Summary
Målet med denne protokol er at ændre penetrans af dødbringende skelet mutant fænotyper i zebrafisk ved selektiv avl. Dødbringende mutanter kan ikke dyrkes til voksenalderen og avlet dem selv, derfor denne protokol beskriver en metode til sporing og vælge penetrans gennem flere generationer af afkom test.
Abstract
Zebrafisk mutant fænotyper er ofte utilstrækkeligt penetrant, kun manifesterer sig i nogle mutanter. Interessant fænotyper, der inkonsekvent vises kan være svært at studere, og kan føre til confounding resultater. Protokollen beskrevet her er en enkel avl paradigme kan øge og mindske penetrans i dødbringende zebrafisk skelet mutanter. Fordi dødbringende mutanter ikke kan selektivt avlet direkte, er den klassiske selektiv avl strategi afkom test ansat. Denne metode omfatter også protokoller for Kompetitive allel specifik PCR (KASP) genotypebestemmelse zebrafisk og farvning larve zebrafisk brusk og knogle. Anvende dyrehold strategi beskrevet her kan øge penetrans af en interessant skelet fænotype muliggør mere reproducerbare resultater i downstream applikationer. Derudover kan faldende de mutant penetrans gennem denne selektiv avl strategi afsløre de udviklingsmæssige processer, der kræver mest afgørende funktion af det muterede gen. Mens skelettet betragtes specifikt her, foreslår vi, at denne metode vil være nyttig for alle zebrafisk mutant linjer.
Introduction
For zebrafisk er en kraftfuld modelsystem for at forstå skelet udvikling. Med mutant zebrafisk stammer, kan biologer dechifrere genfunktion under skeletogenesis. Zebrafisk skelet mutant fænotyper kan fremsætte med variabel penetrans1,2,3,4 , som kan hindre udviklingsmæssige og genetiske analyser. Formålet med denne metode er tredobbelt. Først, generere zebrafisk mutant linjer, som hele tiden producerer alvorlige fænotyper muliggør downstream udviklingsmæssige undersøgelser som time-lapse optagelse5 og transplantation6. Disse former for undersøgelser kan blive lammet ved at forsøge at studere fænotyper, der kun manifesterer inkonsekvent. For det andet kan indavl zebrafisk stammer mindske genetiske baggrund variation, således at fremme eksperimenterende konsistens og reproducerbarhed. For eksempel kan udfører alle i situ hybridisering analyser på et selektivt indavlet stamme reducere konfunderende variabilitet og styrke konklusioner. For det tredje vil generering alvorlig og mild stammer afsløre hele fænotypiske serien, der kan skyldes en bestemt mutation.
Ved første øjekast, synes selektiv avl af dødbringende mutanter umuligt. Hvordan kan en race for penetrans når de dyr, der er scoret for udvælgelse er døde? Heldigvis, metoder til selektiv avl af familie udvalg, specielt afkom test, har bevist effektiviteten i husdyravl programmer for mange år7,8. Disse programmer anvendes hovedsageligt til selektiv avl for træk, som kun findes i én sex, som mælkeproduktionen i køer eller ægproduktionen i høns. Hanner af disse arter ikke blive scoret direkte, men deres afkom er scoret og en værdi tildeles derefter til forældrene. Låntagning fra denne strategi, indebærer protokollen præsenteres her scoring den faste og farves mutant afkom fra et par af zebrafisk, der er heterozygous for et mutant gen af interesse. Penetrans af en fænotype i homozygot dødbringende mutant afkom er tildelt forældre når de beslutter hvilke individer vil producere den næste generation i linjen. Vi finder, at denne metode er et effektivt middel til skiftende penetrans i zebrafisk dødbringende skelet mutanter1.
