Summary
Le but du présent protocole est de modifier la pénétrance de lethal phénotypes mutants squelettiques chez le poisson zèbre par reproduction sélective. Mutants létaux ne peuvent pas être cultivés à l’âge adulte et se sont élevés, donc ce protocole décrit une méthode de suivi et en sélectionnant une pénétrance à travers plusieurs générations de tests de descendance.
Abstract
Poisson zèbre phénotypes mutants sont souvent incomplètement par ressuage, se manifestant uniquement chez certains mutants. Des phénotypes intéressants qui apparaissent de manière irrégulière peuvent être difficiles à étudier et peuvent mener à la confusion des résultats. Le protocole décrit ici est un paradigme de reproduction simple pour augmenter ou diminuer la pénétrance chez les mutants squelettique létale de poisson-zèbre. Parce que des mutants létaux ne peuvent être sélectivement directement, la stratégie de reproduction sélective classique des tests de descendance est employée. Cette méthode comprend également les protocoles pour Kompetitive allèle spécifique PCR (KASP) génotypage poisson zèbre et coloration larves de poisson zèbre cartilage et OS. Application de la stratégie d’élevage décrite ici peut augmenter la pénétrance d’un phénotype squelettique intéressant permettant des résultats plus reproductibles dans les applications en aval. En outre, diminuant la pénétrance mutante grâce à cette stratégie de reproduction sélective peut révéler les processus de développement qui nécessitent surtout la fonction du gène muté. Le squelette est considérée comme plus précisément ici, nous proposons que cette méthodologie sera utile pour toutes les lignées mutantes de poisson-zèbre.
Introduction
Le poisson-zèbre est un système puissant modèle pour comprendre le développement du squelette. Avec des souches mutantes de poisson-zèbre, les biologistes peuvent déchiffrer la fonction du gène au cours de la formation squelettique. Cependant, les phénotypes mutants squelette de poisson-zèbre peuvent présenter avec une pénétrance variable1,2,3,4 qui peut gêner les analyses génétiques et de développement. Le but de cette méthode est triple. Tout d’abord, générant zebrafish lignées mutantes qui produisent régulièrement des phénotypes sévères permet des études sur le développement en aval comme enregistrement Time-lapse5 et transplantation6. Ces sortes d’études peuvent être paralysés en essayant d’étudier les phénotypes qui seulement manifestent de façon incohérente. Deuxièmement, consanguinité zebrafish souches peut diminuer la variation génétique, favorisant ainsi la reproductibilité et la cohérence expérimentale. Par exemple, les analyses d’hybridation sur une souche consanguine sélectivement tous in situ peuvent réduire la variabilité confondant et renforcer les conclusions. En troisième lieu, générant des souches sévères et douces vous révélera toute la série phénotypique qui peut résulter d’une mutation particulière.
À première vue, un élevage sélectif de mutants létaux semble impossible. Comment une race pour la pénétrance lorsque les animaux sont marqués pour la sélection sont morts ? Heureusement, méthodes d’élevage sélectif de sélection familiale, spécifiquement les descendants essais, ont démontré l’efficacité dans l’élevage des programmes pour les nombreuses années7,8. Ces programmes sont principalement utilisés pour la reproduction sélective pour les caractères qui ne sont présentes que dans un sexe, comme la production de lait chez la vache ou la production d’oeufs chez les poules. Les mâles de ces espèces ne peuvent être marqués directement, mais leur progéniture est notés et une valeur est alors attribuée aux parents. Empruntant cette stratégie, le protocole présenté ici consiste à marquer la progéniture mutante fixe et teintée d’une paire de poisson-zèbre qui sont hétérozygotes pour un gène mutant d’intérêt. La pénétrance d’un phénotype dans la descendance mutante mortelle homozygote est attribuée aux parents lorsqu’ils décident quels individus vont produire la prochaine génération de la ligne. Nous constatons que cette méthode est un moyen efficace de déplacer une pénétrance in zebrafish mutants squelettique létale1.
Semblable à d’autres études, ce protocole de reproduction sélective prend en vertu de critères d’examen comme couvée, la survie de la progéniture, développement normal des embryons et sex-ratio9. Toutefois, ces facteurs sont tous considérés dans le contexte d’un fond de mutants dans le but de déplacer la pénétrance mutante. Par conséquent, ce protocole étend précédent paradigmes de reproduction sélective en proposant une méthode pour renforcer les analyses mutants du développement ainsi que pour accroître l’homogénéité de l’arrière-plan.
