Summary
Celler Visa olika morfologier och upprätta en mängd interaktioner med sina grannar. Det här protokollet beskriver hur att avslöja morfologi av enstaka celler och utreda cell-cell interaktioner med hjälp av väletablerade Gal4/UAS uttryck systemet.
Abstract
Celler visar olika morfologier och komplexa anatomiska förhållanden. Hur samspelar celler med sina grannar? Skiljer samspelet mellan celltyper eller även inom en given typ? Vilka typer av rumsliga regler följer de? Svaren på sådana grundläggande frågor i vivo har hämmats hittills av en brist på verktyg för hög upplösning enskild cell märkning. Här finns ett detaljerat protokoll att rikta enstaka celler med en MultiColor FlpOut (MCFO)-teknik. Denna metod bygger på tre olika märkta reportrar (HA, flagga och V5) under UAS kontroll som är teg av en transkriptionell terminator flankerad av två FRT platser (FRT-stopp-FRT). En värme chock puls inducerar uttryck av en värme chock-inducerad Flp recombinase, som slumpmässigt tar bort FRT-stopp-FRT kassetter i enskilda celler: uttryck förekommer endast i celler som uttrycker också en GAL4 drivrutin. Detta leder till en mängd olikfärgade cellerna i en viss celltyp som möjliggör visualisering av enskild cell morfologier med hög upplösning. Som ett exempel, kan den MCFO tekniken kombineras med specifika gliaceller GAL4 drivrutiner att visualisera morfologier de gliaceller subtyperna i den vuxna hjärnan Drosophila .
Introduction
Glia, icke-neuronala cell befolkningen i nervsystemet (NS), tros länge ge en statisk ram för nervceller och därför studerades inte i detalj. Men hos människor, glia utgör den stora majoriteten av celler i NS (~ 90%) och delas in i flera olika kategorier, inklusive astrocyter, oligodendrocyter, mikroglia och Schwann celler. I Drosophila, glia utgör ca 10% av cellerna i NS. Fängslande, är deras morfologier och funktioner anmärkningsvärt liknande de som finns i ryggradsdjur1,2. Deras morfologier inkluderar blod - hjärnbarriären (BBB) bildar epitel, ensheathing och Astrocyten-liknande celler.
Drosophila centrala nervsystemet (CNS) består av följande huvudsakliga strukturer: cortex regioner som innehåller de neuronala cell organ; neuropils som hamnen synapsförbindelser; små och stora axon skrifter som ansluter den olika neuropiles; perifera nerver som förbinder sensoriska organ och muskler med CNS (figur 1). Glia finns associerade med alla dessa anatomiska strukturer: Cortex glia (CG) i kortikala regionerna, astrocyt-liknande glia (ALG) och ensheathing glia (t.ex.) i neuropile regioner, ensheathing glia är också associerade med centrala axon skrifter och perifera nerver (EGN), och slutligen två blad-liknande glia, perineurial glia (PG) och subperineurial (SPG), som tillsammans bildar ett sammanhängande lager som täcker hela NS (figur 2).
Tidigare studier har visat att glia spelar viktiga roller i utvecklingen av NS; de övervaka neuronala cell nummer genom att reagera på systemiskt cirkulerande insulin-liknande peptider, ge trofiska stöd till nervceller, såsom Astrocyten-neuron laktat shuttle, och eliminera döende nervceller genom fagocytos3,4 , 5 , 6. i mogen NS, glia behålla BBB, ta upp signalsubstanser och upprätthålla Joniska homeostas, fungera som stora immuncellerna i NS, eftersom makrofager inte kan bryter mot BBB, och modulera synaptisk aktivitet samt djurs beteende6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11.