I lighed med andre undersøgelser, selektiv avl protokollen tager under overvejelse kriterier som kobling størrelse, overlevelse af afkom, normal udvikling af embryoner, og kønsfordelingen9. Men disse faktorer anses alle inden for rammerne af en mutant baggrund med formålet at flytte den mutante penetrans. Derfor, denne protokol udvider tidligere selektiv avl paradigmer ved at tilbyde en metode til at styrke udviklingsmæssige mutant analyser samt øge baggrunden homogenitet.
Denne protokol kræver omfattende genotypebestemmelse, så det er vigtigt at udvikle en pålidelig, hurtig genotypebestemmelse protokol på forhånd. Der er mange genotypebestemmelse protokoller findes10,11, men vi finde de KASP genotypebestemmelse12,13,14 koster hurtigere, mere effektiv og mere pålidelige end metoder baseret på begrænsning enzym kløvningen af forstærkede sekvenser10. Derfor, vi medtager en KASP protokol i dette arbejde. Derudover vi fokusere på skelet mutant fænotyper i denne protokol og omfatter en procedure for Alcian blå/Alizarin rød farvning modificeret fra tidligere protokoller15.
Metoden beskrevet her er en enkel strategi for skiftende dødbringende mutant penetrans opad eller nedad. Mens denne protokol fokuserer på skelet mutant fænotyper, mener vi, at det vil være en nyttig strategi for opdræt af alle mutant zebrafisk linjer. I virkeligheden, nytten af denne avl strategi sandsynligvis strækker sig ud over zebrafisk. Vi forudser, at denne protokol kan ændres for at flytte penetrans i en bred vifte af organismer. Shifting dødbringende penetrans af afkom test kan hjælpe fremskynde udviklingen i enhver udviklingsmæssige genetiker.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle eksperimenter beskrevet i denne protokol blev afsluttet i overensstemmelse og overensstemmelse med University of Colorado og University of Oregon institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC).
1. forberede umarkerede starter bestanden
- identificere heterozygous bærere af den mutante allel af interesse af fin klip 11 og genotypebestemmelse et lager af fuld-søskende dyr af en metode, som KASP 12 , 13 , 14. Denne protokol blev udført med zebrafisk mef2ca b1086 stamme.
- KASP genotypebestemmelse
Bemærk: Allel specifikke primere for KASP er designet af den virksomhed, der leverer reagenser (Se Tabel af materialer). For at opnå passende 6-carboxyl-X-rodamin (ROX) farvestof koncentrationen for de specifikke real-time PCR maskine besøge virksomhedens hjemmeside.- Sted zebrafisk hale væv i 50 µL af lysisbuffer (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof, 0,3% Octylphenyl-polyethylen glycol). Tilføje 10 µL af 10 mg/mL Proteinase-K pr. brønd af en 96-brønd PCR plade og fordøje i en termisk cycler ved 55 ° C i 2-5 timer efterfulgt af en 20 min 94 ° C inaktivering trin. Opbevares i køleskab lysis produkt efter fordøjelse.
Bemærk: Lysis produkter med held kan anvendes i flere måneder efter tilberedning. Når væv var mængden ved hjælp af 50 mM NaOH, KASP reaktioner har været forgæves. Disse resultater tyder på, at metoden NaOH for genomisk DNA forberedelse ikke er kompatibel med KASP. - Kvantificere genomisk DNA ved hjælp af et spektrofotometer. Fortynd skabelonen genomisk DNA ved hjælp af molekylær biologi klasse vand, således at hver reaktion indeholder ca 20-30 ng.
Bemærk: Kvantificere 4 eller 5 prøver, samle dem og derefter tilberedes fortyndinger for alle prøver baseret på gennemsnittet. Når du bruger denne protokol til voksen hale væv, er en 1: 100 fortynding ofte tilstrækkelig. Der kræves ikke en præcis kvantificering af DNA koncentration. - Tilføj 0,14 µL af KASP primer blandes og 5 µL af KASP master mix pr. sample på is i en 1,5 mL microcentrifuge tube og bland godt inden kort centrifugering for at indsamle indholdet i bunden af røret.