Ce protocole requiert une vaste génotypage, aussi est-il important de développer un protocole fiable et rapide de génotypage à l’avance. Il y a nombreux génotypage protocoles disponibles10,11, cependant, nous trouvons le KASP génotypage12,13,14 est plus rapide, plus efficace et plus fiable que les méthodes de coût issu des enzymes de restriction le clivage des séquences amplifiées10. Par conséquent, nous incluons un protocole KASP dans ce travail. En outre, nous concentrer sur les phénotypes mutants squelettiques dans le présent protocole et incluent une procédure pour une coloration modifiée de précédents protocoles15Alcian bleu/alizarine rouge.
La méthode décrite ici est une stratégie simple pour déplacer une pénétrance mutante mortelle vers le haut ou vers le bas. Alors que ce protocole met l’accent sur les phénotypes mutants squelettiques, nous pensons que ce sera une stratégie utile pour l’élevage de poisson-zèbre mutant toutes les lignes. En fait, l’utilité de cette stratégie de reproduction susceptible s’étend au-delà de poisson-zèbre. Nous prédisons que ce protocole peut être modifié pour décaler la pénétrance dans un large éventail d’organismes. Décalant pénétrance létale de tests de descendance peut aider à faire avancer l’état d’avancement d’un généticien du développement.
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Protocol
toutes les expériences décrites dans le présent protocole ont été achevés en conformité et le respect de l’Université du Colorado et de l’Université de l’Oregon animalier institutionnel et utilisation comités (IACUC).
1. préparer le Stock de départ non sélectionnés
- Identify hétérozygotes porteurs de l’allèle mutant d’intérêt par la nageoire clip 11 et génotypage un stock d’animaux plein-frère par une méthode de choix, tels que KASP 12 , 13 , 14. Ce protocole a été réalisé avec la souche de mef2ca b1086 de poisson-zèbre.
- Génotypage KASP
Remarque : Des amorces spécifiques pour KASP allèle sont conçus par la société qui fournit les réactifs (voir Table des matières). Pour obtenir la concentration de colorant 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) appropriée pour la machine PCR en temps réel spécifique visitez le site Web de l’entreprise.- Place le tissu de queue de poisson-zèbre dans 50 µL de tampon de lyse (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2 surfactant non ionique de 0,3 %, 0,3 % octylphényle-polyéthylène glycol). Ajouter 10 µL de 10 mg/mL protéinase-K / puits d’une plaque PCR 96 puits et digérer dans un thermocycleur à 55 ° C pendant 2 à 5 h, suivie d’une étape d’inactivation de 94 ° C 20 min. Réfrigérer le produit lyse après digestion.
Remarque : produits de lyse peuvent être utilisés avec succès pendant plusieurs mois après sa préparation. Lorsque le tissu a été lysé en utilisant 50 mM NaOH, les réactions de KASP ont échoué. Ces résultats suggèrent que la méthode de NaOH de préparation d’ADN génomique n’est pas compatible avec KASP. - Quantifier l’ADN génomique à l’aide d’un spectrophotomètre. Diluer la matrice d’ADN génomique à l’aide de l’eau de qualité biologie moléculaire afin que chaque réaction contient environ 20-30 ng.
NOTE : Quantifier les 4 ou 5 échantillons, leur poule, puis préparer des dilutions pour tous les échantillons en que se basés sur la moyenne. Lorsque vous utilisez ce protocole pour tissu adulte queue, une dilution au 1/100 est souvent suffisante. La quantification précise de la concentration d’ADN n’est pas nécessaire. - Ajouter 0,14 µL de l’apprêt KASP mélanger et 5 µL du maître KASP mélanger par exemple sur la glace dans un tube de microtubes de 1,5 mL et mélanger bien avant la centrifugation brièvement pour collecter le contenu au fond du tube.
Remarque : Mélange maître KASP est chaleur et lumière sensible, garder le stock sur la glace et éviter la lumière directe. - Pipette 5 µL d’apprêt/master mélanger la solution dans les puits d’une plaque PCR 96 puits optique pour la machine PCR en temps réel utilisée.
