Biology

Préparation de cultures souris Dissocié neurones corticaux

Published: December 19, 2007 doi: 10.3791/562

Lutz G. W. Hilgenberg¹, Martin A. Smith¹

¹Department of Anatomy and Neurobiology, University of California, Irvine (UCI)

Summary

Cette vidéo montre une procédure pour générer cultures de neurones de l'embryon et au début du cortex de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisées pour l'immunocytochimie, la biochimie, l'électrophysiologie, de calcium et de sodium d'imagerie et de fournir une plateforme pour l'étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du gène létal postnatale.

Abstract

Cette vidéo va vous guider à travers le processus pour générer des cultures de neurones corticaux de l'embryon et au début de cerveau de souris postnatale. Ces cultures peuvent être utilisés pour une variété d'applications, y compris immunocytochimie, biochimie, électrophysiologie, d'imagerie du calcium et de sodium, de protéines et / ou d'isolement d'ARN. Ces cultures fournissent également une plateforme pour l'étude du développement neuronal des animaux transgéniques qui portent une mutation du retard embryonnaire ou postnatale gène létal. La procédure est relativement simple, nécessite une certaine expérience dans la technique de culture de tissus et ne devrait pas prendre plus de deux à trois heures si vous êtes bien préparé. Attention séparation de l'écorce corticale par le tractus de fibres thalamo-cortical permettra de réduire le nombre des grossesses non désirées cellules non-neuronales. Pour accroître les rendements des cellules neuronales triturer les pièces du tissu cortical doucement après l'étape d'incubation enzymatique. C'est impératif car elle prévient les blessures inutiles aux cellules et la mort prématurée de cellules neuronales. Étant donné que ces cultures sont maintenues en l'absence de cellules nourricières glie, ils offrent également un avantage supplémentaire de cultures de plus en plus enrichies en neurones.

Protocol

Les préparatifs avant le jour de la culture:

Préparer une solution stérile de dissection (DS).
Préparer NBM/B27 (Mediom Neurobasal avec B27 suppléments).
Autoclave ddH ₂ O et stériliser coversilps verre, si nécessaire.
Manteau plats de culture de tissu ou de lamelles de verre avec de la poly-D-lysine.

Poly-D-Lysine Coating:

Préparer la veille de culture dans des conditions stériles.

Aliquote de dégel du PDL 10X et le placer sur la glace.
Ajouter 9 ml stériles ultra-eau filtrée à 1 ml de PDL et bien mélanger (1X).
Surfaces Manteau avec 1X PDL nuit à température ambiante comme suit:
- verre de lamelles (Bellco Glass, Inc Cat # 1943-00012.): 75 pl / lamelle
  OU
- 24 plaques de culture ainsi: 300 pl / puits
  OU
- Boîte de culture 35mm: 1ml/dish
Rincer à l'eau stérile 5X (utilisation de pipettes Pasteur stériles à aspirer le liquide).
Retirer de l'eau jusqu'à la surface est complètement sèche.

Procédure de culture (réalisée en hotte à flux laminaire dans des conditions stériles)

Découpez bloc de gélose et le coller sur le bloc de support de l'Vibraslicer microtome (Campden Instruments Ltd) en utilisant la super glue.
Lors de l'utilisation tardive stade embryonnaire (E17-18) des fœtus de souris, d'un barrage euthanasier, retirer l'utérus et libre fœtus individu de sac embryonnaire. Fœtus Placer dans une boîte de Petri stérile et continuer comme décrit ci-dessous.
Fœtus de souris décapiter ou chiot (directives approuvées par votre suivi de protection des animaux et du Comité institutionnel d'utilisation).
Enlever la peau et le crâne et le cerveau placer sur le disque de papier filtre Whatman dans un plat de Pétri 60mm rempli DS froid.
Coupez le cervelet en utilisant une lame de rasoir stérile.
Ramassez le cerveau à l'aide d'une spatule et égoutter l'excès de liquide sur du papier filtre, puis transférer le cerveau de bloquer le soutien Vibraslicer et le cerveau de la colle en place (côté caudale et la partie ventrale face agar).
Remplir la chambre froide avec la DS. Réglez le sélecteur de vitesse à 8-9.
Couper 200-400 um sections, à partir de bulbe olfactif. Une fois que la lame de la Vibraslicer pénètre dans le cortex, commencer à couper 600μm coupes coronales. Un cerveau de souris E17-18 donne typiquement 3-4 tranches utilisable, alors un cerveau de souris P0 rendements 4-5 tranches utilisables.
Transfert des tranches de cerveau à 35 mm boîte de Petri étiquetés DS 2 en utilisant de fond inverse de l'ONU-branchée verre de 10 ml Pasteur pipette.
Disséquer le cortex et enlever les méninges en utilisant des aiguilles de verre tiré à partir des tubes capillaires.
Couper écorces corticale en petits morceaux, 0,5-1 mm de longueur.
ES Filtrer à travers filtre de 0,2 um attachée à une seringue de 5 cc dans un plat de Pétri de 35 mm.
Transférer les morceaux de tissu cortical boîte de Pétri contenant ES filtré.
Incuber à 37 ° C pendant 30 min.