Bemærk: KASP master mix er varme og lys følsom, holde bestanden på is og undgå direkte lys. - Med pipette overfoeres 5 µL af primer/master mix løsning i wells af en 96-brønd optisk PCR plade egnet til de real-time PCR maskine bliver brugt.
- Med pipette overfoeres 5 µL fortyndet (cirka 5-7 ng/µL) DNA skabelon prøver i hver godt og Opsug med en pipette til mix.
- Tilføje 5 µL nukleasen-gratis vand til 3 wells til at tjene som no-skabelon kontrolelementer (NTC) og tilsættes 5 µL fortyndede bekræftede homozygot vilde type, heterozygous og homozygot mutant DNA skabelon for positive kontroller.
- Placer et optisk klar film sæl over den plade, at sikre, at filmen er fuldt forseglet på hver brønd.
- Kort centrifugeres plade på 600 x g at indsamle indholdet i bunden og fjerne bobler fra mix.
Bemærk: Hold plade på is og skjold fra lys indtil klar til at fortsætte. - Bruge programmet cykling vist i tabel 1 til at udføre de vigtigste KASP reaktion.
- Se den resulterende scatter plot produceret af analyse computer. En vellykket reaktion vil vise 4 forskellige grupperinger af punkter på plot ( figur 3): tre prøve grupperinger svarende til genotype og ét gruppering af NTCs i nærheden af oprindelse. Den positive kontrol bør adskille med passende prøve gruppering.
- Hvis edb-programmet ikke genkender plottet grupperinger som svarer til specifikke genotyper, yderligere cykling sæt kan være nødvendig (tabel 2). Gentag programmet yderligere, indtil computeren genkender stramme grupperinger af genotype.
- Eksportere genotypebestemmelse resultaterne til en regnearksfil for lettere anvendelse og analyse.
- Sted zebrafisk hale væv i 50 µL af lysisbuffer (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2, 0,3% nonionisk overfladeaktivt stof, 0,3% Octylphenyl-polyethylen glycol). Tilføje 10 µL af 10 mg/mL Proteinase-K pr. brønd af en 96-brønd PCR plade og fordøje i en termisk cycler ved 55 ° C i 2-5 timer efterfulgt af en 20 min 94 ° C inaktivering trin. Opbevares i køleskab lysis produkt efter fordøjelse.
- Hus de identificerede heterozygous dyr sammen på den største vandsystem.
2. den første runde af afkom Scoring
- parvis cross søskende heterozygote
- efter dyrene tilbagesøge fin klip, oprette parvise intercrosses. Bruge dividers for embryoner er synkron 16.
- Indsamle embryoner og holde forældreorlov par isoleret i avl bure.
- Skærmen isolerede voksne, så aggressiv fisk kan være adskilt eller forsynet med cover (strimlet fisk net arbejde pænt). Fisk skal fodres og deres vand ændret efter IACUC retningslinjer i statisk vand.
- Embryo opdræt
- scenen og hæve zebrafisk embryoner til larver under standardbetingelser 17.
- Indsamle fænotype vildtype dyr ved hjælp af et glas pipette på dag 5 eller 6 Når svømme blæren er oppustet i 75% af koblingen. Placer fænotypiske vilde typer i børnehaven registrering hvilken forældre gav dem.
Bemærk: Med mutante alleler, der er recessiv dødbringende, hvilket er tilfældet for mange skelet mutanter, homozygot mutanter undlader at form svømme blærer 18 , 19. Derfor fænotypiske vilde typer kan let skelnes fra deres mutant søskende baseret på oppustede svømme blærer.
- Alcian blå/Alizarin rød brusk og knogle farvning
- bedøver larver, der ikke puste deres svømme blærer ved hjælp af 0,17 g/L Tricaine-S i embryo medier. Indsamle dyr i 1,5 mL microcentrifuge rør med en wide-bore glas Pasteur pipette. Tilføj ikke mere end 100 larver pr tube.
- Fjerne embryo vand fra hver tube og løse dyr i 1 mL 2% PARAFORMALDEHYD i 1 x PBS pr tube.