- Pipette 5 µL de dilué (environ 5-7 ng/µL) des échantillons d’ADN modèle dans chaque bien et aspirer avec une pipette pour mélanger.
- Ajouter 5 µL d’eau exempte de nucléase à 3 puits servent de commandes non-modèle (NTC) et ajouter 5 µL de dilué hétérozygote et homozygote matrice d’ADN mutant pour contrôles positifs type confirmé homozygote sauvage,.
- Placer un joint de film transparent sur la plaque en veillant à ce que le film est entièrement étanche sur chaque puits.
- Centrifuger brièvement la plaque à 600 g pour collecter le contenu en bas et retirer le mélange de bulles.
NOTE : Garder la plaque sur la glace et le bouclier de lumière jusqu’au moment de procéder. - Utiliser le programme cyclisme indiqué au tableau 1 pour effectuer la réaction principale de KASP.
- Découvre le diagramme qui en résulte produit par l’ordinateur d’analyse. Une réaction fructueuse montrera 4 groupes distincts de points sur le terrain ( Figure 3) : trois exemples de groupements correspondant au génotype et un regroupement des NTCs près de l’origine. Les témoins positifs doivent séparer avec le groupement d’échantillon approprié.
- Si le logiciel ne reconnaît pas l’intrigue groupements comme correspondant à des génotypes spécifiques, cyclisme jeux supplémentaires peuvent être nécessaires (tableau 2). Répéter le programme supplémentaire jusqu'à ce que l’ordinateur reconnaît les groupements serrés de génotype.
- Les résultats de génotypage d’exportation vers un fichier de feuille de calcul pour l’utilisation et l’analyse plus facile.
- Place le tissu de queue de poisson-zèbre dans 50 µL de tampon de lyse (10 mM tris (pH 8,3), 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2 surfactant non ionique de 0,3 %, 0,3 % octylphényle-polyéthylène glycol). Ajouter 10 µL de 10 mg/mL protéinase-K / puits d’une plaque PCR 96 puits et digérer dans un thermocycleur à 55 ° C pendant 2 à 5 h, suivie d’une étape d’inactivation de 94 ° C 20 min. Réfrigérer le produit lyse après digestion.
- Abritent les animaux hétérozygotes identifiés ensemble sur le circuit d’eau principal.
2. la première ronde de descendance Scoring
- Croix Pairwise hétérozygotes frère
- après les animaux récupérer dans le clip de nageoire, mis en place des croisements par paires. Permet de s’assurer que les embryons sont synchrones 16 diviseurs.
- Recueillir les embryons et garder les paires de parents isolés dans des cages d’élevage.
- Suivre des ailés isolés afin que les poissons agressifs peuvent être séparés ou fournis avec housse (émincé de poisson filets travail joliment). Les poissons doivent être nourris et leur eau changée suivant directives IACUC en statique de l’eau.
- Embryon élevage
- stade et soulever les embryons de poisson-zèbre à larves sous conditions standard 17.
- Recueillir les animaux de phénotype sauvage à l’aide d’une pipette de verre 5 ou 6 jours lorsque la vessie est gonflée à 75 % de l’embrayage. Placer les types sauvages phénotypiques dans la pépinière d’enregistrement des parents ont donné leur.
Remarque : Avec des allèles mutants qui sont récessive létale, ce qui est vrai de nombreux mutants squelettiques, mutants homozygotes ne forme la vessie natatoire 18 , 19. Par conséquent, phénotypique des types sauvages peut facilement discerner leurs frères et sœurs mutant issu des vessies gonflées.
- Alcian bleu/alizarine rouge du cartilage et des os taches
- anesthésier les larves qui ne pas gonflent leur vessie natatoire à l’aide de 0,17 g/L Tricaine-S dans les médias de l’embryon. Recueillir des animaux dans des tubes de microcentrifuge de 1,5 mL avec un verre large-alésage pipette Pasteur. Ajouter pas plus de 100 larves par tube.
- Retirer l’eau de l’embryon dans chaque tube et Difficulté animaux dans 1 mL de paraformaldéhyde à 2 % dans du PBS 1 x par tube.
