De voorbereiding van gescheiden Mouse Cortical Neuron culturen

Summary

Deze video toont een procedure voor het genereren van neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale muis cortex. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming en een platform te bieden voor de neuronale ontwikkeling van transgene dieren die een postnatale dodelijke genmutatie dragen bestuderen.

Abstract

Deze video zal u door het proces voor het genereren van corticale neuronale culturen uit de late embryo en de vroege postnatale hersenen van muizen. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan toepassingen, waaronder immunocytochemie, biochemie, elektrofysiologie, calcium en natrium beeldvorming, eiwit en / of RNA isolatie. Deze culturen ook een platform om de neuronale ontwikkeling van transgene dieren dat een te late embryonale of postnatale dodelijk genmutatie dragen bestuderen. De procedure is relatief eenvoudig, vergt enige ervaring in weefselkweek techniek en mag niet langer duren dan twee tot drie uur of u goed voorbereid. Een zorgvuldige scheiding van de corticale schil van de thalamo-corticale fiber-darmkanaal vermindert het aantal ongewenste niet-neuronale cellen. Ter verhoging van opbrengsten van neuronale cellen voorzichtig vermaal de stukken van de corticale weefsel na het enzym incubatie stap. Dit is noodzakelijk omdat het voorkomt onnodige schade aan cellen en vroegtijdige neuronale celdood. Aangezien deze culturen worden gehandhaafd in de afwezigheid van glia feeder cellen, ze bieden ook een extra voordeel van de groeiende culturen verrijkt met neuronen.

Protocol

Voorbereidingen voor de dag van het kweken:

• Bereid steriele ontleden oplossing (DS).
• Bereid NBM/B27 (Neurobasal Mediom met B27 supplementen).
• Autoclaaf DDH ₂ O en steriliseren glas coversilps, indien nodig.
• Vacht weefselkweek gerechten of glazen dekglaasjes met poly-D-lysine.

Poly-D-Lysine Coating:

Bereid de dag voor het kweken van onder steriele omstandigheden.

• Dooi hoeveelheid van 10X PDL en leg ze op ijs.
• Voeg 9 ml steriele ultra-gefilterd water tot 1 ml van PDL en meng goed (1x).
• Coat oppervlakken met 1X PDL 's nachts bij kamertemperatuur als volgt:
  • dekglaasjes (Bellco Glass, Inc Cat # 1943 tot 00.012.): 75 ul / dekglaasje
    OR
  • 24 goed cultuur plaat: 300 ul / putje
    OR
  • 35mm cultuur gerecht: 1ml/dish
• Spoel 5X met steriel water (gebruik steriele pasteurpipetten van vloeibare aspireren).
• Verwijder water totdat het oppervlak volledig droog is.

Het kweken van de procedure (gedaan in laminaire flow hood onder steriele omstandigheden)

