Biology

Beredning av dissocierade Mouse kortikala Neuron kulturer

Published: December 19, 2007 doi: 10.3791/562

Lutz G. W. Hilgenberg¹, Martin A. Smith¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Denna video visar en procedur för att generera neuronala kulturer från slutet av embryot och tidiga postnatala mus cortex. Dessa kulturer kan användas för immuncytokemi, biokemi, elektrofysiologi, kalcium och natrium bildbehandling och tillhandahålla en plattform för att studera nervsystemets utveckling av transgena djur som bär en postnatal dödliga genmutation.

Abstract

Denna video kommer att guida dig genom processen för att skapa kortikala neuronala kulturer från slutet av embryot och tidiga postnatala musen hjärnan. Dessa kulturer kan användas för en mängd olika tillämpningar, inklusive immuncytokemi, biokemi, elektrofysiologi, kalcium och natrium bildbehandling, protein och / eller RNA isolering. Dessa kulturer ger också en plattform för att studera nervsystemets utveckling av transgena djur som bär en sen embryonal eller postnatal dödliga genmutation. Förfarandet är relativt rakt fram, kräver en del erfarenhet av vävnadsodling teknik och bör inte ta längre än två till tre timmar om du är ordentligt förberedd. Noggrann separation av kortikala svålen från thalamo-kortikala fiber tarmkanalen kommer att minska antalet oönskade icke-neuronala celler. För att öka avkastningen av neuronala celler mal sönder bitar av kortikala vävnaden försiktigt efter enzymet inkuberingssteget. Detta är viktigt eftersom det förhindrar onödig skada på celler och för tidig nervcellsdöd. Eftersom dessa kulturer upprätthålls i avsaknad av celler Glia feeder, de erbjuder även en extra fördel att växa kulturer anrikas i nervceller.

Protocol

Förberedelser inför dagen i odling:

Förbered steril dissekera lösning (DS).
Förbered NBM/B27 (Neurobasal Mediom med B27 tillskott).
Autoklav DDH ₂ O och sterilisera glas coversilps, om det behövs.
Coat vävnadskultur rätter eller täckglas glas med poly-D-lysin.

Poly-D-Lysin Beläggning:

Förbered dagen innan odling under sterila förhållanden.

Tina alikvot av 10X PDL och placera på is.
Lägg till 9 ml steril ultra-filtrerat vatten till 1 ml av PDL och blanda väl (1X).
Coat ytor med 1X PDL över natten i rumstemperatur enligt följande:
- glas täckglas (Bellco Glas, Inc. Cat # 1943-00.012.): 75 ml / täckglas
  ELLER
- 24 väl odlingsplatta: 300 l / brunn
  ELLER
- 35mm kultur maträtt: 1ml/dish
Skölj 5X med sterilt vatten (använd sterila Pasteur pipetter att aspirera vätska).
Ta bort vatten tills ytan är helt torr.

Odling förfarande (gjort i laminärt flöde huva under sterila förhållanden)

Skär ut block av agar och limma fast den stöder blocket i mikrotom Vibraslicer (Campden Instruments Ltd) med super lim.
När du använder sena embryonala stadium (E17-18) mus foster, euthanise dammen, ta bort livmoder och fria enskilda foster från embryonala säck. Placera foster i steril petriskål och fortsätt som beskrivs nedan.
Halshugga musen fostret eller valp (följ riktlinjer som godkänts av din Institutional Animal Care och användning kommittén).
Ta bort skinn och skalle och placera hjärnan på Whatman filterpapper disk i en 60mm petriskål fylld med kallt DS.
Skär av lillhjärnan med en steril rakblad.
Plocka upp hjärnan med hjälp av en spatel och dränera överflödig vätska på filterpapper, sedan överföra hjärnan att Vibraslicer stödja blockera och lim hjärnan på plats (caudal uppåt och ventrala delen mot agar).
Fyll kammare med kallt DS. Ställ in hastigheten väljaren till 8-9.
Skär 200-400 ìm sektioner, med början från luktbulben. När bladet Vibraslicer in i hjärnbarken, börjar sänka 600μm coronal sektioner. En E17-18 musen hjärnan ger vanligen 3-4 användbara skivor, medan en P0 mus hjärna ger 4-5 användbara skivor.
Överföring hjärnan skivor till 35 mm petriskål märkta DS 2 använder omvänd slutet av un-ansluten 10 ml glasflaska Pasteurpipett.
Dissekera ut cortex och ta bort hjärnhinnorna med glas nålar dras från kapillärrör.
Skär kortikala rinds i små bitar, 0,5-1 mm lång.
Filtrera ES genom 0,2 ìm filter ansluten till en 5 cc sprutan i en 35 mm petriskål.
Överför kortikala vävnaden bitar att petriskål som innehåller filtrerat ES.
Inkubera vid 37 ° C i 30 min.

