Summary
Hücre türleri farklı morfoloji görüntülemek ve a değişiklik-in onların komşuları ile etkileşim kurmak. Bu iletişim kuralı tek hücre morfolojisi açıklamaya ve hücre-hücre etkileşim köklü Gal4/UAS ifade sistemi kullanılarak incelemek için açıklar.
Abstract
Hücreler farklı türleri morfoloji ve karmaşık anatomik ilişkileri görüntüler. Hücreleri onların komşuları ile nasıl etkileşimde bulunur? Etkileşimleri hücre tipleri arasında ya da belirli bir türün içinde farklı mıdır? Ne tür uzamsal kuralları takip ettiler? Böyle temel soru vivo yanıtları defa yüksek çözünürlüklü tek hücre etiketleme araçları eksikliği ile engel olmuştur. Burada, bir çok renkli FlpOut (MCFO) tekniği ile tek hücreleri hedef için detaylı bir protokol sağlanır. Bu yöntem iki FRT siteleri (FRT-dur-FRT) tarafından çevrili bir transkripsiyon Sonlandırıcı sessiz tutulduğu üç farklı şekilde etiketlenmiş gazetecilere (HA, bayrak ve V5) UAS kontrol altında kullanır. Isı şok nabzı rastgele tek tek hücreleri FRT-dur-FRT kaset kaldıran bir ısı şok kaynaklı Flp recombinase, ifadesi indükler: ifade yalnızca aynı zamanda bir GAL4 sürücü hızlı hücrelerinde oluşur. Bu farklı renkli hücreleri tek hücre türleri Morfoloji görselleştirme sağlar yüksek çözünürlükte bir belli bir hücre türü bir dizi yol açar. Örnek olarak, MCFO teknik türleri Morfoloji yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden görselleştirmek için belirli gliyal GAL4 sürücüleri ile kombine edilebilir.
Introduction
Glia, sinir sistemi (NS), Sigara nöronal hücre nüfusu uzun nöronlar için statik bir çerçeve sağlamak sayıyorlar ve bu nedenle ayrıntılı olarak incelenmiştir değil. Ancak, insanlar, glia hücreleri NS (~ %90) büyük çoğunluğu teşkil ve astrocytes, oligodendrocytes, microglia ve Schwann hücreleri de dahil olmak üzere, birkaç farklı kategoride toplanır. Drosophilaiçinde glia hücreleri NS yaklaşık yüzde 10'u oluşturmaktadır. Çoğu intriguingly konularda, kendi türleri morfoloji ve işlevleri omurgalılar1,2' bulunanlara benzer. Kendi türleri Morfoloji epiteli, ensheathing ve astrocyte benzeri hücreler oluşturan kan - beyin bariyerini (BBB) içerir.
Drosophila merkezi sinir sistemi (MSS) aşağıdaki temel yapıdan oluşur: nöronal hücre organları; içeren korteksin bölgeleri Sinaptik bağlantıları liman neuropils; farklı neuropiles bağlanan küçük ve büyük axon yolları; duyu organları ve kaslar MSS (şekil 1) ile bağlanan periferik sinirler. Glia anatomik yapılarla ilişkili bulunur: korteks glia (CG) kortikal bölgelerde astrocyte benzeri glia (ALG) ve neuropile bölgelerinde, ensheathing glia ensheathing glia (EG) ayrıca merkezi axon yolları ve çevre birimi ile ilişkili vardır sinirler (EGN) ve son olarak, iki sayfa benzeri glia, perineurial glia (PG) ve subperineurial (SPG), hangi birlikte tüm NS (Şekil 2) kapsayan bir bitişik katman oluşturur.