Dans l'intervalle:

Nettoyer le capot, et les outils Vibraslicer dissection.
Ajouter 5 ml de NBM/B27 chaud dans un plat de Pétri de 60 mm.

Après 30 min. incubation:

Transfert des tissus à 10 ml DS. Laisser reposer pendant 1 min.
Transfert des tissus au premier tube de tourbillons Salut et laisser reposer pendant 2-3 min.
Transfert à Salut secondes. Répéter comme ci-dessus.
Transfert d'abord Li. Répéter comme ci-dessus.
Transfert à la seconde Li. Répéter comme ci-dessus.
Transfert à des tiers Li. Répéter comme ci-dessus.
Transfert des tissus à l'antenne de 60 mm avec les médias.

Sous le microscope de dissection:

Nettoyer les débris tissulaires et triturer chaque pièce en douceur en passant par une pipette de verre tiré (utilisation décroissante diamètres d'alésage) pour assouplir les tissus.
Transfert suspension cellulaire à 15 ml tube conique contenant le reste de NBM + B27 (Faire un total de 13 ml pour une plaque à 24 puits ou 11 ml pour 5 -. Plaques de 35 mm Mélanger doucement et attendre que de gros morceaux de tissus à régler).
Suspension de cellules de transfert (0,5 ml / puits d'une plaque à 24 puits ou 2 ml / boîte de 35 mm de la culture).
Lors de l'utilisation des lamelles en verre, ajouter 80 ul par suspension cellulaire lamelle et permettre une heure dans la culture des tissus incubateur pour cellules d'adhérer avant l'inondation de la chambre avec plus NBM/B27 médias.
Maintenir les cultures à 37 ° C et 5% de CO _2.

Jour suivant

24 plaques ainsi: Flux chaque puits avec 0,5 ml de cellules non-neuronales conditionnée NBM/B27 moyennes (cNBM/B27; Protocole pour la préparation de cNBM/B27 milieu apparaît ci-dessous)

Plats 35mm: Remplacer 0,5 ml avec cNBM/B27 moyenne.

Maintenir la culture en remplaçant 0.5ml de milieu avec cNBM/B27 frais tous les 2-3 jours.

Bien que les milieux de culture ne favorise pas la prolifération des cellules gliales, les cultures peuvent être traitées avec 5 um FDU (5-fluoro-2'-désoxyuridine, Sigma F0503) au jour 3-5 dans la culture afin de réduire davantage le nombre de cellules gliales, si nécessaire.

SET -UP pour la dissection et de la Culture

Stériliser les outils de dissection dans EtOH 70% ou les autoclaves:

Ciseaux (moyennes et petites) Spatules (moyennes et petites)
Lame de rasoir Brucelles (moyennes et petites)
Lame pour le bain de tampon vibraslicer
Cale métallique pour support de lame pour le cerveau

Autres matériaux:

Boîtes de Pétri (60 mm)
Boîtes de Pétri (35 mm)
Le papier filtre
Pipette en verre de 10 ml
Stérile pipettes jetables, 5,10 et 25 ml
Seringue filtre de 0,2 um
Seringue 5 cc
Tubes à centrifuger de 15 ml
Pipettes Pasteur stérile en verre
PDL boîtes de culture enduits ou des lamelles de verre

Étiquette six tubes de 15 ml centrifugeuse et suivre la préparation:

Tube n ° 1: la solution enzymatique:

Ajouter 50 U de la papaïne (Worthington LS 03126) à 5 ml contenant DS:

100 pi de L-cystéine (0,8 mg)
7 ul NaOH 0,1 N
50 ul APV (5mm)

Laisser la solution à température ambiante au clair. Notez que la solution d'enzyme apparaîtra «trouble» au début et a besoin d'effacer avant de l'utiliser.

