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Developmental Biology

संतति परीक्षण द्वारा स्थानांतरण Zebrafish घातक कंकाल उत्परिवर्ती Penetrance

Published: September 1, 2017 doi: 10.3791/56200
Automatic Translation
1, 1
1Department of Craniofacial Biology, University of Colorado Anschutz Medical Campus

Summary

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य चयनात्मक प्रजनन द्वारा zebrafish में घातक कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes के penetrance को बदलने के लिए है । घातक म्यूटेंट वयस्कता के लिए नहीं उगाया जा सकता है और खुद को पैदा, इसलिए इस प्रोटोकॉल पर नज़र रखने और संतति परीक्षण द्वारा कई पीढ़ियों के माध्यम से penetrance चयन के लिए एक विधि का वर्णन ।

Abstract

Zebrafish उत्परिवर्ती phenotypes अक्सर पूरी तरह से व्याप्ति हैं, केवल कुछ म्यूटेंट में प्रकट । दिलचस्प phenotypes है कि लगातार दिखाई मुश्किल हो सकता है अध्ययन करने के लिए, और परिणाम की स्थापना के लिए नेतृत्व कर सकते हैं । प्रोटोकॉल यहां वर्णित एक सीधी प्रजनन प्रतिमान को बढ़ाने के लिए और घातक zebrafish कंकाल म्यूटेंट में penetrance कमी है । क्योंकि घातक म्यूटेंट चुनिंदा सीधे नस्ल नहीं किया जा सकता है, संतान परीक्षण के क्लासिक चयनात्मक प्रजनन रणनीति कार्यरत है । इस विधि Kompetitive एलील विशिष्ट पीसीआर (KASP) genotyping zebrafish और दाग लार्वा zebrafish उपास्थि और हड्डी के लिए प्रोटोकॉल भी शामिल है । पशुपालन रणनीति लागू यहां वर्णित एक दिलचस्प कंकाल phenotype बहाव अनुप्रयोगों में अधिक प्रतिलिपि परिणाम को सक्षम करने के penetrance बढ़ा सकते हैं । इसके अलावा, इस चयनात्मक प्रजनन रणनीति के माध्यम से उत्परिवर्ती penetrance घटते विकास प्रक्रियाओं है कि सबसे महत्वपूर्ण रूप से रूपांतरित जीन के समारोह की आवश्यकता प्रकट कर सकते हैं । जबकि कंकाल विशेष रूप से यहां माना जाता है, हम प्रस्ताव है कि इस पद्धति सभी zebrafish उत्परिवर्ती लाइनों के लिए उपयोगी हो जाएगा ।

Introduction

zebrafish कंकाल के विकास को समझने के लिए एक शक्तिशाली मॉडल प्रणाली है । उत्परिवर्ती zebrafish उपभेदों के साथ, जीव skeletogenesis के दौरान जीन समारोह को समझने में कर सकते हैं । हालांकि, zebrafish कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes चर penetrance1,2,3,4 जो विकासात्मक और आनुवंशिक विश्लेषण बाधा कर सकते है के साथ मौजूद कर सकते हैं । इस विधि का उद्देश्य तिगुना है । सबसे पहले, पैदा zebrafish उत्परिवर्ती लाइनों जो लगातार गंभीर phenotypes उत्पादन समय-चूक रिकॉर्डिंग5 और ट्रांसप्लांटेशन6की तरह बहाव के विकास के अध्ययन में सक्षम बनाता है । अध्ययनों के इन प्रकार के अध्ययन के प्रयास से अपंग किया जा सकता है phenotypes कि केवल प्रकट असंगत । दूसरा, रिश् zebrafish उपभेदों आनुवंशिक पृष्ठभूमि भिंनता को कम कर सकते हैं, इस प्रकार प्रयोगात्मक संगति और reproducibility को बढ़ावा देने के । उदाहरण के लिए, सभी सीटू में संकरण विश्लेषण पर एक चयनात्मक रूप से नस्लीय तनाव को कम करने और निष्कर्ष को सुदृढ़ कर सकते हैं । तीसरा, गंभीर और हल्के उपभेदों पैदा पूरे phenotypic श्रृंखला है कि एक विशेष उत्परिवर्तन से परिणाम कर सकते है प्रकट होगा ।

पहली नज़र में, घातक म्यूटेंट के चयनात्मक प्रजनन असंभव लगता है । कैसे penetrance के लिए एक नस्ल जब जानवरों है कि चयन के लिए बनाए गए है मर चुके हैं? सौभाग्य से, परिवार के चयन, विशेष रूप से संतति परीक्षण द्वारा चयनात्मक प्रजनन के लिए तरीके, कई वर्षों के लिए पशुधन प्रजनन कार्यक्रमों में प्रभावशीलता का प्रदर्शन किया है7,8। इन प्रोग्रामों को मुख्य रूप से लक्षण है कि केवल एक सेक्स में मौजूद है के लिए चयनात्मक प्रजनन के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं, गायों में दूध उत्पादन या मुर्गियां में अंडा उत्पादन की तरह । इन प्रजातियों के नर सीधे नहीं बनाए जा सकते, लेकिन उनकी संतानें संगीतबद्ध की जाती हैं और एक मान तो माता-पिता को सौंपा जाता है. इस रणनीति से उधार, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल zebrafish की एक जोड़ी से फिक्स्ड और सना हुआ उत्परिवर्ती वंश स्कोरिंग शामिल है कि ब्याज की एक उत्परिवर्ती जीन के लिए heterozygous हैं । homozygous घातक उत्परिवर्ती वंश में एक phenotype के penetrance माता पिता को सौंपा जब निर्णय जो व्यक्तियों लाइन में अगली पीढ़ी का उत्पादन होगा । हम पाते है कि इस विधि zebrafish घातक कंकाल म्यूटेंट1में penetrance स्थानांतरण का एक प्रभावी साधन है ।