Önceki çalışmalarda bu glia göstermiştir NS; gelişiminde önemli rol oynarlar Onlar için sistemik dolaşımdaki İnsülin benzeri peptidler tepki nöronal hücre sayıları izlemek, nöronlar, astrocyte-nöron laktat Servisi gibi trofik destek sağlamak ve ölen nöronlar fagositoz3,4 tarafından ortadan kaldırmak , 5 , 6. olgun NS glia BBB korumak, nörotransmitter kadar almak ve iyonik homeostazı korumak, NS, büyük bağışıklık hücreleri olarak hareket beri makrofajlar BBB ihlal ve sinirsel aktivite yanı sıra hayvan davranışları6 modüle , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Olup farklı gliyal alt türlerinden özel işlevleri gerçekleştirmek önemli bir açık soru kalır. Ancak, glia, özellikle, Yetişkin, sistematik bir genom geniş analizi uygun genetik araçlar onların manipülasyon için eksikliği ile engel olmuştur. Burada, cep şekilleri karmaşık hücre-hücre etkileşimleri çalışmaya verimli ve kolay karakterizasyonu sağlayan bir yöntem sunulur. Bu teknik yetişkin Drosophila beyinde farklı gliyal türlerinden morfolojisi karakterize etmek için uygulanan, ancak kullanılan belirli GAL4 sürücüsüne bağlı olarak bu nöronların12,13 çalışmaya adapte , herhangi bir hücre birbirine karışmasının ve prensipte herhangi bir gelişim aşamalarında herhangi bir doku.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. hazırlama sinekler çok renkli FlpOut (MCFO) deneyleri için
Not: MCFO tekniği sözde Flp aracılı dur kaset eksizyon (FlpOut) değiştirilmiş bir sürümü anlamına gelir. Transgenik MCFO sinekler taşımak bir ısı şok organizatörü (hsp)-Flp recombinase ve farklı gazetecilere UAS altında kontrol. Her gazeteci bir myristoylated (en düşük) süper klasör yeşil flüoresan protein (sfGFP), hangi 10 kopya epitope etiketinin içinde ortak bir omurga oluşur (örn., HA, bayrak veya V5) eklenmiş olan. Elde edilen floresan proteinler olarak adlandırılan " Spagetti Canavarı GFPs " (smGFPs) 14 ve farklı epitope Etiketler karşı belirli antikor kullanılarak algılanabilir.
- Çapraz MCFO kaset ve hsp Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) ile (bkz. tablo reçetesi) uygun gliyal GAL4 sürücü satırları için uçar .
- Hsp zaten 25 ° C'de etkindir ve kaç hücre bir belirsiz etiketleme için önde gelen rekombinasyon tabi olabilir haçlar 18 ° c sisteminin leakiness önlemek için ayarlayın. 18 ° C'de F1 üretimi elde etmek için yaklaşık 20 gün bekleyin. Sonra ısı (bkz. Adım 2) darbe, 25 ° c ( şekil 3) sinekler korumak.
2. Isı şok
Not: ekleme siteye bağlı olarak, hsp-Flp verimliliğini farklı olabilir; bu nedenle, en iyi ısı şok zaman optimize edilmiş olması gerekir. Bu iletişim kuralı için bir MCFO sinek hisse senedi içinde hsp-Flp X kromozomu üzerinde takılı beri kullanılmaktadır (Tablo malzemeleri görmek).
- Transfer döl haç adım 1.1 (F1 üretimi sinekler, 3-4 gün eski) gıda ve ısı içeren yeni tüpleri içine şok onları bir su banyosu içinde 37 ° C'de.
Not: Genç sinekler (1-2 gün eski) ısı şok çok duyarlıdır. 1 veya 2 ile tedavi kaynaklanan ölüm oranı azaltmak için ısı şok gerçekleştirmeden önce gün daha beklemek. Bazı F1 üretimi uçar ısı şok olmadan bir denetim olarak kullanmak. - Isı şok sırasında stres kaynaklı ölüm oranı azaltmak için gıda ile normal şişeleri sinekli korumak. Kadın ve erkekler ayrı şişeleri koydu.
- Suda bir homojen ısı şok emin olmak için tüm şişe sokmak emin olun. 5-8 dk şok glia hücreleri birçok GAL4 sürücü satırları ile seyrek etiketleme için uygun bir başlangıç noktası olarak kullanmak; şok süresi her sürücü ve deney (daha kısa veya daha uzun ısı şok kez gerekli olabilir) için optimize edilmiş olması gerekir.
- Isı şoktan sonra ısı şoktan sinekler izni vermesi için birkaç dakika için yatay olarak bankta şişeleri yatıyordu.
Not: Bu tüpleri değiştirmek gerekli değildir. - 25 ° C'de sinekler korumak ve onları en iyi muhabir ifade için 2 veya daha fazla gün sonra ısı şok incelemek (bkz. Adım 3 ve 4).