Forsigtighed: Vandige PFA er brændbart og vil forårsage alvorlige hud- og øjenirritation. Bære passende personlige værnemidler som handsker og beskyttelse af øjne, og vask hænder grundigt efter brug. - Rock for 1 h; længere fiksering svækker knoglen farvning. Check af rør jævnligt i løbet af denne og alle efterfølgende vuggende skridt til at sikre, at ingen larver være blevet stukket til side eller klumpet i bunden af røret.
- Fjern fiksativ fra rør ved hjælp af et glas pipette, tilsættes 1 mL 50% ethanol, og rock i 10 min.
- Forbered frisk farvning løsning ved at tilføje 20 µL af 0,5% Alizarin rød per 1 mL af Alcian premix (0,04% Alcian blå/10 mM MgCl 2 / 80% ethanol). Fjern 50% ethanol, tilsættes 1 mL af farvning løsning til hvert rør, og rock natten over. Larverne kan forblive i pletten i op til 5 dage.
- Fjerne pletten løsning fra rør og tilsættes 1 mL 80% ethanol/10 mM MgCl 2 løsning til hvert rør. Rock rør i mindst 1 time; skylning overnatning kan producere en klarere Alcian blå plet.
- Fjerne 80% ethanol/10 mM MgCl 2 løsning fra rør og tilsættes 1 mL 50% ethanol, rock i 5 min.
- Fjerne 50% ethanol løsningen fra rør og tilsættes 1 mL 25% ethanol og rock i 5 min.
- Fjern 50% ethanol opløsning fra rør og tilsæt 1 mL frisklavet 3% H 2 O 2 /0.5% KOH blegning løsning. Forlade caps åben og lad rør står i en mikro-tube rack i ca 10 min eller indtil en svag brun farvning kan ses i den øverste del af løsningen.
Bemærk: Et lag af bobler form oven på løsningen. Omhyggelig timing er påkrævet på dette trin, som over blegning vil resultere i en dårlig dobbelt pletten. - Fjerne den blegning løsning og tilsættes 1 mL 25% glycerol/0.1% KOH; rock i 10 min til 1 h.
- Fjerne 25% glycerol/0.1% KOH løsning fra rørene, tilsættes 1 mL 50% glycerol/0.1% KOH løsning til hver tube, rock i 10 min at overnatte.
- Fjerne 50% glycerol/0.1% KOH løsning fra rør og igen tilføje 50% glycerol/0.1% KOH løsning til hvert rør. Rokkende vil natten hjælpe med at fjerne luftbobler, der kan ophobes inde larver. Butik farves knogle præparater ved 4 ° C, når den ikke bruges.
- Fænotype scoring
- Score farves mutant afkom til penetrans af den valgte fænotype. I Nichols et al. 1 mutanter blev scoret for enhver forekomst af ektopiske knogle.
Bemærk: Fordi zebrafisk forældre er i statisk vand og Alizarin rød plet kan blegne med tiden, det er vigtigt at score skeletter inden for et par dage for at fuldføre skeletal udarbejdelse. - Penetrans er andelen af en genotype, der har en fænotype. Beregn den procentvise penetrans ved følgende formel:
% penetrans = (mutanter med fænotype) / (antal mutanter) × 100
- Score farves mutant afkom til penetrans af den valgte fænotype. I Nichols et al. 1 mutanter blev scoret for enhver forekomst af ektopiske knogle.
3. Familiens valg
- Vælg to høj penetrans og to lav penetrans familier for den næste generation. Ud over penetrans er det vigtigt at overveje frugtbarhed og vigor, når de vælger hvilke familier at udbrede; Se diskussion for flere detaljer herom.
- Give hver forældre par en sub stock id: familie.01,.02, etc.
- Hus forældre par på de vigtigste system med flere blandet sex ' følgesvend ' fisk. Følgesvend fisk kan være enhver zebrafisk linje med faste, tydelige kendetegn, såsom ændret pigmentering eller fin struktur.