Tube # 2 et # 3: Inhibiteur de l'enzyme Salut:

3 ml DS + 300 pl de BSA / Ti + 30 ul APV (5mm).

Mélanger doucement pour éviter les bulles, puis diviser en deux aliquotes de 1.5ml.

Tube n ° 4 - # 6: Inhibiteur de l'enzyme basse:

8 ml DS + 80 ul de BSA / Ti + 80 ul APV (5mm).

Mélanger doucement pour éviter les bulles, la diviser en trois aliquotes 2,6 ml.

Placer les tubes numérotés # 2 à # 6 sur la glace. Laisser le tube n ° 1 (solution enzymatique) à température ambiante.

SOLUTIONS ET aliquotes

Solution A (Buffered Saline) Sigma Formule poids de 500 ml [conc.]
Chlorure de sodium NaCl S-9625 58,45 80.0g 137mm
Chlorure de potassium KCl P-4504 74.56 4.0g 5.4mm
Phosphate de sodium dibasique anhydre Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0,24 g 0.17mm
Potassium phosphate monobasique anhydre KH ₂ PO ₄ P-5379 136.09 0.3g 0.22mm

Peser tous les ingrédients et mélanger jusqu'à dissoudre avec 400 ml d'eau filtrée ultra. Amener le volume final de 500 ml. Placer dans un flacon propre et autoclave. Conserver à 4 ° C et l'étiquette «Solution DS A».

Solution B (HEPES) Sigma Formule poids de 250 ml [conc.]
Hepes Hepes H-3375 283,3 9,9 mm 20.97g

Ajouter ultra-filtrée de l'eau jusqu'à 200 ml. Mélanger jusqu'à dissolution et amener le volume final à 250 ml. Placer dans un flacon propre et autoclave. Conserver à 4 ° C et l'étiquette «Solution DS B».

Solution de travail de 500 ml [conc.]
Ultra eau filtrée 400 ml
Une solution stock de 25 ml
Solution mère B 14 ml
D (+)-Glucose Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM
Saccharose Sigma S-0389 7,5 g 43,8 mM

Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N. Amener le volume final à 500 ml avec de l'eau filtrée ultra. Transvaser dans une bouteille en verre propre et autoclave. Conserver à 4 ° C. Label "Solution de dissection».

Poly-D-Lysine Préparation:

Préparer une solution stock de 10x de poly-D-lysine (PDL; Sigma P-7280) en H ₂ O stérile à 1mg/ml.
Faire aliquotes de 1,0 ml. Cette solution peut être conservée à -20 ° C jusqu'à 3 mois.

MEDIA

Ajouter 10ml de B-27 Supplément (Gibco 17504-044) à 500 bouteilles NBM ml (milieu Neurobasal, Gibco 21103-049).
Faire aliquotes de 40 ml et conserver à 4 ° C.

APV

Ajouter 10 ml stériles H ₂ O pour flacon de 10 mg APV (2-amino-5-phosphonopentanoic acide, Sigma A-5282) et bien mélanger.
Préparer 180 aliquotes et stocker à -20 ° C.

BSA / Ti

Dissoudre 1 g de BSA (albumine bovine. Sigma A-7030) et 1 g d'inhibiteur de trypsine (Sigma T-9253) dans 10 ml DS.
Ajuster le pH à 7,4 avec NaOH 1N.
Stériliser par filtration sur filtre seringue 0,2 um.
Diviser en 400 aliquotes et stocker à -20 ° C.

L-CYSTÉINE

Dans un tube Eppendorf dissout 0,6 mg de L-cystéine (Sigma C-7755) dans 200 ul DS.

AGAR (4%)

Dissoudre 4 g d'agar Bacto (Difco 0140-01) dans 100 ml d'eau stérile. Conserver à 4 ° C jusqu'à ce que nécessaire pour la culture.
Agar à micro-ondes pour faire fondre et de remplir un plat de Pétri de 35 mm. Laisser reposer pour refroidir et polymériser.