Under tiden:

Städa upp huva, Vibraslicer och dissekera verktyg.
Tillsätt 5 ml varmt NBM/B27 till en 60 mm petriskål.

Efter 30 min. inkubation:

Överför vävnad till 10 ml DS. Låt nöja sig med 1 min.
Överföring vävnad till första Hi rör virvlar och låta nöja sig med 2-3 min.
Överföring till andra Hi. Upprepa som ovan.
Överföring till första Li. Upprepa som ovan.
Överföring till andra Li. Upprepa som ovan.
Överföring till tredje Li. Upprepa som ovan.
Överför vävnad till 60 mm skålen med media.

Enligt dissektion mikroskopet:

Ren skräp från vävnad och kör varje bit genom att försiktigt passera genom en drog glas pipett (använd minskande bar storlekar) att mjuka upp vävnaden.
Överföring cellsuspension till 15 ml koniska röret med resten av NBM + B27 (Går totalt 13 ml för en 24 brunnar eller 11 ml för 5 -. 35 mm rätter Blanda försiktigt och vänta på stora bitar av vävnad för att reglera).
Överföring cellsuspension (0,5 ml / bra för en 24 brunnar eller 2 ml / 35 mm kultur maträtt).
När du använder glas täckglas, tillsätt 80 l cellsuspension per täckglas och låt 1 timme i vävnadskultur inkubator för celler att hålla sig innan översvämningar kammaren med mer NBM/B27 medier.
Behåll kulturer vid 37 ° C och 5% CO _2.

Nästa dag

24 brunnar: Foder varje brunn med 0,5 ml icke-neuronala celler betingad NBM/B27 medium (cNBM/B27, protokoll för beredning av cNBM/B27 medelstora visas nedan)

35mm rätter: Byt 0,5 ml med cNBM/B27 medium.

Behåll kultur genom att ersätta 0,5 ml medium med färska cNBM/B27 var 2-3 dagar.

Även om odlingssubstrat inte främjar spridning Glia cell, kan kulturer behandlas med 5μM FDU (5-Fluoro-2'-deoxiuridin, Sigma F0503) vid dag 3-5 i kultur för att ytterligare minska antalet gliaceller om det behövs.

SET -Up för Dissection och kultur

Sterilisera dissekera verktyg i 70% EtOH eller autoklav dem:

Sax (med. och små) Spatulas (med. och små)
Pincetter (med. och små) rakblad
Blad för vibraslicer Buffert bad
Små metall kil för blad Support för hjärnan

Andra material:

Petriskålar (60 mm)
Petriskålar (35 mm)
Filterpapper
Glas Pipettera 10 ml
Sterila pipetter, 5,10 och 25 ml
Sprutfilter, 0,2 ìm
Spruta 5 cc
Centrifugrör, 15 ml
Sterila Pasteur glas pipetter
PDL belagda kultur rätter eller täckglas glas

Etikett sex 15 ml centrifugrör och följa förberedelser:

Rör # 1: Enzyme lösning:

Tillsätt 50 U papain (Worthington LS 03.126) till 5 ml DS som innehåller:

100μl av L-cystein (0,8 mg)
7 l 0,1 N NaOH
50 l APV (5mm)

Lämna lösning i rumstemperatur för att rensa. Observera att enzymet lösning kommer att visas "moln" i början och måste klara före användning.