Bemærk: Mens mange forskere med held holde kun ynglende par i en tank, ses gunstige resultater af boliger par med flere følgesvend fisk. Dette valgfrie trin giver mulighed for ynglende par af dyr skal holdes i større skoler og hentes nemt så de kan være gentagne gange krydsede efter behov. Forældrenes par kan være krydsede gentagne gange for at generere store fuld-søskende familier; vente mindst en uge før Gentag krydser de samme forældre par. - Frasortering af larve familier fra trin 2.2.2. der er ikke valgt for den næste generation.
- Mærke de tanke, der indeholder wild-type søskende larver fra udvalgte familier med penetrans fra deres mutant søskende og rejse til voksenalderen som normal.
- Den næste generation vil have mindst fire fuld-søskende familier, to for den opadgående linje og to for den nedadgående linje.
- Når larverne har nået kønsmodenhed, Gentag protokollen startende fra første trin med den nye generation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol er en langsigtet dyrehold teknik nyttig for forståelsen zebrafisk skelet mutanter (figur 1). Selektiv opdragelse af afkommet test bør give et skift i samlede penetrans nedad eller opad i et par generationer (figur 2). I vores tidligere arbejde kørte to runder af selektiv avl den gennemsnitlige penetrans nedad fra 17% til 3%1. På samme måde i vores opadgående linje skiftede vi den gennemsnitlige penetrans opad fra 63% til 93% i tre generationer. Hvis efter fire runder af selektiv avl penetrans ikke reagerer nedad eller opad, er det muligt at fænotype, der er ved at blive scoret ikke er følsomme over for selektiv opdragelse af afkommet test.
I en vellykket KASP udført procedure, stramme grupperinger af prøverne modsvarer genotype bør anerkendes af edb-programmet, og NTCs skal i nærheden af oprindelsen af plottet, efter tilstrækkelig cykler har været (figur 3). Hvis KASP scatter plot data ikke grupperes stramt eller forurening i én NTC er opdaget, vil programmet være afskåret fra afgøre genotyper. Hvis de fleste prøver er anerkendt af genotype gruppering, men der er stadig nogle der er tvetydige, udelade ubestemt prøver fra de data, der kan tillade programmet at genkende genotypebestemmelse klynger. Ubestemt prøve opkald og tvetydige genotype gruppering kan skyldes følgende: forurenet reaktion blandinger, hvor NTCs ikke vil gruppere nær oprindelse, over fortyndet skabelon DNA forårsager prøver at finde i nærheden af oprindelse, under-fortyndet skabelon DNA , eller utilstrækkeligt antal reaktion cyklusser. Forberede friske NTCs, hvis er mistanke om kontaminering.
En vellykket Alcian blå/Alizarin rød plet vil have vibrantly farvede knogle og brusk elementer (figur 4A) ikke er gennemsigtig eller svag (figur 4B). Grænserne for brusk elementer skal vises sprød, og enkelte chondrocytter vil være mærkbar. Alizarin rød knogle pletten er som regel de mere kræsen af de to pletter. Fan-formet opercle (op) knogle og stick formet branchiostegal stråler (br) er gode indikatorer for en vellykket 6 dage post befrugtning (dpf) knogle plet (figur 4A, op, br). Trinnet blegning bør ikke falme pletter i knogler og brusk mens fuldt clearing andre væv i farve. Øjnene vil have en brun nuance selv efter vellykket farvning og clearing. Alcian Blue, der er også koncentreret vil ikke klart fra andre væv, at gøre analyse umuligt (figur 4 c). Alcian blå fra kreditorer end beskrevet i materialets tabel kan også producere dårlige brusk pletter.