1. Knip blok van agar en lijm deze op de steun blok van de microtoom Vibraslicer (Campden Instruments Ltd) met behulp van superlijm.
2. Bij het gebruik van late embryonale stadium (E17-18) muis foetussen, euthanise dam, te verwijderen baarmoeder en vrij individuele foetussen van embryonale zak. Plaats foetussen in steriele petrischaal en verder zoals hieronder beschreven.
3. Onthoofden muis foetus of pup (volg de richtlijnen die zijn goedgekeurd door de Institutional Animal Care en gebruik Committee).
4. Verwijder het vel en de schedel en de hersenen plaats op Whatman filter papier schijf in een 60mm petrischaal gevuld met koud DS.
5. Snijd het cerebellum met behulp van een steriel scheermesje.
6. Pick-up hersenen met behulp van een spatel en afvoer overtollige vloeistof op filtreerpapier, vervolgens over de hersenen te Vibraslicer ondersteuning te blokkeren en lijm de hersenen in plaats (caudale zijde naar boven en ventrale deel geconfronteerd met agar).
7. Vul de kamer met koude DS. Ingestelde snelheid keuzeschakelaar op 8-9.
8. Snijd 200 tot 400 micrometer secties, te beginnen vanaf bulbus olfactorius. Zodra het blad van de Vibraslicer komt in de cortex, gaan knippen 600μm coronale secties. Een E17-18 de hersenen van muizen levert meestal 3-4 bruikbaar plakken, terwijl een P0 de hersenen van muizen levert bruikbare 4-5 plakjes.
9. Overdracht hersenen plakjes van 35 mm petrischaal label DS 2 met behulp van reverse einde van un-plugged 10 ml glazen Pasteur pipet.
10. Ontleden van cortex en verwijder de hersenvliezen het gebruik van glazen naalden getrokken uit capillaire buizen.
11. Snijd corticale schillen in kleine stukjes, 0,5-1 mm in lengte.
12. Filter ES door 0,2 um filter gekoppeld aan een 5 cc spuitje in een 35 mm petrischaal.
13. Breng de corticale weefsel stukken om petrischaaltje met gefilterd ES.
14. Incubeer bij 37 ° C gedurende 30 minuten.

In de tussentijd:

1. Opruimen kap, Vibraslicer en ontleden tools.
2. Voeg 5 ml warm NBM/B27 in een 60 mm petrischaal.

Na 30 minuten. incubatie:

1. Overdracht weefsel tot 10 ml DS. Laten bezinken voor 1 minuut.
2. Overdracht weefsel eerst Hi buis wervelingen en laten bezinken voor 2-3 minuten.
3. Overdracht naar de tweede Hi. Herhalen als hierboven.
4. Transfer naar eerste Li. Herhalen als hierboven.
5. Overdracht naar de tweede Li. Herhalen als hierboven.
6. Overdragen aan derden Li. Herhalen als hierboven.
7. Overdracht van weefsel om de 60 mm gerecht met media.

Onder de dissectie microscoop:

1. Schoon puin van weefsel en vermaal elk stuk door voorzichtig het passeren van een getrokken glazen pipet (gebruik afnemende boring maten) om los te komen van de weefsel.
2. Overdracht celsuspensie tot 15 ml conische buis met de rest van NBM + B27 (Maak een totaal van 13 ml voor een 24 wells plaat of 11 ml voor 5 -. 35 mm schotels Mix voorzichtig en voor grote stukken van het weefsel om zich te vestigen te wachten).
3. Transfer celsuspensie (0,5 ml / goed voor een 24 wells plaat of 2 ml / 35 mm cultuur schotel).
4. Bij het gebruik van glas dekglaasjes, voeg 80 ul celsuspensie per dekglaasje en laat 1 uur in weefselkweek incubator voor de cellen om zich te houden voor overstromingen van de kamer met meer NBM/B27 media.
5. Handhaaf culturen bij 37 ° C en 5% CO _2.

Volgende dag

24 wells plaat: Feed elk putje met 0,5 ml niet-neuronale cellen geconditioneerd NBM/B27 medium (cNBM/B27, Protocol voor de voorbereiding van cNBM/B27 medium verschijnt onder)

35mm gerechten: Vervang 0,5 ml met cNBM/B27 medium.

Onderhouden cultuur door het vervangen van 0,5 ml van medium met verse cNBM/B27 om de 2-3 dagen.

Hoewel de cultuur media bevordert niet glia cel proliferatie, kunnen culturen worden behandeld met 5 urn FDU (5-fluor-2'-deoxyuridine, Sigma F0503) op dag 3-5 in de cultuur verder te verlagen van het aantal gliacellen indien nodig.