3. Diseksiyon hazırlık ve çözümleri
- diseksiyon, günün hazırlamak 200 µL PCR tüpleri taze sabitleştirici çözümde S2 hücre kültür ortamının 180 µL % 20 paraformaldehyde (% 2 PFA çözüm elde etmek için İngiltere'de yılın) 20 µL ile karıştırılarak. Öncesi ve sırasında diseksiyon sabitleştirici çözüm buz üzerinde korumak.
Dikkat: PFA toksik ve bakımı ile ele alınması gerekir.
Not: S2 hücre kültür ortamının 160 µL % 20 paraformaldehyde (PFA) % 2 çözüm yerine % 4 İngiltere'de yılın çözüm hazırlamak için 200 µL PCR tüp içinde 40 µL karıştırın. - Bir PCR tüp genotip başına en fazla 8-10 beyin tüp başına en iyi boyama sonucu almak için kullanın.
- Hazırlamak yetişkin beyin yıkama çözüm: %0.5 sığır serum albümin, % 0.5 PBS Triton X-100.
Not: boyama üzerinde % 1'i içeren bir çözüm bağlı olarak Triton X-100 gerekli olabilir. Triton X-100 daha yüksek bir konsantrasyon antikor doku içine nüfuz artırır ve içten içe doku (Örneğin, sinaptik bölgelerde yetişkin Drosophila beyin) yalan leke bölgelere gereklidir. - Engelleme çözüm hazırlamak: % 3 normal keçi serum, % 3 normal eşek serum ve % 0,5 PBS Triton X-100.
- Yetişkin beyin yıkama çözüm ve engelleme çözüm 4 ° C'de birkaç hafta saklanabilir.
- Buzda derin depresyon wells cam levha koymak ve her doldurmak aşağıdaki çözümleri ile iyi: bir % 70 etanol, bir PBS ve S2 hücre kültür orta ile bir.
4. Yetişkin beyin diseksiyon
- 3 cm çanak bir stereomicroscope sahnesinde anatomi konumlandırın ve soğuk S2 hücre kültür orta ile doldurun. Doku diseksiyon işlem sırasında sağlıklı kalmasını sağlamak için bu ortamda tüm diseksiyonlarının kuralları.
Not: Siyah Silikon (görüntülerde) iyi bir arka plan kontrast sağlayan birkaç milimetre ile kaplı bir diseksiyon tabak kullanın ve forseps diseksiyon sırasında korumak. - CO 2 ile istenen genotip sinekler anestezi.
- İle forseps, kanatları tarafından sinek kapmak ve soğuk % 70 etanol için 30 yıkayın sonra soğuk PBS için ek 30 ile s s.
- S2 hücre kültür orta ile dolu derin depresyon iyi içine anında transfer.
- Aynı genotip tüm sinekler için aynı işlemi tekrarlayın ve doku korur diseksiyon kadar soğuk S2 hücre kültürü ortamında proje.
Not: yaklaşık 30 dk. bir zaman diliminde S2 hücre kültür orta uzun kuluçka zamanlarında disseke sinekler sayısı doku zarar verebilir sadece anestezi. - Anında Forseps ile kapmak ve S2 hücre kültür Orta hızlı bir stereomicroscope altında daldırın.
- Kafa vücudun geri kalanından ayırmak. Cesedi atmak ve S2 hücre kültürü ortamında batık kafa tutmak. Baş Forseps ile diseksiyon süresi boyunca tutmak son derece önemlidir. Baş yüzmek başlarsa, o dokuya zarar vermeden almak zor olacak.
- Her zaman en az bir Forseps ile kafa tutarak bir göz çekerek diseksiyon başlar. Forseps ucu önlemek için sadece retina altında doku zarar veriyor emin olun. Diğer gözü çekin ve beyin görünene kadar manikür kaldırma başlar. Doku temiz görünene kadar
- tüm trakeal doku ve kütikül beyin çevresinde çıkarın. Beyin en iyi boyama sonuçları için etrafında tüm trakeal doku kaldırdığınızdan emin olun; dokular şimdi sabit ve lekeli hazır.