Rör # 2 & # 3: Hi-hämmare:

3 ml DS + 300 l BSA / Ti + 30 l APV (5mm).

Blanda försiktigt för att undvika bubblor, sedan dela in i två 1,5 ml alikvoter.

Tube # 4 - # 6: Låg-hämmare:

8 ml DS + 80 l BSA / Ti + 80 l APV (5mm).

Blanda försiktigt för att undvika bubblor, dela i tre 2,6 ml alikvoter.

Placera rören numrerade # 2 till # 6 på is. Låt röret # 1 (Enzyme Solution) vid rumstemperatur.

LÖSNINGAR OCH alikvoter

Lösning A (koksaltlösning) Sigma Formel wt 500 ml [konc.]
Natriumklorid NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm
Kaliumklorid KCl P-4504 74,56 4.0g 5.4mm
Dinatriumvätefosfat vattenfri Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0.24g 0.17mM
Kalium monobasiskt vattenfri KH ₂ PO ₄ P-5379 136,09 0,3 g 0.22mM

Väg upp alla ingredienser och blanda tills lös upp med 400 ml filtrerat ultra vatten. Ta slutliga volymen till 500 ml. Placera i en ren flaska och autoklav. Förvaras vid 4 ° C och etikett "DS Lösning A".

Lösning B (Hepes) Sigma Formel wt 250 ml [konc.]
Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9.9mm

Lägg ultra-filtrerat vatten upp till 200 ml. Blanda tills det är upplöst och ge den slutliga volymen till 250 ml. Placera i en ren flaska och autoklav. Förvaras vid 4 ° C och etikett "DS Lösning B".

Arbeta Solution 500 ml [konc.]
Ultra filtrerat vatten 400 ml
Stamlösning en 25 ml
Stamlösning B 14 ml
D (+)-Glukos Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM
Sackaros Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM

Justera pH till 7,4 med 1N NaOH. Ta slutliga volymen till 500 ml med ultra filtrerat vatten. Häll i en ren glasflaska och autoklav. Förvaras vid 4 ° C. Label "Analysera lösning".

Poly-D-Lysin Beredning:

Förbered 10x stamlösningen av poly-D-lysin (PDL, Sigma P-7280) i steril H ₂ O på 1mg/ml.
Gör 1,0 ml alikvoter. Denna lösning kan förvaras vid -20 ° C i upp till 3 månader.

MEDIA

Tillsätt 10 ml av B-27 Supplement (Gibco 17.504-044) till 500 ml NBM flaska (Neurobasal Medium, Gibco 21.103-049).
Gör 40 ml-portioner och förvara vid 4 ° C.

APV

Tillsätt 10 ml steril H ₂ O injektionsflaska med 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic syra, Sigma A-5282) och blanda väl.
Förbered 180 l alikvoter och förvara vid -20 ° C.

BSA / Ti

Lös upp 1 g BSA (bovint albumin. Sigma A-7030) och 1 g trypsininhibitorerna (Sigma T-9253) i 10 ml DS.
Justera pH till 7,4 med 1N NaOH.
Sterilisera genom filtrering genom 0,2 ìm spruta filter.
Dela upp i 400 l alikvoter och förvara vid -20 ° C.

L-cystein

I ett Eppendorf-rör upplösa 0,6 mg L-Cystein (Sigma C-7755) i 200 l DS.

AGAR (4%)

Lös 4 g Bacto agar (Difco 0140-01) i 100 ml sterilt vatten. Förvara vid 4 ° C tills det behövs för kulturen.
Mikrovågsugn Agar att smälta och fylla en 35 mm petriskål. Låt sitta svalna och polymerisera.