SET -UP voor Dissection en Cultuur

Steriliseer het ontleden van tools in 70% EtOH of autoclaaf hen:

• Schaar (middelgrote en kleine) Spatels (middelgrote en kleine)
• Pincet (middelgrote en kleine) Razor blade
• Blad voor vibraslicer Buffer bad
• Kleine metalen wig voor blade Ondersteuning voor de hersenen

Andere materialen:

• Petrischalen (60 mm)
• Petrischalen (35 mm)
• Filtreerpapier
• Glazen pipet 10 ml
• Steriele pipetten, 5,10 en 25 ml
• Spuitfilter, 0,2 micrometer
• Spuit 5 cc
• Centrifuge buizen, 15 ml
• Steriele Pasteur glazen pipetten
• PDL gecoat cultuur gerechten of glas coverslips

Label zes 15 ml centrifugebuizen en volg de voorbereiding:

Buis # 1: Enzyme oplossing:

Voeg 50 U van papaïne (Worthington LS 03126) tot 5 ml DS met daarin:

• 100μl van L-cysteïne (0,8 mg)
• 7 ul 0,1 N NaOH
• 50 ui APV (5mm)

Laat oplossing uit op kamertemperatuur te wissen. Merk op dat enzym oplossing zal 'troebel' lijken op het eerste en moet helder voor gebruik.

Tube # 2 & # 3: Hoi Enzyme remmer:

3 ml DS + 300 ul BSA / Ti + 30 pl APV (5mm).

Meng voorzichtig om luchtbellen te vermijden, en verdeel in twee porties 1,5 ml.

Tube # 4 - # 6: Laag Enzyme remmer:

8 ml DS + 80 ul BSA / Ti + 80 ui APV (5mm).

Meng voorzichtig om luchtbellen te vermijden, te verdelen in drie 2,6 ml monsters.

Plaats de buisjes nummers # 2 tot en met # 6 op het ijs. Laat buis # 1 (Enzyme-oplossing) bij kamertemperatuur.

OPLOSSINGEN en aliquots

• Oplossing A (gebufferde zoutoplossing) Sigma Formule gew 500 ml [conc.]
• Natriumchloride NaCl S-9625 58.45 80.0g 137mm
• Kaliumchloride KCl P-4504 74.56 4.0g 5,4
• Natrium dibasisch watervrij Na ₂ HPO ₄ S-0876 142,0 0,24 g 0.17mM
• Kalium monobasisch watervrij KH ₂ PO ₄ P-5379 136,09 0.3g 0.22mm

Weeg alle ingrediënten en meng tot oplossen met 400 ml ultra gefilterd water. Breng uiteindelijke volume tot 500 ml. Plaats in een schone fles en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C en label "DS Oplossing A".

• Oplossing B (Hepes) Sigma Formule gew 250 ml [conc.]
• Hepes Hepes H-3375 283,3 20.97g 9,9 mm

Voeg ultra-gefilterd water tot 200 ml. Meng tot opgelost en breng uiteindelijke volume tot 250 ml. Plaats in een schone fles en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C en label "DS Oplossing B".

• Werken Solution 500 ml [conc.]
• Ultra gefilterd water 400 ml
• Stock oplossing A 25 ml
• Stock Oplossing B 14 ml
• D (+)-glucose Sigma G-8270 3,0 g 33.3mM
• Sucrose Sigma S-0389 7.5 g 43,8 mM

Breng de pH tot 7,4 met 1 N NaOH. Breng uiteindelijke volume tot 500 ml met ultra gefilterd water. Giet in een schone glazen fles en autoclaaf. Bewaren bij 4 ° C. Label "ontleden Solution".

Poly-D-Lysine Bereiding:

1. Bereid 10x voorraad oplossing van poly-D-lysine (PDL, Sigma P-7280) in een steriele H ₂ O op 1mg/ml.
2. Maak 1,0 ml porties. Deze oplossing kan worden opgeslagen bij -20 ° C gedurende maximaal 3 maanden.

MEDIA

1. Voeg 10 ml van de B-27 Supplement (Gibco 17504-044) tot 500 ml fles NBM (Neurobasal Medium, Gibco 21103-049).
2. Maak 40 ml porties en bewaar bij 4 ° C.