Huruvida de gliaceller subtyperna utföra specialiserade funktioner förblir en viktig öppen fråga. Dock har en systematisk genome-wide analys av glia, särskilt i vuxen, hämmats av brist på lämpliga genetiska verktyg för deras manipulation. Här presenteras en metod som möjliggör en effektiv och enkel karakterisering av cell-former för att studera komplexa cell-cell interaktioner. Denna teknik har tillämpats för att karakterisera morfologi av olika gliaceller undertyper i den vuxna hjärnan Drosophila , men, beroende på den specifika GAL4 drivrutin som används, kan det anpassas för att studera nervceller12,13 , någon form av blandning celler, och i princip alla vävnader i alla utvecklingsstadier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. förbereda flugor för MultiColor FlpOut (MCFO) experiment
Obs: The MCFO teknik refererar till en modifierad version av den så kallade Flp-medierad stop kassett excision (FlpOut). Transgena MCFO flugor bär värme chock främjare (hsp)-Flp recombinase och olika reportrar under UAS kontroll. Varje reporter består av en gemensam ryggraden i en myristoylated (myr) super mapp grönt fluorescerande protein (sfGFP), i vilken 10 exemplar av en epitop tagg (t.ex., HA, flagga eller V5) har infogats. De resulterande icke fluorescerande proteinerna namnges " spaghettimonstret GFPs " (smGFPs) 14 och kan upptäckas med hjälp av specifika antikroppar mot olika epitop taggarna.
- Korset flyger med MCFO kassett och det hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) till de lämpliga gliaceller GAL4 driver linjerna (se tabell för material) .
- Som hsp redan är aktiv vid 25 ° C och några celler kan genomgå rekombination leder till en ospecifik märkning, ställa in korsar vid 18 ° C för att undvika leakiness av systemet. Vänta cirka 20 dagar vid 18 ° C till få F1-generationen. Efter värmen chock (se steg 2), upprätthålla flugor vid 25 ° C ( figur 3).
2. Värme chock
Obs: beroende på insticksstället, effektiviteten i det hsp-Flp skilja; optimal värme chock tiden har därför optimeras. För detta protokoll, en MCFO flyga lager där det hsp-Flp sattes in på X-kromosomen har använts (se Tabell för material).
- Överföring avkomman av korset i steg 1,1 (F1 generationen flugor, 3-4 dagar gamla) till nya injektionsflaskor innehållande mat och värme chock dem vid 37 ° C i ett vattenbad.
Obs: Unga flugor (1-2 dagar gamla) är mycket känsliga för värme chock. Vänta 1 eller 2 dagar innan du utför den värme chocken för att minska dödligheten orsakas av behandlingen. Använd några av F1-generationen flyger som en kontroll, utan värme chock. - Under den värme chocken, upprätthålla flugor i normala injektionsflaskor med mat för att minska om stressinducerade dödligheten. Sätta honor och hanar i separata flaskor.
- Kontrollera att doppa hela flaskan i vattnet för att säkerställa en homogen värme chock. Använda en 5-8 min chock som en lämplig utgångspunkt för glesa märkning av gliaceller med många GAL4 driver linjer; chock varaktighet måste optimeras för varje förare och experiment (kortare eller längre värme chock gånger kan behövas).
- Efter den värme chocken, lekmanna-injektionsflaskorna horisontellt på bänken för några minuter så att flugorna att återhämta sig från den värme chocken.
Obs: Det är inte nödvändigt att ändra injektionsflaskorna. - Upprätthålla flugor vid 25 ° C och dissekera (se steg 3 och 4) dem 2 eller fler dagar efter värme chock för optimal reporter uttryck.
3. Dissektion förberedelse och lösningar
- dagen för dissekering, förbereda färska fixativ lösning i 200 µL PCR-rören genom att blanda 180 µL av S2 cellodlingsmedium med 20 µL av 20% PARAFORMALDEHYD (PFA) för att få en lösning med 2% i PFA. Upprätthålla fixativ lösningen på is före och under dissektion.
Försiktighet: PFA är giftigt och måste hanteras med försiktighet.
Obs: Blanda 160 µL av S2 cellodlingsmedium med 40 µL 20% PARAFORMALDEHYD (PFA) i en 200 µL PCR-röret att förbereda en 4% PFA lösning istället för en 2-procentig lösning. - Använd en PCR-röret per genotyp med högst 8-10 hjärnor per rör för optimal färgning resultat.
- Förbereda den vuxna hjärnan tvättlösningen: 0,5% bovint serumalbumin, 0,5% Triton x-100 i PBS.