अंय अध्ययनों के समान, इस चयनात्मक प्रजनन प्रोटोकॉल क्लच आकार की तरह विचार मानदंड के तहत लेता है, वंश के अस्तित्व, भ्रूण के सामांय विकास, और सेक्स अनुपात9। हालांकि, इन कारकों सभी उत्परिवर्ती penetrance स्थानांतरण के उद्देश्य के साथ एक उत्परिवर्ती पृष्ठभूमि के संदर्भ में विचार कर रहे हैं । इसलिए, इस प्रोटोकॉल एक विधि की पेशकश के विकास उत्परिवर्ती विश्लेषण को मजबूत बनाने के साथ ही पृष्ठभूमि समरूपता बढ़ाने के द्वारा पिछले चयनात्मक प्रजनन मानदंड फैली हुई है ।

इस प्रोटोकॉल व्यापक genotyping की आवश्यकता है, तो यह अग्रिम में एक विश्वसनीय, तेजी से genotyping प्रोटोकॉल विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है । वहां कई genotyping उपलब्ध प्रोटोकॉल10,11है, लेकिन हम KASP genotyping12,13,14 तेजी से मिल रहा है, और अधिक लागत कुशल, और तरीकों से अधिक विश्वसनीय प्रतिबंध के आधार पर प्रवर्धित अनुक्रम के एंजाइम दरार10. इसलिए, हम इस काम में एक KASP प्रोटोकॉल शामिल हैं । इसके अतिरिक्त, हम इस प्रोटोकॉल में कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes पर ध्यान केंद्रित करने और Alcian नीले/Alizarin लाल धुंधला पिछले प्रोटोकॉल15से संशोधित करने के लिए एक प्रक्रिया शामिल हैं ।

विधि यहां वर्णित घातक उत्परिवर्ती penetrance ऊपर या नीचे स्थानांतरण के लिए एक सीधी रणनीति है । हालांकि इस प्रोटोकॉल कंकाल उत्परिवर्ती phenotypes पर केंद्रित है, हमें विश्वास है कि यह सभी उत्परिवर्ती zebrafish लाइनों के पशुपालन के लिए एक उपयोगी रणनीति होगी । वास्तव में, इस प्रजनन रणनीति की उपयोगिता की संभावना zebrafish परे फैली हुई है । हम भविष्यवाणी है कि इस प्रोटोकॉल जीवों की एक विस्तृत रेंज में penetrance शिफ्ट करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । संतति परीक्षण द्वारा घातक penetrance स्थानांतरण किसी भी विकासात्मक आनुवंशिकी की प्रगति को आगे बढ़ाने में मदद कर सकते हैं ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रयोगों को कोलोराडो विश्वविद्यालय और ओरेगन विश्वविद्यालय के संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समितियों (IACUC) के साथ अनुसार और अनुपालन में पूरा किया गया.