APV

1. Voeg 10 ml steriel H ₂ O tot flacon van 10 mg APV (2-Amino-5-phosphonopentanoic zuur, Sigma A-5282) en meng.
2. Bereid 180 ul aliquots en bewaar bij -20 ° C.

BSA / Ti

1. Los 1 g BSA (Bovine albumine. Sigma A-7030) en 1 g trypsine-remmer (Sigma T-9253) in 10 ml DS.
2. Breng de pH tot 7,4 met 1 N NaOH.
3. Steriliseren door te filteren door middel van 0,2 um spuitfilter.
4. Verdeel het deeg in porties van 400 ul en bewaar bij -20 ° C.

L-cysteïne

In een eppendorfbuisje te ontbinden 0,6 mg L-Cysteïne (Sigma C-7755) in 200 ul DS.

AGAR (4%)

1. Los 4 g Bacto Agar (Difco 0140-01) in 100 ml steriel water. Bewaren bij 4 ° C totdat het nodig is voor cultuur.
2. Microwave Agar te smelten en vul een 35 mm petrischaal. Laten we gaan zitten om af te koelen en polymeriseren.

PAPAÏNE (Worthington LS 03126)

e_title "> niet-neuronale culturen in NUNC CULTUUR FLESSEN

COATING CULTUUR FLES (4 Nunc flessen)

1. Voeg 9 mL steriel water om elk van de drie buizen van 10X PDL om 1X PDL te maken.
2. Transfer 30 ml 1X PDL in de eerste fles.
3. Beweeg een beetje totdat alle groei van oppervlakken bedekt zijn. Laat zitten voor 1 minuut.
4. Overdracht 1x PDL naar de tweede fles. Laat zitten voor 1 minuut.
5. Herhaal dit met de derde en vierde flessen.
6. Spoel alle vier flesjes 2X met 150 ml steriele H ₂ O.

VOORBEREIDEN enzymoplossing (ES):

1. In een 0,6 ml centrifugebuis van het gewicht van 0,8 mg L-Cysteïne (Sigma C7755), voeg 150 ml DS toe en vortex tot kristallen zijn opgelost.
2. Transfer 5 ml DS om een ​​15 ml conische buis, voeg vervolgens 150 ml L-cysteïne.
3. Voeg 50 eenheden Papaïne. (Worthington LS 03126)
4. Voeg 7ml 0,1 N NaOH.

VOORBEREIDEN MEM (GIBCO # 11090-081)

1. Verwijder 65 ml van de 500 ml MEM fles. Bespaar 10 ml tot Glucose voor te bereiden.
2. Voeg 5 ml Pen / Strep (Gibco # 15070-063).
3. Voeg 10 ml 1M Glucose (Sigma G-8270) (1,8 g / 10 ml MEM)
4. Voeg 50 ml foetaal runderserum (Gibco # 16140-071) of Bovine Calf Serum (Omega BC-04).
5. Meng goed, hoeveelheid en bewaar bij 4 ° C.

NEUROBASAL MEDIUM/B-27 Supplement (NBM/B27)
NBM, 500 ml (Gibco # 21103-049), B-27 (50x), 10 ml (Gibco # 17504-044)

1. Voeg de gehele inhoud van de B-27 flacon van de NBM fles en meng.
2. Aliquot en bewaar bij 4 ° C.

Dissectie van hersenweefsel

1. Droge ontleden tools van 70% EtOH vóór versnijding.
2. Breng 10 ml DS in elk van 3-15 ml buis.
3. Selecteer muis pups (P0 - P3), hebt u drie hersens voor 4 flessen.
4. Voeg koud DS tot 35 mm petrischaal.
5. Onthoofden muis pup en ontleden van hersenen.
6. Plaats hersenen in de petrischaal met koud DS.
7. Hak weefsel in stukken, klein genoeg om door een glazen pipet.