Beroende på färgningen, en lösning som innehåller 1% kan Triton x-100 behövas. En högre koncentration av Triton x-100 ökar genomträngningen av antikroppen i vävnaden och det är nödvändigt att fläcken regioner som ligger djupt inne i vävnaden (t.ex. synaptic regioner i den vuxna hjärnan Drosophila). - Bereda blockerande lösning: 3% normala get serum, 3% normala åsna serum och 0,5% Triton x-100 i PBS.
- Den vuxna hjärnan tvättmaskin lösning och blockerande lösningen kan förvaras vid 4 ° C för ett par veckor.
- Pålagt isen djup depression brunnar glasplatta och fyll varje brunn med följande lösningar: en med 70% etanol, en med PBS och en med S2 cellodlingsmedium.
4. Vuxna hjärnan dissektion
- Placera en 3 cm dissekera maträtt på scenen av ett stereomikroskop och fyll den med kallt S2 cellodlingsmedium. Genomföra alla dissektionerna i detta medium så att vävnaden förblir friska under förfarandet för dissektion.
Obs: Använd en dissekera maträtt som kantas av flera millimetrar av svart silikon som ger en bra bakgrund kontrast (i bilderna) och bevara tången under dissektion. - Söva flugor av önskad genotyp med CO 2.
- Med pincett, ta i farten av wings och tvätta den i kalla 70% etanol för 30 s, sedan med kallt PBS för ytterligare 30 s.
- Överför i farten till den djupa depressionen väl som är fylld med S2 cellodlingsmedium.
- Upprepa samma procedur för alla flugor av samma genotyp och behålla dem i kall S2 cellodlingsmedium tills dissektion, som kommer att bevara vävnaden.
Obs: Söva bara antalet flugor som kan vara dissekeras i en tidsperiod på ca 30 min. långa inkubationstider i S2 cellodlingsmedium kan skada vävnaden. - Ta flugan med pincett och, enligt ett stereomikroskop, dränka i farten i S2 cellodlingsmedium.
- Loss huvudet från resten av kroppen. Ignorera kroppen och hålla huvudet nedsänkt i S2 cellodlingsmedium. Det är oerhört viktigt att hålla huvudet med pincett för hela dissektion. Om huvudet börjar flyta, blir det svårt att hämta det utan att skada vävnaden.
- Påbörja dissekering genom att dra ut ett öga, medan du håller huvudet med minst en pincett vid alla tidpunkter. Se till att spetsen på tången strax under näthinnan att undvika skadar vävnaden under. Dra ut det andra ögat och börja ta bort nagelbanden tills hjärnan visas.
- Bort alla luftrör vävnad och nagelband runt hjärnan tills vävnaden visas ren. Se till att ta bort alla luftrör vävnad runt hjärnan för optimal färgning resultat; vävnaderna är nu redo att vara fixeras och färgas.
- Upprätthålla alla dissekerade hjärnor i kalla S2 cell odlingsmedium innan du överför dem i PFA-lösningen för att gången steget fixering.
5. Vuxna hjärnan färgning
< ol>Obs: Inkubationstider kan variera beroende på vilken typ av antikropp används. Längre inkubationer kan vara nödvändigt.
- För märkning av de tre MCFO markörerna, inkubera hjärnor med anti-HA (1: 500), anti-Flag (DYKDDDDK epitop) (1: 100), och anti-V5 primära antikroppar.
- Primära direkt-konjugerade antikroppar kan användas i stället för den normala primär + sekundär kombinationen (t.ex., anti-V5:DyLight 549 (1: 200)). I detta fall behandla direkt-konjugerade antikroppar som sekundära antikroppar.
Obs: För varje genotyp, hålla vissa hjärnor som kontroller för att verifiera specificitet färgningen. Hoppa över primär antikropp ruvning och gå direkt till nästa steg.
Anmärkning: exempel på lämpliga antikroppar: AlexaFluor 488 (1: 250), anti-V5:DyLight 549 (1: 200) och DyLight 647 (1: 100)-konjugerade antikroppar.
6. Montering av hjärnor för Imaging
- Trim an imaging spacer till lämplig storlek med sax. För högupplösande mikroskopi, smörgås förlagan och imaging distanshylsan mellan två glas coverslips.