Mise en garde : PFA aqueux est combustible et provoquera une grave irritation de peau et des yeux. Porter des équipements de protection individuelle appropriés tels que des gants et des lunettes de protection et laver soigneusement les mains après utilisation. - Rock pendant 1 h ; fixation plue atteinte osseuse coloration. Vérifier les tubes régulièrement au cours de cette, et toutes les étapes subséquentes de bascule pour n’assurer aucune larve ils sont collés sur le côté ou groupé en masse compacte dans le fond du tube.
- Retirer le fixateur de tubes à l’aide d’une pipette en verre, ajouter 1 mL d’éthanol à 50 % et le rock pendant 10 min.
- Préparation douce solution de coloration en ajoutant 20 µL de 0,5 % alizarine rouge par 1 mL de Alcian prémélanger (0,04 % bleu Alcian/10 mM MgCl 2 / 80 % d’éthanol). Enlever 50 % d’éthanol, ajouter 1 mL de solution à chaque tube et le rocher de coloration du jour au lendemain. Les larves peuvent rester dans la tache jusqu'à 5 jours.
- Enlever la solution de coloration des tubes et ajouter 1 mL de 80 % d’éthanol/10 mM MgCl 2 solution dans chaque tube. Rock les tubes pendant au moins 1 h ; rinçage pendant la nuit peut produire une tache plus claire de bleu Alcian.
- Déposer les 80 % éthanol/10 mM MgCl 2 solution des tubes et ajouter 1 mL d’éthanol à 50 % ; rock pendant 5 min.
- Supprimer la solution d’éthanol de 50 % des tubes et ajouter 1 mL d’éthanol à 25 % et rock pendant 5 min.
- Retirer la solution d’éthanol à 50 % des tubes et ajouter 1 mL fraîchement préparé 3 % H 2 O 2
/0.5%. Laisser les caps ouverte et laisser les tubes sont dans un micro-portoir pendant environ 10 min ou jusqu'à ce qu’une légère coloration brune peut être vu dans la partie supérieure de la solution.
Remarque : Une couche de forme de bulles sur le dessus de la solution. Attention calendrier est nécessaire à cette étape, comme plus de blanchiment se traduira par une pauvre tache double. - Enlever la solution de blanchiment et ajouter 1 mL de glycerol/0.1% 25 % KOH ; rock pendant 10 min à 1 h.
- Retirer 25 % solution de KOH glycerol/0.1% des tubes, ajouter 1 mL de solution de KOH glycerol/0.1% 50 % dans chaque tube, rock pendant 10 min pour la nuit.
- Retirer la solution de KOH glycerol/0.1% 50 % des tubes et ajouter encore 50 % glycerol/0.1% solution de KOH à chaque tube. Bascule du jour au lendemain permettra d’éliminer les bulles d’air qui peuvent s’accumuler à l’intérieur des larves. Magasin teinté squelettiques préparations à 4 ° C lorsque non utilisé.
- Notation de phénotype
- Score teinté rejeton mutant pour la pénétrance du phénotype sélectionné. Dans Nichols et al. 1 mutants ont été évalués pour n’importe quelle occurrence des os ectopique.
Remarque : Parce que les parents de poisson-zèbre sont en statique de l’eau et la tache rouge d’alizarine peut s’estomper avec le temps, il est important de marquer des squelettes dans les prochains jours de l’achèvement de la préparation squelettique. - Pénétrance est la proportion d’un génotype qui possède un phénotype. Calculer la pénétrance pourcentage selon la formule suivante :
% pénétrance = (mutants avec phénotype) / (nombre total de mutants) × 100
- Score teinté rejeton mutant pour la pénétrance du phénotype sélectionné. Dans Nichols et al. 1 mutants ont été évalués pour n’importe quelle occurrence des os ectopique.
3. Sélection famille
- choisir deux pénétrance élevée et deux familles de pénétrance faible pour la prochaine génération. En plus de la pénétrance, il est important de considérer la fécondité et la vigueur en choisissant quelles familles se propager ; Voir la Discussion pour plus de détails sur cette.
- Donner chaque paire parentale un identificateur stock sup : famille.01,.02, etc.
- Maison des couples parents sur le système principal avec plusieurs sexe mixte ' compagnon ' poissons. Poisson de compagnon peut être n’importe quelle ligne de poisson-zèbre permanente, évidente des traits distinctifs, tels que structure altérée de pigmentation ou de la fin.