ENZYME DISSOCIATIE

1. Verwijder zoveel DS mogelijk van de schotel met een Pasteur pipet.
2. Filter ES door een 0,2 um filter en 5cc spuit.
3. Plaats ES in de schaal met weefsel.
4. Incubeer weefsel bij 37 ° C incubator (CO ₂ vrij) gedurende 30 minuten.

WASSEN TISSUE

1. Transfer weefsel met glazen pipet met de eerste DS-buis, om ervoor te zorgen om zo weinig mogelijk ES.
2. Centrifugeer gedurende 30 seconden bij 1500 rpm.
3. Overdracht weefsel en herhaal de procedure nog twee keer.

Vermalen

1. Plaats 38 ml MEM / FBS in een 50 ml centrifugebuis
2. Voeg 3 ml MEM / FBS om een ​​35 mm schaal en overdracht weefsel om dit petrischaal.
3. Distantiëren van het weefsel voorzichtig fijnwrijven het door een 1000μl eppendorf pipet tip.
4. Overdracht celsuspensie aan de buis met 38ml van de MEM / FBS en meng goed.

Plateren

1. Rechtop kan staan ​​van de cultuur flessen om gelijke hoeveelheden van de celsuspensie en de media krijgen in elke fles.
2. Doe 90 ml MEM / FBS in elke cultuur fles.
3. Voeg 10 ml celsuspensie in elke fles.
4. Label: niet-neuronale, initialen en datum. Incubeer bij 37 ° C en 5% CO _2.

VOEDING

1. Op dag 3 of 4, voeden cellen met warm MEM / FBS (decanteren alle media en deze met 100 ml MEM / FBS vervangen). Culturen kan 7-10 dagen te worden confluerende.
2. Op dag 70 tot 10 u de media voor NBM/B27.
3. De volgende dag, het verzamelen van de media. Filter met 0.22μm
4. Maak aliquots van 40 ml en diervoeders cultuur met MEM / FBS.
5. Komende 2 of 3 dagen, verandering media voor NBM/B27
6. De volgende dag, verzamelen en herhaal de procedure.
7. Houd het verzamelen van media voor ca.. 2 weken.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5-Fluoro-2’-deoxyuridine	Sigma-Aldrich	F0503
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S9625
Vibraslicer	Campden Instruments
Potassim Chloride	Sigma-Aldrich	P4504
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	S0876
Potassium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	P5379
Hepes	Sigma-Aldrich	H3375
D (+)-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Poly-D-Lysine	Sigma-Aldrich	P7280
B27 Supplement	Invitrogen	17504-044
Neurobasal Media (NBM)	Invitrogen	21103-049
2-Amino-5-phosphonopentanoic acid	Sigma-Aldrich	A5282
Bovine Albumin	Sigma-Aldrich	A7030
Trypsin Inhibitor	Sigma-Aldrich	T9253
Sodium Hydroxide, 1N solution	Fisher Scientific	SS266-1
L-Cysteine	Sigma-Aldrich	C7755
Bacto Agar	Difco Laboratories	0140-01
Papain	Worthington Biochemical	LS 03126
Sterile 0.2 μm Syringe Filter	Fisher Scientific	DDA02025S0
Glass Coverslips, No1, 12mm	Bellco Glass	1943-00012
Minimum Essential Media (MEM)	Invitrogen	11090-081	with Earle’s saltswithout L-glutamine, needed for growing non-neuronal cultures
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15070-063	for non-neuronal culture
Fetal Bovine Serum	Invitrogen	16140-071	needed for non-neuronal cultures
Nunclon "Triple Flask" Tissue Culture Bottle	Fisher Scientific	12-565-25	Use for non-neuronal cultures. these flasks are very convenient when producing "conditioned Neurobasal Media/B27", but any other tissue culture flasks or dishes can be used instead.
Glass bottom "Imaging dishes"	MatTek Corp.	P35G-1.5-10-C	Glass bottomed, 35mm culture dishes ideal for Calcium or Sodium Imaging when using an inverted imaging setup. But expensive!