Obs: Imaging distanser är tunn (0,12 mm tjock) självhäftande distanser som skal och sticka till coverslips eller Mikroskop glasskivor, möjliggör montering av exemplar utan komprimering. - Med pincett, ta bort självhäftande liner från en yta och tillämpa den spacer, självhäftande sidan nedåt, på ytan av ett täckglas (22 x 60 mm). Gälla en nya täckglas 10 µL monteringsmedium.
- Med ett P10 pipett, överföra hjärnor från 200 µL röret till täckglaset, bredvid släpp av monteringsmedium. Tillsammans med vävnaderna, överföra vissa PBS för att upprätthålla hjärnor i lösning.
- Med ett P10 pipett, flytta hjärnor från PBS till släpp av monteringsmedium försöker begränsa mängden PBS. Överföra exemplar monteringsmedium på täckglas med imaging mellanlägget. Använd tillräckligt montering media för att täcka exemplaret.
- Bort andra självhäftande liner från ovansidan av mellanlägget och lägga till ett täckglas ovanpå exemplaren. Med en pincett, applicera ett lätt tryck över området lim för att försegla. Bild monterade vävnader omedelbart eller lagra bilderna vid-20 ° C för senare analys.
7. Bild förvärv
- förvärva travar av confocal fluorescens bilder med confocal Mikroskop med 40 X (NA = 1,2, nedsänkning i vatten) mål eller 63 X (NA = 1,4, oljeimmersion) mål (pixel storlekar = 1 024 x 1 024 i xy-planet; Avståndet mellan två confocal sektioner = 0,5 µm). Justera detektorn gain och offset i varje kanal på ett sådant sätt att inga mättade pixlar och nollvärden pixel finns i bilderna; Detta undviker förlust av information och säkerställer användning av det fulla dynamiska omfånget av detektorn.
Obs: Eftersom 3D imaging är tidskrävande, mätningarna kan automatiseras genom att skanna flera prover parallellt på olika platser. För att undvika avdunstning med målsättningen vatten nedsänkning, använda speciell olja nedsänkning medium med brytningsindex n = 1.33. - Bearbeta de confocal stackarna för maximal täthet projektioner, förändringar i kanal nyans och justering av ljusstyrka och kontrast med någon standard bild analys programvara (se Tabell för material).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta avsnitt visar exempel på resultat som kan erhållas med hjälp av den MCFO tekniken i den vuxna hjärnan Drosophila . Figur 3 visar en schematisk av metoden. Tre olika membran-taggade reportrar (myr-smGFP-HA, myr-smGFP-flaggan och myr-smGFP-V5) under UAS kontroll hålls tyst av en transkriptionell terminator flankerad av två FRT platser (FRT-stopp-FRT). En värme chock puls inducerar uttryck av Flp recombinase som slumpmässigt tar bort FRT-stopp-FRT kassetter i enskilda celler. Detta leder till en mängd olikfärgade cellerna i en viss celltyp, som anges av GAL4 drivrutinen används.
Övergripande, sju färger är möjliga. Figur 4 och figur 5 visar de enda morfologier EG och ALG celler i den Drosophila antennal lob (AL), respektive. Ökande värme chock tid inducerar en ökad mängd märkta celler, beroende på vilken typ av GAL4 förare, en initial optimering av värme chock protokollet är därför nödvändigt. Figur 6 visar märkning av EG i den Drosophila optic lob (OL) med enda MCFO reportrar.
