) et les DyLight 647 (1/100)-conjugués anticorps.
6. Montage des cerveaux pour l’imagerie
- Trim une imagerie entretoise à la taille appropriée à l’aide de ciseaux. Microscopie à haute résolution, le spécimen et imagerie spacer entre deux lamelles de verre sandwich.
NOTE : L’imagerie entretoises sont mince (0,12 mm d’épaisseur) adhésifs entretoises qui peler et collent au verre couvre-objet ou microscope slides, permettant le montage des spécimens sans compression. - Using pince, retirer le papier adhésif d’un revêtement et appliquer l’espaceur, côté adhésif vers le bas, sur la surface d’une lamelle de verre (22 x 60 mm). Appliquer 10 µL de milieu de montage d’une lamelle de verre nouvel.
- Avec un P10 pipette, transférer les cerveaux du tube 200 µL de la lamelle, à côté de la goutte de milieu de montage. Ainsi que les tissus, transférer certains PBS afin de maintenir le cerveau en solution.
- Pipette avec un P10, déplacez le cerveau de la PBS la goutte de milieu de montage essayant de limiter la quantité de PBS. Transférer les échantillons en milieu de montage sur la lamelle couvre-objet avec l’entretoise d’imagerie. Utiliser suffisamment supports de montage pour couvrir le spécimen.
- Supprimer l’autre revêtement adhésif de la face supérieure de l’entretoise et ajouter une lamelle de verre sur le dessus les spécimens. Avec la pointe d’un forceps, appliquer une légère pression sur la zone adhésive pour sceller. Les tissus montés l’image immédiatement ou stocker les lames à-20 ° C pour une analyse ultérieure.
7. Acquisition d’images
- piles d’acquérir des images confocal fluorescence à l’aide d’un microscope confocal avec un 40 X (NA = 1.2, immersion dans l’eau) objectif ou 63 X (NA = 1,4, immersion dans l’huile) objectif (tailles pixel = 1 024 x 1 024 dans le plan xy ; Distance entre deux sections confocale = 0,5 µm). Ajuster le gain du détecteur et l’offset pour chaque voie de telle sorte qu’aucun pixel saturé et valeurs nulles pixel sont présents dans les images ; Cela évite la perte d’informations et assure une utilisation de la plage dynamique complète du détecteur de.
Remarque : Étant donné que l’imagerie 3D prend beaucoup de temps, les mesures peuvent être automatisés en analysant des échantillons multiples en parallèle à des endroits différents. Pour éviter l’évaporation avec l’objectif à immersion d’eau, utilisez une huile spéciale immersion moyenne avec indice de réfraction n = 1,33. - Traiter les piles confocal pour les projections de densité maximale, changements de teinte de canal et ajustement de la luminosité et de contraste à l’aide de n’importe quel logiciel d’analyse image standard (voir la Table des matières).
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Representative Results
Cette section illustre des exemples de résultats qui peuvent être obtenus en utilisant la technique MCFO dans le cerveau adulte de la drosophile . La figure 3 montre une représentation schématique de la méthode. Trois marqués différemment membrane reporters (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-drapeau et myr-smGFP-V5) sous contrôle de l’UAS restent silencieux d’un terminateur transcriptionnel, flanqué de deux sites FRT (FRT-stop-FRT). Une impulsion de choc thermique induit l’expression de la recombinase Flp qui enlève au hasard les cassettes de FRT-stop-FRT dans des cellules individuelles. Cela conduit à un tableau de cellules colorées différemment d’un type de cellule donnée, spécifiée par le pilote de GAL4 utilisé.
Dans l’ensemble, sept couleurs sont possibles. Figure 4 et Figure 5 montrent les morphologies unique de cellules EG et ALG dans le lobe antennaire de drosophile (AL), respectivement. Augmentation du temps de choc thermique induit une plus grande quantité de cellules marquées, selon le type de pilote que GAL4, donc une optimisation initiale du protocole de choc thermique est nécessaire. La figure 6 illustre l’étiquetage des EG dans le lobe optique de drosophile (OL) avec des journalistes MCFO unique.