Remarque : Alors que de nombreux chercheurs maintenir avec succès uniquement couples reproducteurs dans un réservoir, des résultats favorables sont vus par paires avec plusieurs poissons de compagnon de logement. Cette étape facultative permet aux couples d’animaux à être tenu dans les grandes écoles et facilement Récupérée alors qu’ils peuvent être croisés à plusieurs reprises si nécessaire. Les couples parents peuvent être croisés à plusieurs reprises pour générer des familles nombreuses de plein-frère ; attendre au moins une semaine avant la répétition traversant la même paire parentale. - Abattre les familles larvaires de l’étape 2.2.2. qui n’étaient pas sélectionné pour la prochaine génération.
- Étiqueter les réservoirs contenant les larves sauvage enfant de mêmes parents de familles sélectionnées avec la pénétrance de leurs frères et soeurs mutantes et sensibiliser à l’âge adulte, comme d’habitude.
- La prochaine génération aura au moins quatre familles de plein-sibling, deux pour la ligne vers le haut et deux pour la ligne descendante.
- Quand les larves atteignent la maturité sexuelle, répétez le protocole à partir de la première étape avec la nouvelle génération.
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Representative Results
Ce protocole est une technique d’élevage à long terme utile pour les mutants de squelette de poisson-zèbre de compréhension (Figure 1). Élevage sélectif en testant la progéniture devrait produire un changement dans une pénétrance globale aussi bien vers le bas et vers le hausse dans quelques générations (Figure 2). Dans nos travaux précédents, deux cycles de reproduction sélective a roulé la pénétrance moyenne à la baisse de 17 % à 3 %1. De même, dans notre gamme vers le haut, nous sommes passés la pénétrance moyenne vers le haut de 63 % à 93 % en trois générations. Si après quatre cycles de reproduction sélective la pénétrance ne répond pas vers le bas ou vers le haut, il est possible que le phénotype qui est étant marqué n’est pas sensible à la reproduction sélective par des tests de descendance.
Dans un succès KASP procédure, serrée, groupements d’échantillons correspondant au génotype devraient être reconnus par le programme informatique, et les NTCs doivent être situés près de l’origine du complot après que cycles suffisants ont été effectuées (Figure 3). Si les données de parcelles de nuages de points XY KASP ne sont pas étroitement groupées ou contamination dans un NTC est détectée, le programme sera incapable de déterminer les génotypes. Si la plupart des échantillons sont reconnus par le génotype de regroupement, mais il y a encore certains qui sont ambigus, omettant indéterminés échantillons provenant de l’ensemble de données peut permettre le programme pour récompenser des grappes de génotypage. Appels d’échantillon indéterminé et le regroupement de génotype ambiguë peuvent résulter de ce qui suit : mélanges de réaction contaminés dans lequel NTCs regroupera pas près de l’origine, ADN modèle trop dilué causant des échantillons pour localiser près de l’origine, sous-dilué modèle ADN , ou insuffisance du nombre de cycles de réaction. Préparer NTCs frais si l'on soupçonne une contamination.
Une tache rouge bleu/alizarine Alcian réussie sera avez Taché vibrante éléments osseux et cartilagineux (Figure 4 a) qui ne sont pas transparents ou faibles (Figure 4 b). Les limites des éléments du cartilage devraient apparaître croquantes et chondrocytes individuels sera perceptibles. La tache d’OS alizarine rouge est généralement le plus capricieux des deux taches. L’os de l’opercule en forme d’éventail (op) et le bâton en forme de rayons branchiostèges (br) sont de bons indicateurs de la tache réussie 6 jours post fécondation (dpf) osseuse (Figure 4 a, op, br). L’étape de blanchiment devrait ne pas se faner les taches dans les os et le cartilage tout en désactivant complètement les autres tissus de couleur. Les yeux auront une couleur brune même après le succès de coloration et de compensation. Bleu Alcian qui est trop concentrée n’effacera pas d’autres tissus rendant impossible l’analyse (Figure 4). Bleu Alcian provenant de fournisseurs autres que celle décrite dans le tableau du matériau peut également produire des taches de cartilage pauvres.