Figur 1: Anatomi av de vuxna Drosophila NS. De kortikala regioner (prickig grå områden) innehåller alla de neuronala och de flesta av glial cell organ, medan de neuropile regionerna (blå områden) innehåller synapsförbindelser. Tarmkanalen regioner (mörkblå) ansluta de olika neuropiles. Denna siffra har ändrats från Kremer et al. (2017) 18. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: generiska gliaceller undertyper i Drosophila CNS. Membran-taggade GFP (UAS-mCD8-GFP) reporter drivs av specifika GAL4 drivrutiner tillåter visualisering av de fem generiska gliaceller undertyperna (PG: perineurial glia, SPG: subperineurial glia, CG: cortex glia, ALG: Astrocyten-liknande glia och EG: ensheathing glia). De neuropil regionerna (magenta områden) identifieras med den presynaptiska markören NC82 (BRUCHPILOT). Längst ner visas också blodkroppar för de olika gliaceller undertyperna. Skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 3: passage system för MCFO tekniken. Schematisk bild av MCFO tekniken. Homozygousvirgins bär MCFO kassett och det hsp-Flp (hsp-Flp; 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA,10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, 10XUAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5) korsas med specifika homozygot GAL4 driver hanar. F1-generationen är sedan värme chockad. Beroende på antalet FRT-stopp-FRT kassetter slumpmässigt bort från reportrar, är sju olika färger möjliga. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: morfologi av ensheathing glia (t.ex.) i den antennal lob (AL). Confocal z-högar av Drosophila AL efter wholemount immunfärgning. (A) morfologi av AL identifieras med den presynaptiska markören NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stokastiska märkning av EGcells induceras av ökande värme chock gånger: 8 min (B), 8,5 min (C) och 10 min (D). T.ex ta på många olika former och storlekar, som de ensheath ytan av den AL. Neighboring t.ex celler täcker olika områden men delvis interdigitate i regioner i kontakt. Skalstapeln = 20 µm. HA: mänsklig influensa hemagglutinin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: morfologi av Astrocyten-liknande glia (ALG) i den antennal lob (AL). Confocal z-högar av Drosophila AL efter wholemount immunfärgning. (A) morfologi av AL identifieras med den presynaptiska markören NC82 (BRUCHPILOT). (B-D) Stokastiska märkning av ALG celler induceras av ökande värme chock gånger: 8 min (B), 10 min (C) och 15 min (D). ALG Visa variabel storlek och morfologier men täcker i stort sett icke-överlappande områden. Skalstapeln = 20 µm. HA: mänsklig influensa hemagglutinin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: morfologi av ensheathing glia (t.ex.) i den optic lob (OL). Confocal z-högar av Drosophila OL efter wholemount immunfärgning. (A-C) MCFO märkning med tre stopp-kassett reportrar med HA, flagga och V5 myr-smGFPs. FLP recombinase förmåddes av en 10 min värme chock vid 37 ° C. (A-C) Enskilda MCFO reportrar och sammanfoga (D) visas. Skalstapeln = 20 µm. HA: mänsklig influensa hemagglutinin. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Det här protokollet beskriver en enkel och effektiv metod för att studera morfologi av olika celltyper i en vävnad av intresse med hög upplösning. Med MCFO teknik används flera reportrar med olika epitop Taggar i kombination för multicolor stokastiska märkning (figur 2). Liknar andra metoder såsom Brainbow/Flybow15,16,17, MCFO ökar etikett mångfalden genom markör coexpression, möjliggör visualisering av cellgränserna för cell cell interaktionsstudier. Till exempel med tre reportrar är sju potentiella markör kombinationer möjliga. MCFO tekniken jämfört med tidigare märkning metoder, och visar en mer exakt och enkel kontroll av cellen märkning densitet17: Flybow 1.0 flugor express standard markör som gör enstaka cell märkning svårare; Flybow 2.0 flugor kräver ett uttryck för två olika Flp rekombinaser att göra systemet mer komplicerat.
Beroende på den specifika GAL4 drivrutin som används, kan den MCFO tekniken anpassas till studera någon vävnad på alla utvecklingsstadier. Här, har tekniken använts för att karakterisera morfologi av generiska gliaceller undertyper i den vuxna Drosophila hjärnan med hög upplösning. Multicolor märkning av enstaka celler möjliggör visualisering av olika gränser och hjälper till att förstå, till exempel rumsliga samspelet mellan två angränsande celler; Förutom de PNG och SPG celler, som är avsedda att bilda epitel, alla andra gliaceller subtyper Visa plattsättning, det är de minimera kontakt med sina gliaceller grannar, samtidigt maximera kontakt med höljeförsedda neuronala facket (cellkroppen, axoner, dendriter, och synapser). Alla skicka fina lamellipodial eller filopodial processer inte bara i deras lokala stadsdel utan också in i fjärran omgivning18.