Papain (Worthington LS 03.126)

e_title "> icke-neuronala kulturer i NUNC KULTUR FLASKOR

BELÄGGNING KULTUR FLASKA (4 Nunc flaskor)

Lägg till 9 ml sterilt vatten för att var och en av tre rör med 10X PDL att göra 1X PDL.
Överför 30 ml 1X PDL i den första flaskan.
Flytta något tills alla tillväxten ytor täcks. Låt sitta i 1 min.
Överföring 1x PDL till andra flaska. Låt sitta i 1 min.
Upprepa med den tredje och fjärde flaskor.
Skölj alla fyra flaskorna 2X med 150 ml steril H ₂ O.

FÖRBERED ENZYM lösning (ES):

I ett 0,6 ml centrifugrör vikt ut 0,8 mg L-Cystein (Sigma C7755), tillsätt 150ml DS och skaka tills kristallerna löses upp.
Överför 5 ml DS till en 15 ml konisk tub, lägg sedan till 150 ml L-cystein.
Lägg till 50 enheter Papain. (Worthington LS 03.126)
Lägg 7ml 0,1 N NaOH.

PREPARE MEM (GIBCO # 11.090-081)

Ta ut 65 ml från 500 ml MEM flaska. Spara 10 ml för att förbereda glukos.
Tillsätt 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15.070-063).
Tillsätt 10 ml 1M Glukos (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM)
Tillsätt 50 ml Fetalt bovint serum (Gibco # 16.140-071) eller bovint kalvserum (Omega BC-04).
Blanda väl, delprov och förvara vid 4 ° C.

NEUROBASAL MEDIUM/B-27 Tillägg (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco # 21.103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17.504-044)

Tillsätt hela innehållet av B-27 till flaskan NBM flaskan och blanda.
Alikvotera och förvara vid 4 ° C.

Dissekering av hjärnvävnad

Torr dissekera verktyg från 70% EtOH före dissekering.
Överför 10 ml DS i varje 3-15 ml rör.
Välj mus valpar (P0 - P3) behöver du tre hjärnor för 4 flaskor.
Lägg kallt DS till 35 mm petriskål.
Halshugga mus valp och dissekera ut hjärnor.
Placera hjärnor i petriskål med kallt DS.
Hacka vävnad i bitar, små nog att passera genom ett glas pipett.

ENZYM ÅTSKILJANDE

Ta bort så mycket DS som möjligt från skålen med ett pasteurpipett.
Filtrera ES genom ett 0,2 ìm filter och 5cc spruta.
Placera ES i skålen med vävnad.
Inkubera vävnaden vid 37 ° C inkubator (CO ₂ gratis) i 30 min.

TVÄTT TISSUE

Överför vävnad med glaspipett till den första DS-röret, och se till att få så lite ES som möjligt.
Centrifugera 30 sekunder vid 1500 rpm.
Överföring vävnad och upprepa proceduren ytterligare två gånger.

TRITURATION

Placera 38 ml av MEM / FBS i ett 50ml centrifugrör
Tillsätt 3 ml MEM / FBS till en 35 mm skålen och överför vävnaden till denna petriskål.
Dissociera vävnaden genom att försiktigt finfördelande det genom en 1000μl Eppendorf pipettspetsen.
Överföring cellsuspension till röret som innehåller 38ml av MEM / FBS och blanda väl.

FÖRGYLLNING

Stå kulturen flaskor upprätt för att få lika mycket av cellsuspensionen och media i varje flaska.
Placera 90 ml av MEM / FBS i varje kultur flaska.
Tillsätt 10 ml cellsuspension i varje flaska.
Tillverkare: icke-neuronala, initialer och datum. Inkubera vid 37 ° C och 5% CO _2.

UTFODRING

Dag 3 eller 4, foder celler med varm MEM / FBS (dekantera alla medier och ersätta den med 100 ml MEM / FBS). Kulturer kan ta 7-10 dagar att bli konfluenta.
Dag 7-10 ändra media för NBM/B27.
Nästa dag, samla media. Filter med 0.22μm
Gör alikvoter av 40 ml och foder kultur med MEM / FBS.
Nästa 2 eller 3 dagar, byt media för NBM/B27
Nästa dag, samla in och upprepa proceduren.
Håll samla in media för ca. 2 veckor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!