Papaïne (Worthington LS 03126)

e_title "> non neuronales CULTURES EN BOUTEILLES DE CULTURE NUNC

Flacon de culture REVÊTEMENT (4 bouteilles Nunc)

Ajouter 9 mL d'eau stérile pour chacun des 3 tubes de PDL 10X pour rendre PDL 1X.
Transfert de 30 ml 1X PDL dans la première bouteille.
Déplacer légèrement jusqu'à ce que toutes les surfaces sont couvertes de croissance. Laisser reposer pendant 1 min.
Transfert 1x PDL à la deuxième bouteille. Laisser reposer pendant 1 min.
Répétez l'opération avec les bouteilles troisième et quatrième.
Rincez tous les quatre bouteilles 2X avec 150 ml stériles H ₂ O.

PRÉPARER solution enzymatique (ES):

Dans un poids de 0,6 ml par tube de centrifugeuse de 0,8 mg de L-cystéine (Sigma C7755), ajouter 150ml et DS vortex jusqu'à cristaux sont dissous.
Transférer 5 ml DS à un tube de 15 ml conique, puis ajouter 150 ml de L-cystéine.
Ajouter 50 unités papaïne. (Worthington LS 03126)
Ajouter 7ml NaOH 0,1.

PRÉPARER MEM (Gibco # 11090-081)

Retirer 65 ml de la bouteille de 500 ml MEM. Économisez 10 ml pour préparer glucose.
Ajouter 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063).
Ajouter 10 ml de glucose 1M (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM)
Ajouter 50 ml de sérum bovin fœtal (Gibco # 16140-071) ou Bovine sérum de veau (Omega BC-04).
Mélangez bien, aliquote et conserver à 4 ° C.

Neurobasal SUPPLÉMENT MEDIUM/B-27 (NBM/B27)
MNB, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50X), 10 ml (Gibco # 17504-044)

Ajouter le contenu entier du flacon B-27 à la bouteille NBM et mélanger.
Aliquoter et stocker à 4 ° C.

DISSECTION du tissu cérébral

Dry dissection des outils à partir d'EtOH 70% avant la dissection.
Transférer 10 ml dans chaque DS de 3-15 ml tube.
Sélectionnez souriceaux (P0 - P3), vous aurez besoin de trois cerveaux pour 4 bouteilles.
Ajouter DS à froid de 35 mm boîte de Petri.
Décapitez souris chiot et disséquer le cerveau.
Placez le cerveau dans la boîte de Pétri contenant DS froid.
Hacher les tissus en morceaux, assez petit pour passer à travers une pipette en verre.

ENZYME DISSOCIATION

Retirez le DS autant que possible de l'antenne avec une pipette Pasteur.
ES Filtrer à travers une seringue filtre de 0,2 um et 5cc.
Placez ES dans le plat avec du tissu.
Incuber les tissus à 37 ° C incubateur (CO ₂ gratuits) pendant 30 min.

LAVAGE DE TISSUS

Tissus de transfert avec pipette en verre pour le premier tube DS, en veillant à obtenir ES peu que possible.
Centrifuger pendant 30 sec à 1500 rpm.
Transfert des tissus et la procédure répéter deux fois plus.

TRITURATION

Placer 38 ml de MEM / FBS dans un tube de 50ml centrifugeuse
Ajouter 3 ml de MEM / FBS à un plat de 35 mm et le tissu transférer à cette boîte de Pétri.
Dissocier le tissu par trituration doucement grâce à une astuce eppendorf pipette 1000μl.
Transfert suspension cellulaire dans le tube contenant 38ml de MEM / FBS et mélangez bien.

PLACAGE

Placez la bouteille de culture verticale pour obtenir des quantités égales de la suspension cellulaire et des médias dans chaque bouteille.
Mettez 90 ml de MEM / FBS dans chaque flacon de culture.
Ajouter 10 ml de suspension cellulaire dans chaque bouteille.
Label: non-neuronales, les initiales et la date. Incuber à 37 ° C et 5% de CO _2.

ALIMENTATION

Au jour 3 ou 4, les cellules chaudes nourrir avec MEM / FBS (décanter tous les médias et le remplacer par 100 ml de MEM / FBS). Cultures peut prendre 7-10 jours pour devenir confluentes.
Sur le changement de 7-10 jours les médias pour NBM/B27.
Le lendemain, recueillir les médias. Filtre avec 0.22μm
Faire des aliquotes de 40 ml et nourrir la culture avec MEM / FBS.
Suivant 2 ou 3 jours, le changement des médias pour NBM/B27
Le lendemain, recueillir et répéter la procédure.
Gardez la collecte des médias pour env. 2 semaines.

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Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!