För att lyckas med detta protokoll är det viktigt att bakre flugor vid 18 ° C för att undvika leakiness i systemet. När dissekera och under hela färgning förfarandet, är det viktigt att undvika skada på vävnaden för optimal färgning resultat. Slutligen två tekniska aspekter måste beaktas: värme chock tiden anger mängden celler som taggarna är uttryckta. En kort värme chock kommer leda till märkning av ett fåtal celler, medan en lång värme chock kommer inducerar uttryck av taggar i många celler upp till det extrema fallet där alla FRT-stopp-FRT kassetter bort från reportrar, i alla celler. I detta fall kommer endast en färg (sammanfogningen av de tre epitop taggarna) att närvara, att förhindra visualisering av enstaka cell morfologier. Värme chock tiden varierar beroende på insticksstället det hsp-Flp och GAL4 drivrutin, en initial optimering steg kan därför nödvändigt. Markör uttrycket är slumpmässiga och kan inte riktas till en specifik subpopulation av celler som drivs av GAL4 drivrutinen. Inom en cell, kan olika Taggar uttryckas att aktivera antikropp färgningen på angränsande celler med olika färger. Dock ibland, är mer än en tagg uttryckt i en cell leder till överlappningen av två färger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Ingen av författarna har konkurrerande eller motstridiga intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Arnim Jenett, Aljoscha Nern och andra medlemmar av Rubin laboratoriet för rådgivning och utbyte av opublicerade reagenser och Janelia flyga ljus projektgruppen för att generera confocal bilder. Författarna också tacka medlemmarna i Gallien laboratoriet för synpunkter på manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Water bath | Grant | GD100 | |
| PCR tubes | Sarstedt | 72.737.002 | |
| Forceps | Dumont | 11251-20 | |
| Dissecting dish 30 mm x 12 mmm | Electron Microscopy Sciences | 70543-30 | Glass dissection dish |
| Pyrex 3 Depression Glass Spot Plate | Corning | 7223-34 | Glass dissection plates |
| Sylgard Black | SYLGARD, Sigma-Aldrich | 805998 | home made with charcoal |
| ExpressFive S2 cell culture medium | Invitrogen | 10486-025 | |
| 20% PFA | Electron Microscopy Sciences | 15713 | |
| Triton X-100 | Roth | 3051.3 | |
| Normal goat serum | Jackson Laboratories | 005-000-121 | |
| Normal donkey serum | Jackson Laboratories | 017-000-121 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A9647 | |
| Rabbit HA-tag | Cell Signaling | C29F4 | Primary antibody, dilution 1:500 |
| Rat FLAG-tag | Novus Biologicals | NBP1-06712 | Primary antibody, dilution 1:100 |
| Mouse V5-tag:DyLight 549 | AdSerotec | 0411 | Conjugated antibody, dilution 1:200 |
| anti-rabbit AlexaFluor 488 | Invitrogen | A11034 | Secondary antibody, dilution 1:250 |
| anti-rat DyLight 647 | Jackson Laboratories | 712-605-153 | Secondary antibody, dilution 1:100 |
| Vecta Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| SlowFate Gold | Invitrogen | S36937 | |
| Secure Seal Spacer | Grace Biolabs | Contact company for ordering | |
| Microscope cover glass 22 X 60 mm | Marienfeld | 101152 | |
| Microscope cover glass 22 x 22 mm | Roth | H874 | |
| Stereo Microscope, Leica MZ6 | Leica | ||
| Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss | ||
| Immersol | Zeiss | 518 F | Immersion oil for fluorescence-microscopy, halogen free |
| Immersol | Zeiss | W 2010 | Immersion fluid for water-immersion objectives, halogen free |
| R56F03-GAL4 (EG) | Bloomington Stock Center | 39157 | GAL4 driver |
| R86E01-GAL4 (ALG) | Bloomington Stock Center | 45914 | GAL4 driver |
| hspFlpPestOpt; UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-HA, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-FLAG, UAS-FRT-stop-FRT-myr-smGFP-V5 | Bloomington Stock Center | 64085 | UAS reporter (https://bdscweb.webtest.iu.edu/stock/misc/mcfo.php) |
| Fiji (Image J) | Image analysis software | ||
| Multi Time Macro | Zeiss | Software for automated scanning |
References
- Freeman, M. R., Doherty, J. Glial cell biology in Drosophila and vertebrates. Trends Neurosci. 29 (2), 82-90 (2006).