Figur 1 . Skematisk oversigt over selektiv avl for skelet penetrans af afkom test. (A) Genotype en fuld-søskende familie fra en mutant linje til at identificere heterozygous luftfartsselskaber. (B) Pair-wise krydse identificerede heterozygous søskende, og holde forældre isoleret indtil afkom kan blive scoret. (C) placere fænotype vildtype larver med oppustede svømme blærer i børnehaven til hæves til voksenalderen, og fastsætte mutant larver uden oppustede svømme blærer for brusk og knogle farvning. (D) Score hver kobling af Alcian blå/Alizarin rød farvet mutant dyr for penetrans. Vælg hvilke familier vil være avlet opad og nedad og hæve de fænotypiske vilde typer fra hver familie til voksenalderen. (E) hus forældrenes par med kammerater, således at de kan være gentagne gange krydsede for at generere store fuld-søskende familier. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 . Eksempel på skiftende skelet Mutant penetrans af afkom test. Selektiv avl blev som beskrevet i dette manuskript anvendt til zebrafisk mef2cab1086 mutant. I dette eksperiment valgt vi for høj eller lav penetrans af ektopiske knogle mellem opercle og branchiostegal stråle i dødbringende homozygot mutanter. Penetrans af ektopiske knogle i mutant afkom blev tildelt den parental par, der var farvekodede af penetrans, som vist. Dette tal blev ændret fra1. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 . Skærmbillede fra Software, der bruges til KASP genotypebestemmelse og resultater analyser.
I denne vellykkede KASP reaktion, blev stramme prøve grupperinger dannet. Blå punkter er homozygot mutant, grønne punkter er heterozygous, røde punkter er homozygot vildtype, og sorte firkanter er NTCs. grupperinger blev udpeget af edb-programmet. NTCs er i nærheden af oprindelsen af plottet for lidt at ingen reaktion blanding forurening. Ubestemt prøver, der endnu ikke er tildelt en genotype ville være angivet med et x. Der er ingen ubestemte prøver til stede i denne vellykket afsluttet run. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 . Gode, dårlige og grimme Alcian blå/Alizarin rød knogle præparater.
(A) et eksempel på en frisk, smukt farvede og ryddet brusk og knogle pletten er vist. Bemærk særskilt brusk elementer og let visualiseret røde opercle (op) og branchiostegal ray (br) knogler. (B) en svag brusk pletten med falmede Alizarin rød plet er vist. Dette eksempel sad ved 4 ° C for mange måneder resulterer i falmede brusk samt opercle og branchiostegal ray knogler, der er vanskeligt at skelne. (C) en over farvede larve hvor for meget Alcian blå blev brugt. Skalalinjen er 200 μm. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selektiv avl afslører finesser af genfunktioner
Shifting mutant fænotyper for at være mere eller mindre alvorlige ved selektiv avl er en enkel måde at få ny indsigt i genfunktion. Sammenlignet med standard metoder af umarkerede avl, kan protokollen præsenteres her give en langt mere komplet forståelse af mutant fænotyper. Specifikt, ved at generere stammer, der er svær, kan den fulde bredde af mutant fænotyper blive afsløret, herunder nogle, der var verificeringsprocedurer med umarkerede bestande. Således kan blive opdaget nye udviklingsmæssige roller til gene under undersøgelsen. Omvendt kan skaber mild stammer afsløre de mest afgørende roller for gen af interesse. Tag, for eksempel, kun en enkelt fænotype fortsætter i mild mutanter. Her er det sandsynligt, at den udviklingsproces, der fortsat er forstyrret i en mild stamme mest kritisk kræver funktionen af genet. Derfor, den fuld fænotypiske serie af en given mutation kan forstås mere fuldt ud gennem selektiv avl.