- Soğuk S2 disseke beyinlerinde hücre kültür Orta İngiltere'de yılın çözümde fiksasyon adım zaman için aktarmadan önce korumak.
5. Yetişkin beyin boyama
< ol>Not: Kuluçka kez kullanılan antikor türüne bağlı olarak değişebilir. Uzun incubations gerekli olabilir.
- Üç MCFO işaretleri etiketleme için kuluçkaya ile beyin anti-HA (1:500), Anti-bayrak (DYKDDDDK epitope) 1: (100) ve anti-V5 birincil antikorlar.
- Birincil Birleşik-doğrudan antikorlar normal birincil + ikincil kasanın yerine kullanılan (örn., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). Bu durumda, Birleşik-doğrudan antikor ikincil antikor tedavisi.
Not: her genotip için biraz beyin boyama özgüllüğü doğrulamak için denetim tutun. Birincil antikor kuluçka atlayabilir ve doğrudan bir sonraki adıma geçin.
Not: uygun antikorlar örnekleri: AlexaFluor 488 (1:250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) ve DyLight 647 (1: 100)-Birleşik antikorlar.
6. Beyin görüntüleme için montaj
- Trim görüntüleme bir spacer uygun boyutu makas kullanarak. Yüksek çözünürlüklü mikroskopi için numune ve görüntüleme spacer iki cam coverslips arasında sandviç.
Not: Görüntüleme çubukları ince (0,12 mm kalınlığında) olan örneklerin sıkıştırma olmadan montaj sağlayan bu peel ve stick cam coverslips ya da mikroskop slaytlara yapışkanlı çubukları. - Kullanma forseps, yapışkanlı liner bir yüzeyden kaldırmak ve RONDELA, yapışkanlı yüzü aşağı, bir cam coverslip (22 mm x 60 mm) yüzey üzerinde geçerlidir. Montaj orta 10 µL uygulamak için yeni bir cam coverslip.
- İle bir P10 pipet, transfer beyin 200 µL tüpünden montaj orta damla yanında coverslip. Dokular ile birlikte, çözüm beyni korumak için bazı PBS transfer.
- İle bir P10 pipet, PBS miktarını sınırlamak çalışıyor montaj orta damla için PBS beyin taşıyın. Numuneler montaj orta coverslip görüntüleme rondela ile aktarmak. Numune karşılamak için yeterli montaj medya kullanın.
- Diğer yapışkan liner rondela üst taraftan kaldırın ve cam coverslip örnekler üzerine ekleyin. Bir pens ucu ile mühürlemek için yapışkan alan üzerinde hafif bir basınç uygulayın. Hemen bağlı doku görüntü veya daha sonraki analizler için-20 ° C'de slaytları depolama.
7. Görüntü alma
- confocal floresan görüntüleri bir 40 X confocal mikroskop kullanarak edinme yığını (NA = 1.2, su daldırma) amaç veya 63 X (NA 1.4, yağı daldırma =) amaç (piksel boyutları 1024 x 1024 xy düzlemde; = İki confocal bölümleri arasındaki uzaklığı 0,5 µm =). Dedektör kazanç ve böyle bir şekilde doymuş piksel ve sıfır piksel değerlerini görüntüleri mevcut her kanaldaki uzaklığı ayarlamak; Bu bilgi kaybını önler ve Dedektör tam dinamik aralığının sağlar.
Not: 3D görüntüleme zaman alıcı olduğu için ölçümler paralel farklı yerlerde birden fazla örnekleri tarayarak otomatikleştirilebilir. Buharlaşma ile su daldırma amaç önlemek için özel yağ daldırma orta Kırılma indisi n ile kullanın 1.33 =. - Confocal yığınlar için maksimum yoğunluk projeksiyon, kanal renk ve parlaklık ayarı değişiklikleri işlemek ve herhangi bir standart resim analiz yazılımı kullanarak kontrast (Tablo malzemeleri görmek).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu bölümde yetişkin Drosophila beyinde MCFO tekniği kullanılarak elde sonuçları örnekleri gösterilmektedir. Şekil 3 yönteminin şematik gösterir. Üç farklı membran öğesini gazetecilere (en düşük myr-smGFP-HA, en düşük myr-smGFP-bayrak ve en düşük myr-smGFP-V5) UAS kontrol altında iki FRT siteleri (FRT-dur-FRT) tarafından çevrili bir transkripsiyon Sonlandırıcı tarafından sessiz tutulur. Isı şok nabzı rastgele tek tek hücreleri FRT-dur-FRT kaset kaldıran Flp recombinase ifadesi indükler. Bu farklı renkli hücre kullanılan GAL4 sürücüsünün tarafından belirtilen bir belli bir hücre tipinin bir dizi yol açar.