Figure 1 : Anatomie de l' adulte Drosophila NS. Les régions corticales (zones grises en pointillé) contiennent tous les neurones et surtout le corps des cellules glial, tandis que les régions de la neuropile (zones bleues) contiennent les connexions synaptiques. Régions de tract (bleu foncé) connecter les neuropiles différents. Ce chiffre a été modifié par Kremer et al. (2017) 18. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : génériques sous-types gliales chez la drosophile CNS. Un journaliste GFP (SAMU-mCD8-GFP) membrane-tag pilotée par des pilotes spécifiques de GAL4 permet la visualisation des cinq sous-types gliales génériques (PG : périneurale glia, SPG : subperineurial glia, CG : glia cortex, ALG : glia astrocyte-comme et EG : engainantes glia). Les régions de la neuropile (zones magenta) sont détectées avec le marqueur présynaptique NC82 (BRUCHPILOT). Au fond, du nombre de cellules pour les différents sous-types gliales est également indiqué. Echelle = 100 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : schéma de croisement pour la technique MCFO. Schéma de la technique MCFO. Homozygousvirgins portant la cassette MCFO et le PIH-Flp (hsp-Flp ; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) sont croisées avec des homozygotes mâles pilote de GAL4. La génération F1 est ensuite choc thermique. Selon le nombre de cassettes de FRT-stop-FRT prélevé au hasard les journalistes, les sept couleurs sont possibles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : morphologie des cellules engainantes gliales (EG), dans le lobe antennaire (AL). Confocal z-piles de Drosophila AL après wholemount immunostaining. (A) la morphologie de AL détecté avec le marqueur présynaptique NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Étiquetage stochastique des EGcells induite en multipliant de choc thermique : 8 min (B), 8,5 min (C) et 10 min (D). La prise EG sur différentes formes et tailles, comme ils forte la surface de la coll. voisins cellules EG recouvrir les zones distinctes mais partiellement interrompus dans les régions de contact. Echelle = 20 µm. HA : hémagglutinine de grippe humaine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : morphologie des astrocytes ressemblant cellules gliales (ALG) dans le lobe antennaire (AL). Confocal z-piles de Drosophila AL après wholemount immunostaining. (A) la morphologie du AL détecté avec le marqueur présynaptique NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stochastique de marquage de cellules ALG induit en multipliant de choc thermique : 8 min (B), 10 min (C) et 15 min (D). ALG Voir la taille variable et morphologies mais couvrent en grande partie sans chevauchement étendues. Echelle = 20 µm. HA : hémagglutinine de grippe humaine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : morphologie des cellules engainantes gliales (EG), dans le lobe optique (OL). Confocal z-piles de Drosophila OL après wholemount immunostaining. (A-C) MCFO marquage avec trois reporters de stop-cassette avec HA, drapeau et V5 myr-smGFPs. Recombinase Flp a été induite par un choc thermique de 10 min à 37 ° C. (A-C) Chaque MCFO reporters et fusion (D) sont indiquées. Echelle = 20 µm. HA : hémagglutinine de grippe humaine. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole décrit une méthode simple et efficace afin d’étudier la morphologie des différents types de cellules dans un tissu d’intérêt à haute résolution. Avec la technique MCFO, plusieurs reporters avec étiquettes d’épitope différents sont utilisés en combinaison pour multicolor étiquetage stochastique (Figure 2). Semblable à d’autres méthodes telles que Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO augmente la diversité de l’étiquette par coexpression de marqueur, ce qui permet la visualisation des limites d’une cellule d’études sur les interactions cellule-cellule. Par exemple, avec les trois journalistes, sept combinaisons de marqueurs potentiels sont possibles. Par rapport aux précédentes méthodes d’étiquetage, la technique MCFO montre un contrôle plus précis et facile de la cellule étiquetage densité17: Flybow 1.0 mouches expriment un marqueur par défaut qui rend la cellule unique d’étiquetage plus difficile ; Flybow 2.0 mouches exigent l’expression de deux différents Flp recombinases rendant le système plus complexe.
Selon le pilote de GAL4 spécifique utilisé, la technique MCFO peut être adaptée pour étudier n’importe quel tissu à n’importe quel stade de développement. Ici, la technique a été appliquée afin de caractériser la morphologie des sous-types gliales génériques dans le cerveau adulte de drosophile à haute résolution. L’étiquetage multicolore des cellules simples permet la visualisation des différentes limites et aide à comprendre, par exemple, l’interaction spatiale entre deux cellules adjacentes ; mis à part les cellules PNG et SPG, qui visent à épithélium forme, tous les autres sous-types gliales montrent carrelage, c’est elles minimiser le contact avec leurs voisins gliales, tout en maximisant le contact avec le compartiment neuronal enveloppé (corps cellulaire, les axones, dendrites, et synapses). Elles envoient toutes fines lamellipode ou filopodes processus non seulement dans leur quartier, mais aussi dans les lointains environs18.
Pour la réussite de ce protocole, il est crucial d’élever des mouches à 18 ° C afin d’éviter la perméabilité du système. Lorsque la dissection et Pendant toute la procédure de coloration, il est important d’éviter d’endommager le tissu pour des résultats optimaux de coloration. Enfin, deux aspects techniques doivent être considérés : le temps du choc thermique définit la quantité de cellules dans laquelle sont exprimés les balises. Un choc thermique courte conduira à l’étiquetage de quelques cellules, alors qu’un choc thermique longue va induire l’expression de balises dans de nombreuses cellules jusqu'à le cas extrême où toutes les cassettes de FRT-stop-FRT soient écartés les journalistes, dans toutes les cellules. Dans ce cas, qu’une seule couleur (la fusion des trois balises épitope) sera présente, empêchant la visualisation des morphologies de cellule unique. Le temps de choc de chaleur varie en fonction du site d’insertion de la PIH-Flp et le chauffeur de GAL4, donc une étape d’optimisation initiale peut être nécessaire. L’expression du marqueur est aléatoire et ne peut pas être ciblée à une sous-population particulière des cellules piloté par le pilote de GAL4. Au sein d’une seule cellule, différentes balises peuvent être exprimées en permettant à la souillure d’anticorps des cellules avec différentes couleurs voisines. Toutefois, à l’occasion, plusieurs balises s’exprime dans une cellule permettant le chevauchement des deux couleurs.
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Disclosures
Aucun des auteurs ont des intérêts opposés ou contradictoires.
Acknowledgments
Les auteurs remercient Arnim Jenett, Aljoscha Nern et autres membres du laboratoire Rubin pour les conseils et le partage des réactifs non publiées et le Janelia Fly lumière équipe projet pour générer des images confocales. Les auteurs remercient également les membres du laboratoire de Gaule pour commentaires sur le manuscrit.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
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