Undgå indavls Depression
Afkom af relaterede enkeltpersoner demonstrere reduceret overlevelse og frugtbarhed i mange dyre- og plantearter systemer, herunder zebrafisk20. Kendt som indavls depression, de fleste modeller postulere at øget homozygocitet på loci med enten recessive skadelige alleler eller alleler, der er gavnligt som heterozygote ligge til grund for dette fænomen21. Undersøgelser med indfanget zebrafisk afsløre en lav frekvens af skadelige alleler i naturlige populationer22. Derudover blev laboratorium stammer som AB yderligere ryddet af recessive dødelige mutationer23. Det synes således at forsigtig dyrehold kan tillade ubestemt indavl valgte zebrafisk linjer. En nylig rapport afslørede faktisk, at zebrafisk kan vedligeholdes af fuld-søskende indavl for mindst 16 generationer9.
Denne protokol understreger et par enkle men vigtige skridt for at sikre, at indavlede zebrafisk linjer fortsat til at producere nok afkom for at være nyttige for udviklingsmæssige undersøgelser. Det mest afgørende aspekt af denne selektiv avl strategi er udvælgelsesprocessen, selv. Første skal udvikle dyr overvåges nøje for at familier med udviklingsmæssige defekter eller abnormiteter, fjernet linket til mutation af interesse, kan vælges nøje mod. Andet, kobling størrelse betragtes som selektiv avl kræver store familier. Ud over at vælge par, der giver store koblinger, børnerige familier kan genereres gennem gentagne krydsninger af de samme forældre par. At holde forældreorlov par i tanke, med mange andre følgesvend fisk, som er let skelnes fra ynglende par, såsom pigmentering eller fin mutanter, giver mulighed for langsigtet boliger af ynglende par i store conspecific grupper, mens at tillade dem at stadig være nemt identificeret og hentet. Denne praksis fremmer et sundt socialt miljø hvor forældrenes parret er gratis at shoal med andre zebrafisk24. Endnu kan forskeren nemt hente forældrenes parret så at de kan blive krydset flere gange, gør det muligt for generation af meget store familier, fuld-søskende.
At vælge en valgbar fænotype
Denne protokol indebærer stor fænotype scoring. En begrænsning er således, at udvælgelsen skal anvendes på en fænotype, der er let at visualisere og score hurtigt. Det er også vigtigt at beslutte, hvilken fase dyr bliver fast og farvet for scoring. Knogle fænotyper er det fordelagtigt at vente indtil 6 dpf, fordi knoglerne er mere udviklet25 og vil være mere let scorede. For brusk mønster mutant fænotyper, er 4 dpf ofte velegnede til fænotype scoring26,27. Til at beslutte, hvornår de skal løse dyr, er det vigtigt at overveje, hvis gen interesse har pleiotrope roller fører til udviklingsmæssige mutant fænotyper i andre væv, hvilket kan resultere i confounding sekundære defekter. For eksempel, med skelet mutanter, der også viser hjerte ødem er det vigtigt at fastsætte på 4 dpf før sekundære defekter som en generel forsinkelse i chondrogenesis manifestere26.
For enkelhed valgte vi en binær pointsystem fokuserer på penetrans til vores selektiv avl. Mutant fænotyper kan dog også have variable ekspressivitet. I fremtidige undersøgelser, det vil være interessant at afprøve, hvis ligesom penetrans, ekspressivitet er følsomme over for selektiv avl. Det vil sige, kan hyppigheden af specifikke ektopisk knogle figurer ændres gennem selektiv avl?
Denne protokol beskriver den klassiske selektive avl strategi afkom udvælgelse og anvendelse til zebrafisk udviklingsmæssige genetiske undersøgelser. De ligetil opdrætsmetoderne beskrevet her er muligt på alle laboratorier, selv i små faciliteter. Gennem selektiv avl, en af de største styrker i ordningen for zebrafisk kan tractable genetik, udnyttes for at lære om genfunktion i nyudviklede mutanter samt mutanter, som er blevet opformeret i årtier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Vi vil gerne takke Chuck Kimmel vejledning, John Dowd om hjælp til at udvikle denne avl strategi, Macie Walker for hendes arbejde med at perfektionere skelet pletten og Charline Walker og Bonnie Ullmann for nyttige zebrafisk rådgivning. Dette arbejde blev støttet af K99/R00 DE024190 til JTN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