< p class = "jove_title" > 1. अचयनित शुरू शेयर की तैयारी

  1. फिन द्वारा ब्याज के उत्परिवर्ती एलील के heterozygous वाहकों की पहचान क्लिप < सुप वर्ग = "xref" > 11 और genotyping पसंद की एक विधि द्वारा पूर्ण भाई जानवरों का एक शेयर, जैसे KASP < सुप class = "xref" > 12 , < सुप class = "xref" > 13 , < सुप class = "xref" > 14 . इस प्रोटोकॉल के साथ प्रदर्शन किया गया था zebrafish mef2ca b1086 तनाव.
  2. KASP genotyping
    नोट: KASP के लिए एलील विशिष्ट प्राइमरों कंपनी द्वारा डिजाइन किए है कि रिएजेंट प्रदान करता है ( सामग्री की तालिका देखें) । विशिष्ट वास्तविक समय पीसीआर मशीन के लिए उपयुक्त 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) डाई एकाग्रता प्राप्त करने के लिए कंपनी की वेबसाइट पर जाएं ।
    1. में zebrafish टेल टिशू को जगह ५० & #181; lysis बफर के एल (10 एमएम tris (पीएच ८.३), ५० एमएम KCl, १.५ एमएम MgCl 2 , ०.३% गैर ईओण surfactant, ०.३% Octylphenyl-पॉलीथीन ग्लाइकोल) । जोड़ें 10 & #181; एल के 10 मिलीग्राम/एमएल Proteinase-कश्मीर के प्रति अच्छी तरह से एक ९६-खैर पीसीआर प्लेट और डाइजेस्ट में एक थर्मल साइकिल चालक ५५ & #176; c के लिए 2-5 h के बाद एक 20 मिनट ९४ & #176; सी निष्क्रियता कदम । पाचन के बाद lysis उत्पाद को प्रशीतित करें । & #160;
      नोट: lysis उत्पादों की तैयारी के बाद कई महीनों के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है । जब ऊतक ५० mM NaOH का उपयोग कर लीजड था, KASP प्रतिक्रियाओं असफल रहे थे । इन निष्कर्षों का सुझाव है कि जीनोमिक डीएनए की तैयारी की NaOH विधि KASP के साथ संगत नहीं है ।
    2. जीनोमिक डीएनए एक spectrophotometer का उपयोग कर बढ़ाता है । जीनोमिक डीएनए आणविक जीवविज्ञान ग्रेड पानी का उपयोग कर टेंपलेट इतना पतला है कि प्रत्येक प्रतिक्रिया लगभग 20-30 एनजी शामिल है ।
      नोट: 4 या 5 नमूनों की मात्रा, उंहें पूल, तो औसत के आधार पर सभी नमूनों के लिए कमजोर पड़ने तैयार । जब वयस्क पूंछ ऊतक, एक 1:100 कमजोर पड़ने के लिए इस प्रोटोकॉल का उपयोग अक्सर पर्याप्त है । डीएनए एकाग्रता की सटीक ठहराव की आवश्यकता नहीं है ।
    3. Add ०.१४ & #181; l की KASP प्राइमरी मिक्स और 5 & #181; l के KASP मास्टर मिश्रण बर्फ पर एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में और संक्षेप में ट्यूब के तल पर सामग्री एकत्र करने के लिए संक्षिप्त करने से पहले अच्छी तरह से मिश्रण.
      नोट: KASP मास्टर मिक्स गर्मी और प्रकाश संवेदनशील है, बर्फ पर शेयर रखने के लिए और प्रत्यक्ष प्रकाश से बचने के ।
    4. प्लास्टिक 5 & #181; प्राइमरी के एल/मास्टर मिक्स समाधान एक ९६-अच्छी तरह से ऑप्टिकल पीसीआर प्लेट के कुओं में वास्तविक समय पीसीआर मशीन के लिए उपयुक्त इस्तेमाल किया जा रहा है ।
    5. प्लास्टिक 5 & #181; l का पतला (लगभग 5-7 एनजी/& #181; l) डीएनए टेम्पलेट नमूनों में एक अच्छी तरह से और महाप्राण मिश्रण करने के लिए एक पिपेट के साथ.
    6. add 5 & #181; nuclease के एल-फ्री पानी 3 कुओं के लिए नहीं-टेम्पलेट नियंत्रण (एनटीसी) के रूप में सेवा करने के लिए और जोड़ें 5 & #181; l के पतला पुष्टि की homozygous जंगली प्रकार, heterozygous और homozygous उत्परिवर्ती डीएनए टेम्पलेट सकारात्मक नियंत्रण के लिए.
    7. यह सुनिश्चित करना है कि फिल्म पूरी तरह से एक अच्छी तरह से बंद है प्लेट पर एक ऑप्टिकली स्पष्ट फिल्म मुहर जगह है ।
    8. संक्षेप में तल पर सामग्री इकट्ठा करने के लिए और मिश्रण से बुलबुले को दूर करने के लिए ६०० x g पर थाली केंद्रापसारक ।
      नोट: बर्फ पर प्लेट रखें और आगे बढ़ने के लिए तैयार जब तक प्रकाश से ढाल ।
    9. मुख्य KASP प्रतिक्रिया प्रदर्शन करने के लिए तालिका 1 में दिखाए गए साइकलिंग प्रोग्राम का उपयोग करें.
    10. विश्लेषण कंप्यूटर द्वारा उत्पादित आने वाले स्कैटर प्लॉट देखें । एक सफल प्रतिक्रिया भूखंड पर अंक के 4 अलग समूहों दिखाएगा (< मजबूत वर्ग = "xfig" > चित्रा 3 ): तीन नमूना जीनोटाइप के लिए इसी समूह, और मूल के पास NTCs के एक समूहीकरण. सकारात्मक नियंत्रण उचित नमूना समूह के साथ अलग करना चाहिए ।
    11. यदि कंप्यूटर प्रोग्राम विशिष्ट पादी के समान प्लॉट समूहीकरण को नहीं पहचानता है, तो अतिरिक्त सायकलिंग सेट की आवश्यकता हो सकती है ( तालिका 2 ) । अतिरिक्त प्रोग्राम को दोहराएँ जब तक कि कंप्यूटर जीनोटाइप.
      12. द्वारा टाइट समूहों को पहचानता है
    12. आसान उपयोग और विश्लेषण के लिए एक स्प्रेडशीट फ़ाइल के लिए genotyping परिणाम निर्यात करें ।
  3. घर की पहचान heterozygous पशुओं को एक साथ मुख्य जल व्यवस्था पर.
< p class = "jove_title" > 2. संतति स्कोरिंग का पहला दौर