Genel olarak, yedi renk mümkündür. Şekil 4 ve şekil 5 EG ve ALG hücre tek türleri Morfoloji Drosophila antennal LOB (AL), sırasıyla gösterir. GAL4 sürücüsü, türüne bağlı olarak etiketli hücreleri artan miktarda ısı şok zaman artan bu nedenle ısı şok Protokolü'nün ilk bir optimizasyon gereklidir neden olmaktadır. Şekil 6 EG Drosophila optik LOB (OL) tek MCFO gazetecilere etiketleme göstermektedir.
Resim 1: Yetişkin Drosophila NS anatomisi. Neuropile bölgeler (mavi bölgeler) sinaptik bağlantıları içeren (gri alanlar noktalı) kortikal bölgelerde tüm nöronal ve çoğu gliyal hücreye organlarının içerir. Yolu bölgeleri (koyu mavi) farklı neuropiles bağlayın. Bu rakam Kremer ve ark. değiştirildi (2017) 18. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: genel gliyal alt türlerinden Drosophila CNS. Belirli GAL4 sürücüleri tarafından tahrik membran öğesini GFP (UAS-mCD8-GFP) muhabir beş genel gliyal türlerinden görselleştirme sağlar (PG: perineurial glia, SPG: subperineurial glia, CG: korteks glia, ALG: astrocyte benzeri glia ve EG: ensheathing glia). Neuropil bölgeler (macenta alanlar) presynaptic işaret NC82 (BRUCHPILOT) ile tespit edilir. Alt kısmında hücre sayımları için farklı gliyal alt türlerinden de gösterilir. Ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: geçiş düzeni MCFO tekniği için. Şematik MCFO tekniği. Homozygousvirgins taşıma MCFO kaset ve hsp Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) belirli homozigoz GAL4 sürücü erkek ile çarpı işareti vardır. F1 sonra ısı şok olduğunu. Rastgele gazetecilere kaldırıldı FRT-dur-FRT kaset sayısına göre yedi farklı renk mümkündür. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4: ensheathing glia (EG) antennal LOB (AL) Morfoloji. Confocal z-yığınları Drosophila AL wholemount immunostaining sonra. (A)Morfoloji, presynaptic işaret NC82 (BRUCHPILOT) ile tespit AL. (B-D) Stokastik EGcells etiketleme indüklenen ısı şok kez artırarak: 8 dk (B), 8.5 dk (C) ve 10 dk (D). EG almak birçok farklı şekil ve büyüklükte, onlar ensheath AL. Neighboring yüzeyine örneğin kısmen interdigitate ama kapak temas bölgelerinde farklı alanlara hücreleri. Ölçek çubuğu 20 µm. HA =: insan grip hemagglutinin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: astrocyte benzeri glia (ALG) antennal LOB (AL) Morfoloji. Confocal z-yığınları Drosophila AL wholemount immunostaining sonra. AL(a)Morfoloji tespit presynaptic işaretçisiyle NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stokastik ALG hücrelerinin etiketleme indüklenen ısı şok kez artırarak: 8 dk (B), 10 dk (C) ve (D) 15dk. ALG Haritayı değişken boyutu ve türleri Morfoloji ama büyük ölçüde örtüşen alanlarını kapsar. Ölçek çubuğu 20 µm. HA =: insan grip hemagglutinin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6: ensheathing glia (EG) optik LOB (OL) Morfoloji. Confocal z-yığınları Drosophila OL wholemount immunostaining sonra. (A-C) En düşük myr-smGFPs HA, bayrak ve V5 ile üç durak-kaset muhabirlerle etiketleme MCFO. FLP recombinase 10 dk ısı şok 37 ° C'de tarafından indüklenen (A-C) Bireysel MCFO gazetecilere ve birleştirme (D) gösterilir. Ölçek çubuğu 20 µm. HA =: insan grip hemagglutinin. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu iletişim kuralı bir doku yüksek çözünürlükte ilgi içinde farklı hücre türleri morfolojisi çalışmaya kolay ve etkin bir yöntem açıklanır. MCFO tekniği ile farklı epitope etiketleri ile birden fazla gazetecilere çok renkli Stokastik (Şekil 2) etiketleme için birlikte kullanılır. Benzer şekilde Brainbow/Flybow15,16,17gibi diğer yöntemleri, MCFO hücre-hücre etkileşim çalışmaları için hücre kenarlıklarını görüntüleme sağlayan etiket çeşitlilik işaret coexpression, aracılığıyla artırır. Örneğin, üç gazeteci, yedi potansiyel işareti kombinasyon mümkündür. Önceki etiketleme yöntemlerine göre MCFO teknik yoğunluğu17etiketleme hücre daha hassas ve kolay kontrolünü gösterir: Flybow 1.0 sinekler hızlı tek hücre daha zor; etiketleme yapar bir varsayılan işaretçisi Flybow 2.0 sinekler iki farklı Flp adlandırılan sistem daha karmaşık hale ifade gerektirir.