Figure 1 . Aperçu schématique de la reproduction sélective pour une pénétrance squelettique en testant la progéniture. Génotype (A) une famille de frère plein d’une lignée mutante pour identifier les porteurs hétérozygotes. (B) traverser pair-Wise identifiés des frères et sœurs hétérozygotes et rester parents isolés jusqu'à ce que la progéniture peut être marqué. (C) placer des larves de phénotype sauvage avec vessie natatoire gonflée dans la pépinière d’accéder à l’âge adulte et Difficulté mutants larves sans vessie natatoire gonflée pour le cartilage et OS coloration. (D) Score chaque couvée de bleu Alcian/alizarine rouge teinté animaux mutants de pénétrance. Choisissez quelles familles vont être élevés vers le haut et vers le bas et élever les types sauvages phénotypiques de chacune des familles à l’âge adulte. (E) maison parentale s’apparie avec compagnons afin qu’ils peuvent être croisés à plusieurs reprises pour générer des grandes familles de plein-sibling. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 . Exemple du décalage de pénétrance Mutant squelettique Progeny test. Élevage sélectif tel que décrit dans ce manuscrit a été appliqué pour le poisson-zèbre mef2cab1086 mutant. Dans cette expérience, nous avons sélectionné pour une pénétrance élevée ou basse d’os ectopique entre l’opercule et le rayon branchiostèges dans lethal mutantes homozygotes. Pénétrance d’os ectopique chez la progéniture mutant a été affectée à la paire parentale qui était couleur de pénétrance tel qu’illustré. Ce chiffre a été modifié de1. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 . Capture d’écran du logiciel utilisé pour le génotypage KASP et Analyses de résultats.
Dans cette réaction de KASP réussie, échantillon serré groupements ont été constitués. Points bleus sont homozygote mutant, points verts sont hétérozygotes, les points rouges sont homozygote sauvage et les carrés noirs sont que les groupements NTCs. ont été désignés par le programme informatique. Les NTCs sont situés près de l’origine de l’intrigue, ce qui signifie peu ou pas contamination de mélange de réaction. Indéterminée des échantillons qui ne sont pas encore attribués un génotype seraient indiquées avec un x. Il n’y a aucun échantillon indéterminé présents lors de cette exécution terminée avec succès. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 . Bon, mauvais et laid Alcian bleu/alizarine rouges préparations squelettiques.
(A) montre un exemple d’une tache fraîche, bien coloré et déboisée cartilagineux et osseux. Notez les éléments distincts de cartilage et l’opercule rouge facilement visualisée (op) et la branchiostèges OS de ray (br). (B) un cartilage faible tache fanée alizarine rouge tache apparaît. Cet exemple sat à 4 ° C pendant de nombreux mois, résultant en cartilage fané ainsi que ray opercule et branchiostèges OS qui sont difficiles à distinguer. (C) une larve trop colorée qui utilise trop bleu Alcian. La barre d’échelle est de 200 μm. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Élevage sélectif dévoile les subtilités de la fonction du gène
Déplacement des phénotypes mutants pour être plus ou moins graves par reproduction sélective est un moyen simple pour acquérir de nouvelles connaissances en fonction des gènes. En comparaison avec des méthodes normalisées de reproduction non sélectionnée, le protocole présenté ici peut donner une compréhension plus complète des phénotypes mutants. Plus précisément, en générant des souches qui sont graves, toute l’étendue des phénotypes mutants peut être révélée, dont certains ont été non observables avec des stocks non sélectionnées. Ainsi, les nouveaux rôles du développement pour le gène étudié peuvent être découvert. À l’inverse, générant des souches douces peut révéler les rôles cruciaux pour le gène d’intérêt. Prenez, par exemple, seulement un seul phénotype persiste chez les mutants douces. Ici, il est probable que le processus de développement qui reste perturbé dans la souche bénigne plus critique nécessite la fonction du gène. Donc, la série complète phénotypique d’une mutation donnée peut être mieux comprise par reproduction sélective.