  1. Pairwise पार सहोदर heterozygotes ी
    1. के बाद जानवरों फिन क्लिप से उबरने के बाद, Pairwise पार की स्थापना की । भ्रूण को सुनिश्चित करने के लिए डिवाइडर का उपयोग करें सिंक्रोनस < सुप वर्ग = "xref" > १६ .
    2. भ्रूण इकट्ठा और माता पिता के जोड़े प्रजनन पिंजरों में अलग रखना ।
    3. की निगरानी अलग वयस्कों इतना है कि आक्रामक मछली अलग किया जा सकता है या कवर के साथ प्रदान की (कटा हुआ मछली जाल अच्छी तरह से काम) । मछली खिलाया जाना चाहिए और उनके पानी स्थिर पानी में IACUC दिशा निर्देशों के बाद बदल दिया है ।
  2. भ्रूण पाहिजे
    1. चरण और zebrafish भ्रूण को मानक शर्तों के तहत लार्वा बढ़ाएं < सुप वर्ग = "xref" > १७ .
    2. इकट्ठा phenotypically जंगली प्रकार के पशुओं के 5 या 6 दिन पर एक गिलास पिपेट का उपयोग कर जब तैरना मूत्राशय क्लच के ७५% में फुलाया है । नर्सरी रिकॉर्डिंग में phenotypic जंगली प्रकार की जगह है जो माता पिता उंहें उपज ।
      नोट: के साथ उत्परिवर्ती alleles कि अवकाश घातक हैं, जो कई कंकाल म्यूटेंट के सच है, homozygous म्यूटेंट के रूप में विफल करने के लिए तैरने मूत्राशय < सुप वर्ग = "xref" > १८ , < सुप वर्ग = "xref" > १९ . इसलिए, phenotypic जंगली प्रकार आसानी से अपने उत्परिवर्ती भाई बहन फुलाया तैरना मूत्राशय के आधार पर से समझदार हो सकता है ।
  3. Alcian Blue/Alizarin लाल उपास्थि और हड्डी धुंधला
    1. Anesthetize लार्वा कि उनके तैरने मूत्राशय का उपयोग ०.१७ ग्राम/एल Tricaine-एस में भ्रूण मीडिया में नहीं फुलाते । एक विस्तृत बोर ग्लास पाश्चर प्लास्टिक के साथ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों में जानवरों को इकट्ठा । १०० प्रति ट्यूब से अधिक लार्वा जोड़ें.
    2. प्रत्येक ट्यूब से भ्रूण पानी निकालें और ट्यूब प्रति 1x पंजाब में 2% paraformaldehyde के 1 मिलीलीटर में जानवरों को ठीक.
      सावधानी: जलीय पीएफए दहनशील है और गंभीर त्वचा और आंख जलन का कारण होगा । दस्ताने और नेत्र सुरक्षा के रूप में उपयुक्त व्यक्तिगत सुरक्षात्मक उपकरणों पहनें, और उपयोग के बाद अच्छी तरह से हाथ धोने ।
      3. 1 ज के लिए
    3. रॉक; अब निर्धारण बिगड़ा हड्डी धुंधला । इस के दौरान नियमित रूप से ट्यूबों की जांच करें और सभी बाद में कोई लार्वा सुनिश्चित करने के लिए कदम कमाल पक्ष या ट्यूब के तल में झुरमुट में फंस गए हैं ।
    4. एक गिलास पिपेट का उपयोग कर ट्यूब से निर्धारण को हटाने, ५०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और 10 मिनट के लिए रॉक.
    5. 20 & #181; एल के ०.५% Alizarin लाल के प्रति 1 मिलीलीटर Alcian premix (०.०४% Alcian नीले/10 मिमी MgCl 2 /८०% इथेनॉल) जोड़कर ताजा दाग समाधान तैयार करते हैं । निकालें ५०% इथेनॉल, एक ट्यूब को धुंधला समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें, और रात रॉक । लार्वा 5 दिनों तक दाग में रह सकता है ।
    6. ट्यूबों से दाग समाधान निकालें और प्रत्येक ट्यूब के लिए ८०% इथेनॉल/10 मिमी MgCl 2 समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें । रॉक ट्यूबों के लिए कम से 1 ज; रात भर कुल्ला एक स्पष्ट Alcian नीले दाग का उत्पादन कर सकते हैं ।
    7. ८०% इथेनॉल/10 मिमी MgCl 2 ट्यूबों से समाधान निकालें और ५०% इथेनॉल के 1 मिलीलीटर जोड़ें; 5 min.
      8. के लिए रॉक
    8. ट्यूबों से ५०% इथेनॉल समाधान निकालें और 5 min.
      9. के लिए 25% इथेनॉल और रॉक के 1 मिलीलीटर जोड़ें
    9. ट्यूबों से ५०% इथेनॉल समाधान निकालें और जोड़ें 1 मिलीलीटर हौसले से तैयार 3% H 2 O 2 0.5% कोह ब्लीचिंग सॉल्यूशन । टोपियां खुला छोड़ दो और ट्यूबों लगभग 10 मिनट के लिए या एक बेहोश भूरे रंग रंगाई समाधान के ऊपरी हिस्से में देखा जा सकता है जब तक एक माइक्रो ट्यूब रैक में खड़े हो जाओ ।
      नोट: बुलबुले की एक परत समाधान के शीर्ष पर फार्म । सावधान समय इस कदम पर आवश्यक है, के रूप में ब्लीचिंग पर एक गरीब डबल दाग में परिणाम होगा ।
    10. ब्लीचिंग समाधान निकालें और 25% ग्लिसरॉल/0.1% KOH के 1 मिलीलीटर जोड़ें; 10 मिनट के लिए रॉक 1 h.
    11. निकालें 25% ग्लिसरॉल/0.1% ट्यूब से koh समाधान, एक ट्यूब को ५०% ग्लिसरॉल/0.1% koh समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें 10 मिनट के लिए रात भर के लिए रॉक ।
    12. निकालें ५०% ग्लिसरॉल/0.1% ट्यूब से koh समाधान और फिर एक ट्यूब के लिए ५०% ग्लिसरॉल/0.1% koh समाधान जोड़ें । रातोंरात कमाल हवा बुलबुले कि लार्वा के अंदर जमा कर सकते हैं निकालने में मदद मिलेगी । पर दाग कंकाल तैयारियों स्टोर 4 & #176; C जब उपयोग नहीं किया जा रहा है ।
  4. Phenotype स्कोरिंग
    1. चयनित penetrance के Phenotype स्कोर सना हुआ उत्परिवर्ती वंश । In Nichols एट अल. < सुप वर्ग = "xref" > 1 म्यूटेंट अस्थानिक हड्डी की किसी भी घटना के लिए बनाए गए थे ।
      नोट: क्योंकि zebrafish माता पिता स्थैतिक पानी में हैं और Alizarin लाल दाग समय के साथ फीका कर सकते हैं, यह कंकाल की तैयारी को पूरा करने के कुछ दिनों के भीतर स्कोर कंकाल के लिए महत्वपूर्ण है.
    2. Penetrance एक जीनोटाइप का अनुपात है जिसमें एक phenotype है । निम्न सूत्र द्वारा penetrance प्रतिशत की गणना करें:
      % penetrance = (म्यूटेंट with phenotype)/(म्यूटेंट की कुल संख्या) & #215; १००
< p class = "jove_title" > 3. परिवार चयन