Kullanılan belirli GAL4 sürücü bağlı olarak MCFO teknik gelişim herhangi bir aşamada herhangi bir doku çalışmaya adapte olabilir. Burada, teknik morfolojisi yüksek çözünürlükte yetişkin Drosophila beyinde genel gliyal türlerinden karakterize etmek için uygulanmıştır. Çok renkli tek hücreleri etiketleme farklı sınırları görselleştirme sağlar ve, örneğin, iki bitişik hücreler arasında kayma etkileşim anlamada yardımcı olur; form epiteli için döşeme, gliyal diğer alt türlerini göstermek içindir PNG ve SPG hücreleri dışında işte onlar en aza indirmek gliyal onların komşuları ile temas saran nöronal yuvası ile temas en üst düzeye (hücre gövdesi, akson, dendrites, ve sinapsların). Hepsi iyi lamellipodial veya filopodial işlemi sadece yerel onların komşuları içine aynı zamanda uzak çevresi18içine gönderin.
Bu iletişim kuralı başarı için sinekler 18 ° c leakiness içinde belgili tanımlık sistem önlemek için arka çok önemlidir. Diseksiyon ve tüm boyama prosedürü boyunca zaman herhangi bir hasar vermemek için kartı doku boyama en iyi sonuçlar için önemlidir. Son olarak, dikkate alınması gereken iki teknik yönü var: ısı şok zaman hücre hangi etiketleri ifade belirler. Bir kısa ısı şok bir uzun ısı şok olan aşırı durumda kadar birçok hücrelerdeki bütün Üniversiteninönünde-dur-FRT kaset tüm hücrelerdeki gazetecilere gelen kaldırılır Etiketler ifade neden iken birkaç hücreleri, etiketleme için yol açacaktır. Bu durumda, yalnızca bir renk (üç epitope Etiketler birleştirme) tek hücre türleri Morfoloji görselleştirme önlenmesi mevcut, olacaktır. Isı şok zaman bu nedenle bir ilk optimizasyon adım gerekli olabilir hsp-Flp ve GAL4 sürücü ekleme siteye bağlı olarak değişir. Marker ifade rasgele ve GAL4 sürücü tarafından tahrik hücrelerin belirli bir subpopulation için hedeflenemediği. Bir hücre içinde farklı Etiketler hücreler farklı renkler ile komşu antikor boyama etkinleştirme ifade edilebilir. Ancak, zaman zaman, birden fazla etiket iki renk çakışma için önde gelen bir hücredeki ifade edilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Hiçbiri-in belgili tanımlık yazar rakip veya çakışan ilgi alanlarına sahip.
Acknowledgments
Yazarlar Arnim Jenett, Aljoscha Nern ve Rubin laboratuvar tavsiye için diğer üyeleri ve yayınlanmamış reaktifler ve Janelia uçmak ışık projesi confocal görüntüleri oluşturmak için takım paylaşım teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca el yazması üzerinde yorumlar için Galya laboratuvar üyeleri teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P.
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