Éviter la dépression de consanguinité
La descendance d’individus apparentés démontre la réduction de la survie et la fécondité dans de nombreux systèmes animales et végétales, y compris le poisson-zèbre,20. Connu comme la dépression de consanguinité, la plupart des modèles postulent, qui augmente l’homozygotie à locus avec des allèles délétères récessives ou allèles qui sont bénéfiques comme hétérozygotes sous-tendent ce phénomène21. Les études avec les poissons zèbres sauvages révèlent une faible fréquence d’allèles délétères dans les populations naturelles22. De plus, des souches de laboratoire comme AB ont été éclaircies davantage de mutations létales récessives23. Il semble donc qu’élevage attentif pourrait permettre de consanguinité indéfinie des lignes sélectionnées de poisson-zèbre. En effet, un rapport récent a révélé que poisson zèbre peut être maintenue par plein-sibling consanguinité pour les générations au moins 169.
Ce protocole met l’accent sur quelques étapes simples, mais essentielles pour s’assurer que les lignées consanguines zebrafish continuent de produire suffisamment petits pour être utile pour les études sur le développement. L’aspect le plus crucial de cette stratégie de reproduction sélective est le processus de sélection lui-même. Tout d’abord, développer des animaux doit être soigneusement contrôlée afin que les familles ayant des défauts de développement ou d’anomalies, non liés à la mutation d’intérêt, peuvent être rigoureusement sélectionnés contre. Deuxièmement, embrayage taille devrait considérer, comme la reproduction sélective exige des familles nombreuses. En plus de sélectionner les paires qui rapportent gros embrayages, les familles nombreuses peuvent être générés par des croisements répéter de la même paire parentale. Gardant des couples parents dans les réservoirs avec de nombreux autre compagnon poissons, qui sont facilement discerner de la paire d’élevage, tels que la pigmentation ou nageoire mutants, permet au logement à long terme des couples reproducteurs dans grands groupes conspécifiques tandis que ce qui leur permet de toujours être facilement identifiés et récupérés. Cette pratique favorise un environnement social sain où le couple parental est libre de shoal avec autre poisson zèbre24. Encore le chercheur peut facilement récupérer le couple parental afin qu’ils peuvent être croisés à plusieurs reprises, permettant la génération des très grandes familles plein-sibling.
Choisir un phénotype sélectionnable
Ce protocole implique beaucoup de phénotype marquant. Ainsi, une seule limitation est que la sélection doit être appliqué à un phénotype qui est facile à visualiser et à marquer rapidement. Il est aussi important de décider à quels animaux stade est fixées et colorées pour marquer. Pour les phénotypes de l’OS, il est avantageux d’attendre jusqu'à 6 dpf parce que les os ne sont plus mis au point25 et seront plus facilement marqués. Pour cartilage patterning phénotypes mutants, dpf 4 convient souvent à phénotype marquant26,27. Dans ma décision de fixer les animaux, il est important de considérer si le gène d’intérêt a rôles pléiotropes conduisant à des phénotypes mutants du développement dans d’autres tissus, ce qui peuvent entraîner des défauts secondaires de confusion. Par exemple, avec les mutants squelettiques qui affichent également œdème cardiaque, qu'il est important de fixer à 4 dpf avant défauts secondaires comme un retard général dans chondrogenèse manifeste26.
Pour plus de simplicité, nous avons choisi un binaire système mettant l’accent sur une pénétrance pour notre élevage sélectif de notation. Toutefois, les phénotypes mutants peuvent également avoir une expressivité variable. À l’avenir, des études, il sera intéressant de tester si, comme la pénétrance, expressivité est sensible à un élevage sélectif. Autrement dit, la fréquence des formes spécifiques d’OS ectopique peut être modifiée par le biais de la reproduction sélective ?
Ce protocole décrit la stratégie de reproduction sélective classique de sélection de la progéniture et son application aux études génétiques du développement de poisson-zèbre. Les pratiques d’élevage simples décrites ici sont possibles dans tout laboratoire, même dans les petites installations. Par le biais de la reproduction sélective, une des plus grandes forces du système zebrafish, tractable génétique, peuvent être exploitées pour en savoir plus sur la fonction des gènes mutants nouvellement mis au point, mais aussi des mutants qui ont été propagées depuis des décennies.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Nous tenons à remercier Chuck Kimmel pour orientation, John Dowd pour aide à l’élaboration de cette stratégie de reproduction, Macie Walker pour son travail en perfectionnant la tache squelettique et Charline Walker et Bonnie Ullmann pour obtenir des conseils utiles de poisson-zèbre. Ce travail a été soutenu par DE024190 K99/R00 à JTN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
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