  1. अगली पीढ़ी के लिए दो उच्च penetrance और दो कम penetrance परिवारों का चयन करें । penetrance के अलावा, यह fecundity और शक्ति पर विचार करने के लिए जब चुनने जो परिवारों के प्रचार के लिए महत्वपूर्ण है; see चर्चा इस पर अधिक जानकारी के लिए.
  2. प्रत्येक माता पिता की जोड़ी एक उप स्टॉक पहचानकर्ता दे: परिवार .01, .02, आदि
  3. घर माता-पिता जोड़े कई मिश्रित सेक्स & #39 के साथ मुख्य प्रणाली पर; साथी & #39; मछली । साथी मछली ऐसे बदल रंजकता या पंख संरचना के रूप में स्थायी, स्पष्ट भेद सुविधाओं, के साथ किसी भी zebrafish लाइन हो सकता है.
    नोट: कई शोधकर्ताओं ने सफलतापूर्वक एक टैंक में केवल प्रजनन जोड़े रखने के लिए, अनुकूल परिणाम कई साथी मछली के साथ आवास जोड़े द्वारा देखा जाता है. यह वैकल्पिक कदम जानवरों के प्रजनन जोड़े बड़े स्कूलों में रखा जा करने के लिए और आसानी से प्राप्त की अनुमति देता है ताकि वे की जरूरत के रूप में बार पार किया जा सकता है । माता-पिता के जोड़े को पार किया जा सकता है बार बड़े पूर्ण भाई परिवारों उत्पंन; एक ही माता पिता की जोड़ी को पार दोहराने से पहले एक सप्ताह के कम रुको ।
  4. चुनना से लार्वा परिवारों को स्टेप -8. कि अगली पीढ़ी के लिए चयनित नहीं किए गए.
  5. अपने उत्परिवर्ती भाई बहनों से penetrance के साथ चयनित परिवारों से जंगली प्रकार सहोदर लार्वा युक्त टैंक लेबल और सामांय रूप से वयस्कता के लिए बढ़ा ।
  6. अगली पीढ़ी के कम से चार पूर्ण भाई परिवार होगा, ऊपर की रेखा के लिए दो और नीचे की रेखा के लिए दो ।
  7. जब लार्वा यौन परिपक्वता पर पहुंचते हैं, तो नई पीढ़ी के साथ चरण एक में शुरू होने वाले प्रोटोकॉल को दोहराएं ।

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Representative Results

इस प्रोटोकॉल एक दीर्घकालिक पशुपालन तकनीक zebrafish कंकाल म्यूटेंट (चित्रा 1) को समझने के लिए उपयोगी है । संतान परीक्षण द्वारा चयनात्मक प्रजनन समग्र penetrance में एक बदलाव उपज चाहिए दोनों नीचे और ऊपर की ओर कुछ पीढ़ियों में (चित्रा 2) । हमारे पिछले काम में, चयनात्मक प्रजनन के दो दौर 17% से 3%1के लिए नीचे penetrance औसत निकाल दिया । इसी प्रकार, हमारे ऊपर पंक्ति में, हम तीन पीढ़ियों में औसत penetrance ऊपर की ओर ६३% से ९३% स्थानांतरित कर दिया । अगर चयनात्मक प्रजनन के चार दौर के बाद penetrance नीचे या ऊपर की ओर जवाब नहीं है, यह संभव है कि phenotype है कि रन बनाए जा रहे है संतति परीक्षण द्वारा चयनात्मक प्रजनन के प्रति संवेदनशील नहीं है ।