- Stork, T., Bernardos, R., Freeman, M. R. Analysis of glial cell development and function in Drosophila. Cold Spring Harb Protoc. 2012 (1), 1-17 (2012).
- Corty, M. M., Freeman, M. R. Cell biology in neuroscience: Architects in neural circuit design: Glia control neuron numbers and connectivity. J Cell Biol. 203 (3), 395-405 (2013).
- Hidalgo, A., Kato, K., Sutcliffe, B., McIlroy, G., Bishop, S., Alahmed, S. Trophic neuron-glia interactions and cell number adjustments in the fruit fly. Glia. 59 (9), 1296-1303 (2011).
- Liu, J., Speder, P., Brand, A. H. Control of brain development and homeostasis by local and systemic insulin signalling. Diabetes Obes Metab. 16, Suppl 1. 16-20 (2014).
- Kurant, E., Axelrod, S., Leaman, D., Gaul, U. Six-microns-under acts upstream of Draper in the glial phagocytosis of apoptotic neurons. Cell. 133 (3), 498-509 (2008).
- Barres, B. A. The mystery and magic of glia: a perspective on their roles in health and disease. Neuron. 60 (3), 430-440 (2008).
- Edenfeld, G., Stork, T., Klambt, C. Neuron-glia interaction in the insect nervous system. Curr Opin Neurobiol. 15 (1), 34-39 (2005).
- Oland, L. A., Tolbert, L. P. Key interactions between neurons and glial cells during neural development in insects. Annu Rev Entomol. 48, 89-110 (2003).
- Stork, T., Sheehan, A., Tasdemir-Yilmaz, O. E., Freeman, M. R. Neuron-glia interactions through the Heartless FGF receptor signaling pathway mediate morphogenesis of Drosophila astrocytes. Neuron. 83 (2), 388-403 (2014).
- Zwarts, L., Van Eijs, F., Callaerts, P.
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Svoboda, K., Rubin, G. M. Multiple new site-specific recombinases for use in manipulating animal genomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (34), 14198-14203 (2011).
- Nern, A., Pfeiffer, B. D., Rubin, G. M. Optimized tools for multicolor stochastic labeling reveal diverse stereotyped cell arrangements in the fly visual system. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (22), E2967-E2976 (2015).
- Viswanathan, S., Williams, M. E., Bloss, E. B., Stasevich, T. J., Speer, C. M., Nern, A., Pfeiffer, B. D., Hooks, B. M., Li, W. P., English, B. P., Tian, T., Henry, G. L., Macklin, J. J., Patel, R., Gerfen, C. R., Zhuang, X., Wang, Y., Rubin, G. M., Looger, L. L. High-performance probes for light and electron microscopy. Nat Methods. 12 (6), 568-576 (2015).
- Livet, J., Weissman, T. A., Kang, H., Draft, R. W., Lu, J., Bennis, R. A., Sanes, J. R., Lichtman, J. W. Transgenic strategies for combinatorial expression of fluorescent proteins in the nervous system. Nature. 450 (7166), 56-62 (2007).
- Hampel, S., Chung, P., McKellar, C. E., Hall, D., Looger, L. L., Simpson, J. H. Drosophila Brainbow: A recombinase-based fluorescence labeling technique to subdivide neural expression patterns. Nat Methods. 8 (3), 253-259 (2011).
- Hadjieconomou, D., Rotkopf, S., Alexandre, C., Bell, D. M., Dickson, B. J., Salecker, I. Flybow: Genetic multicolor cell labeling for neural circuit analysis in Drosophila melanogaster. Nat Methods. 8 (3), 260-266 (2011).
- Kremer, M. C., Jung, C., Batelli, S., Rubin, G. M., Gaul, U. The glia of the adult Drosophila nervous system. Glia. 65 (4), 606-638 (2017).