एक सफल KASP प्रक्रिया में, जीनोटाइप करने के लिए इसी नमूने के तंग समूहों कंप्यूटर प्रोग्राम द्वारा मांयता प्राप्त किया जाना चाहिए, और NTCs भूखंड के मूल के पास स्थित होना चाहिए के बाद पर्याप्त चक्र प्रदर्शन किया गया है (चित्रा 3) । यदि KASP स्कैटर प्लॉट डेटा कसकर समूहीकृत नहीं है या एक एनटीसी में संदूषण का पता लगाया है, तो प्रोग्राम पादी निर्धारित करने में असमर्थ हो जाएगा । अधिकांश नमूने जीनोटाइप समूह द्वारा पहचाना गया है, लेकिन अभी भी कुछ अस्पष्ट हैं, तो डेटा सेट से अनिर्धारित नमूनों को छोड़ कर प्रोग्राम genotyping क्लस्टर्स को पहचानने के लिए अनुमति दें सकता है । अनिर्धारित नमूना कॉल और अस्पष्ट जीनोटाइप समूहीकरण निम्न से परिणाम हो सकता है: दूषित प्रतिक्रिया मिश्रण जिसमें NTCs मूल के पास समूह नहीं होगा, अधिक पतला टेम्पलेट डीएनए नमूने के कारण मूल के पास ढूँढने के लिए, के तहत पतला टेम्पलेट डीएनए , या प्रतिक्रिया चक्र की अपर्याप्त संख्या । यदि संदूषण संदिग्ध हो तो ताजा NTCs तैयार करें ।

एक सफल Alcian नीले/Alizarin लाल दाग जीवंत रूप से दाग हड्डी और उपास्थि तत्वों (चित्रा 4a) कि पारदर्शी या बेहोश (चित्रा 4B) नहीं कर रहे हैं होगा । उपास्थि तत्वों की सीमाएं कुरकुरा दिखाई देना चाहिए, और व्यक्तिगत chondrocytes समझदार हो जाएगा । Alizarin लाल हड्डी के दाग आमतौर पर दो दाग के अधिक नकचढ़ा है । प्रशंसक के आकार का opercle (सेशन) हड्डी और छड़ी के आकार का branchiostegal किरणों (br) एक सफल 6 दिनों के बाद निषेचन (dpf) हड्डी दाग (चित्रा 4a, सेशन, br) के अच्छे संकेतक हैं । ब्लीचिंग कदम अस्थि और उपास्थि में दाग फीका नहीं है, जबकि पूरी तरह से रंग के अंय ऊतकों समाशोधन चाहिए । आंखें सफल धुंधला और समाशोधन के बाद भी एक भूरे रंग की छटा होगा । Alcian नीला है कि यह भी अंय विश्लेषण असंभव (चित्र 4c) बनाने के ऊतकों से स्पष्ट नहीं केंद्रित है । सामग्री की मेज में वर्णित एक के अलावा अंय विक्रेताओं से Alcian नीले भी गरीब उपास्थि दाग का उत्पादन कर सकते हैं ।

Figure 1
चित्र 1 . संतान परीक्षण द्वारा कंकाली Penetrance के लिए चयनात्मक प्रजनन का योजनाबद्ध अवलोकन. (क) जीनोटाइप एक उत्परिवर्ती लाइन से एक पूर्ण भाई परिवार के लिए heterozygous वाहकों की पहचान । (ख) जोड़ी वार पार heterozygous भाई बहन की पहचान की है, और रखने के माता पिता को अलग जब तक वंश रन बनाए जा सकते हैं । (ग) जगह phenotypically वंय-प्रकार लार्वा फुलाया तैरना के साथ नर्सरी में मूत्राशय वयस्कता के लिए उठाया जा करने के लिए, और ठीक उत्परिवर्ती लार्वा बिना फुलाया तैरने के लिए मूत्राशय और हड्डी धुंधला हो जाना । (घ) penetrance के लिए Alcian नीले/Alizarin लाल दाग उत्परिवर्ती पशुओं के प्रत्येक क्लच स्कोर । चुनें जो परिवारों के ऊपर और नीचे नस्ल हो जाएगा और प्रत्येक परिवार से वयस्कता के लिए phenotypic जंगली प्रकार बढ़ा । (ङ) साथियों के साथ घर माता-पिता की जोड़ी ताकि वे बड़े पैमाने पर पूर्ण-सहोदर परिवारों को उत्पन्न करने के लिए बार-बार पार कर सकें. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2 . संतति परीक्षण द्वारा कंकाल उत्परिवर्ती Penetrance स्थानांतरण का उदाहरण । चयनात्मक प्रजनन के रूप में इस पांडुलिपि में वर्णित zebrafish mef2cab1086 उत्परिवर्ती के लिए लागू किया गया था । इस प्रयोग में, हम घातक homozygous म्यूटेंट में opercle और branchiostegal रे के बीच अस्थानिक हड्डी के उच्च या कम penetrance के लिए चुना है । उत्परिवर्ती वंश में अस्थानिक हड्डी के Penetrance माता पिता की जोड़ी जो रंग था Penetrance द्वारा कोडित के रूप में दिखाया के लिए सौंपा गया था । यह आंकड़ा1से संशोधित किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3 . KASP Genotyping और परिणाम विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर से स्क्रीन शॉट ।
इस सफल KASP प्रतिक्रिया में, तंग नमूना समूहों का गठन किया गया । ब्लू अंक homozygous उत्परिवर्ती रहे हैं, हरे रंग अंक heterozygous हैं, लाल अंक जंगली प्रकार homozygous हैं, और काले चौकों NTCs हैं । समूहीकरण कंप्यूटर प्रोग्राम द्वारा नामित किए गए थे । NTCs कोई प्रतिक्रिया मिश्रण संदूषण के लिए थोड़ा वाचक साजिश के मूल के पास स्थित हैं । अनिर्धारित नमूने जो अभी तक एक जीनोटाइप असाइन नहीं किया गया है एक x के साथ संकेत दिया जाएगा । इस सफल पूर्ण चलाने में कोई अनिर्धारित नमूने मौजूद नहीं हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4 . अच्छा, बुरा और बदसूरत Alcian नीले/Alizarin लाल कंकाल की तैयारी ।
(क) एक ताजा, अच्छी तरह से दाग और साफ उपास्थि और हड्डी दाग का एक उदाहरण दिखाया गया है । विशिष्ट उपास्थि तत्वों नोट और आसानी से लाल opercle (सेशन) और branchiostegal रे (br) हड्डियों की कल्पना । (ख) क्षीण Alizarin लाल दाग के साथ एक कमजोर उपास्थि दाग दिखाया गया है. यह नमूना कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर बैठ गया के रूप में अच्छी तरह से फीका उपास्थि में जिसके परिणामस्वरूप opercle और branchiostegal रे हड्डियों कि अंतर करने के लिए मुश्किल हैं. (ग) एक से अधिक दाग लार्वा जिसमें बहुत अधिक Alcian नीला इस्तेमाल किया गया था । स्केल बार २०० माइक्रोन है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

चयनात्मक प्रजनन जीन समारोह के बारीकियों का खुलासा किया

उत्परिवर्ती phenotypes स्थानांतरण या तो अधिक या कम चयनात्मक प्रजनन द्वारा गंभीर हो जीन समारोह में नए अंतर्दृष्टि लाभ के लिए एक सीधा रास्ता है । जब अचयनित प्रजनन के मानक तरीकों के साथ तुलना में, यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल उत्परिवर्ती phenotypes की एक बहुत अधिक पूर्ण समझ उपज कर सकते हैं । विशेष रूप से, उपभेदों कि गंभीर है पैदा करके, उत्परिवर्ती phenotypes की पूर्ण चौड़ाई, कुछ है कि अचयनित शेयरों के साथ चौकस थे सहित पता चला जा सकता है । इस प्रकार, अध्ययन के तहत जीन के लिए नई विकासात्मक भूमिकाओं की खोज की जा सकती है । इसके विपरीत, हल्के उपभेदों के उत्पादन के हित के जीन के लिए सबसे महत्वपूर्ण भूमिका प्रकट कर सकते हैं । लो, उदाहरण के लिए, हल्के म्यूटेंट में केवल एक ही phenotype बनी हुई है । यहां यह संभावना है कि विकास प्रक्रिया है कि हल्के तनाव में बाधित रहता है सबसे गंभीर जीन के समारोह की आवश्यकता है । इसलिए, एक दिया उत्परिवर्तन के पूर्ण phenotypic श्रृंखला और अधिक पूरी तरह से चयनात्मक प्रजनन के माध्यम से समझा जा सकता है ।

रिश् ते से बचें डिप्रेशन से

संबंधित व्यक्तियों के वंश कम जीवन रक्षा और कई पशु और संयंत्र प्रणालियों में fecundity, zebrafish सहित20का प्रदर्शन । रिश् ते के रूप में जाना जाता है अवसाद, सबसे मॉडल मंज़ूर है कि या तो अवकाश बचके alleles या alleles कि heterozygotes आबाद इस घटना के रूप में लाभकारी है के साथ loci में वृद्धि हुई homozygosity21। जंगली के साथ अध्ययन-पकड़ा zebrafish प्राकृतिक आबादी22में बचके alleles की एक कम आवृत्ति प्रकट करते हैं । इसके अलावा, अटल बिहारी की तरह प्रयोगशाला उपभेदों आगे अवकाश घातक उत्परिवर्तनों की मंजूरी दे दी थी23। इस प्रकार, ऐसा लगता है कि सावधान पशुपालन चयनित zebrafish लाइनों के अनिश्चितकालीन रिश् ते की अनुमति सकता है । दरअसल, हाल ही की एक रिपोर्ट से पता चला है कि zebrafish ने कम से 16 पीढ़ियों के लिए पूर्ण-सहोदर रिश् तों को बनाए रखा जा सकता है9.

यह प्रोटोकॉल कुछ सरल लेकिन महत्वपूर्ण कदम पर जोर देती है सुनिश्चित करने के लिए कि नस्ल zebrafish लाइनों के लिए पर्याप्त वंश उत्पादन के लिए विकासात्मक अध्ययन के लिए उपयोगी हो जारी है । इस चयनात्मक प्रजनन रणनीति का सबसे महत्वपूर्ण पहलू चयन प्रक्रिया ही है । सबसे पहले, विकासशील पशुओं सावधानी से निगरानी की जानी चाहिए ताकि विकासात्मक दोषों या विषमताओं के साथ परिवारों, ब्याज के उत्परिवर्तन के लिए अनलिंक, इसरो के खिलाफ चयन किया जा सकता है । दूसरे, क्लच आकार पर विचार किया जाना चाहिए, के रूप में चयनात्मक प्रजनन बड़े परिवारों की आवश्यकता है । बड़े चंगुल उपज है कि जोड़े का चयन करने के अलावा, बड़े परिवारों को एक ही पैतृक जोड़ी के पार दोहराने के माध्यम से उत्पंन किया जा सकता है । टैंक में कई अंय साथी मछली, जो आसानी से ऐसी रंजकता या पंख म्यूटेंट के रूप में प्रजनन जोड़ी से समझदार है के साथ माता पिता के जोड़े रखते हुए, बड़े विशिष्ट समूहों में प्रजनन जोड़े के दीर्घकालिक आवास के लिए अनुमति देता है, जबकि उंहें अभी भी आसानी से होने की अनुमति पहचाना और पुनर्प्राप्त की गई । यह अभ्यास एक स्वस्थ सामाजिक वातावरण को बढ़ावा देता है जहां माता पिता की जोड़ी के साथ shoal करने के लिए स्वतंत्र है अंय zebrafish24। अभी तक शोधकर्ता आसानी से माता पिता की जोड़ी को पुनः प्राप्त कर सकते है ताकि वे बार पार हो सकता है, बहुत बड़े पूर्ण भाई परिवारों की पीढ़ी को सक्षम करने से ।

चयन Phenotype

इस प्रोटोकॉल phenotype स्कोरिंग का एक बड़ा सौदा शामिल है । इस प्रकार, एक सीमा है कि चयन के लिए एक phenotype है कि कल्पना और तेजी से स्कोर आसान है पर लागू करने की जरूरत है । यह भी क्या मंच जानवरों तय किया जाएगा और स्कोरिंग के लिए दाग पर फैसला करने के लिए महत्वपूर्ण है । बोन phenotypes के लिए, यह 6 dpf तक इंतजार लाभप्रद है क्योंकि हड्डियों को और अधिक विकसित कर रहे है25 और अधिक आसानी से रन बनाए जाएंगे । उपास्थि patterning उत्परिवर्ती phenotypes के लिए, 4 dpf अक्सर phenotype26,27स्कोरिंग के लिए उपयुक्त है । तय करने में जब पशुओं को ठीक करने के लिए, यह विचार करने के लिए अगर ब्याज की जीन pleiotropic अंय ऊतकों में विकास उत्परिवर्ती phenotypes के लिए अग्रणी भूमिकाओं है, जो माध्यमिक दोषों को प्राप्त करने में परिणाम कर सकते है महत्वपूर्ण है । उदाहरण के लिए, कंकाल म्यूटेंट कि यह भी दिल शोफ प्रदर्शन के साथ chondrogenesis प्रकट26में एक सामांय देरी की तरह माध्यमिक दोषों से पहले 4 dpf पर ठीक करने के लिए महत्वपूर्ण है ।

सादगी के लिए, हमने अपने चुनिंदा प्रजनन के लिए penetrance पर ध्यान केंद्रित करते हुए एक बाइनरी स्कोरिंग सिस्टम चुना । हालांकि, उत्परिवर्ती phenotypes भी चर expressivity हो सकते हैं । भविष्य के अध्ययनों में, यह परीक्षण करने के लिए दिलचस्प होगा अगर, penetrance की तरह, expressivity चयनात्मक प्रजनन के प्रति संवेदनशील है । कि है, विशिष्ट अस्थानिक हड्डी आकार की आवृत्ति चयनात्मक प्रजनन के माध्यम से बदल सकता है?

यह प्रोटोकॉल संतति चयन की क्लासिक चयनात्मक प्रजनन कार्यनीति और उसके आवेदन को zebrafish विकासात्मक आनुवंशिक अध्ययनों का वर्णन करता है. यहाँ वर्णित सीधा पशुपालन व्यवहार किसी भी प्रयोगशाला में संभव है, यहाँ तक कि छोटी-सी सुविधाओं में भी. चयनात्मक प्रजनन के माध्यम से, zebrafish प्रणाली की सबसे बड़ी ताकत में से एक, असभ्य आनुवंशिकी, नव विकसित म्यूटेंट में जीन समारोह के बारे में जानने के साथ ही म्यूटेंट है कि दशकों के लिए प्रचारित किया गया है दोहन किया जा सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम मार्गदर्शन के लिए चक Kimmel शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, इस प्रजनन रणनीति के विकास में मदद के लिए जॉन Dowd, कंकाल दाग ख़तम में उसके काम के लिए Macie वाकर, और सहायक Ullmann सलाह के लिए Charline वाकर और बोनी zebrafish । इस कार्य को K99/R00 DE024190 द्वारा JTN को समर्थन दिया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Paraformaldehyde, pelleted, solid Ted Pella Co. 18501 Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA
Magnesium Chloride, solid Acros Organics 223210010
10x PBS, Aqueous Fisher BP3994
190 proof Ethanol
Alcian Blue, solid Anatech Ltd. 867 Must be from Anatech
Alizarin Red, solid Sigma A5533-25G
Glycerol, liquid Fisher BP229 1
Hydrogen peroxide, liquid Fisher BP263500
Potassium hydroxide,  solid Fisher P250 500
StepOnePlus Real-time PCR Machine Applied Biosystems
MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) Applied Biosystems 4346906
Microseal 'B' seal BioRad MSB1001
KASP Master Mix, High ROX LGC KBS-1016-022 https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk
KASP By Design Primer Mix LGC KBS-2100-100
Tris HCl, solid Fisher BP153 500
potassium chloride, solid Fisher BP366 500
Tween-20, liquid Fisher BP337 100
Nonidet P40 ThermoFisher 28324
Tricaine-S Western Chemicals
Proteinase K Fisher BP1700 100
T100 Thermal Cycler BioRad 1861096
Controlled Drop Pasteur Pipets Fisher 13-678-30
Nanodrop ThermoFisher for DNA quantitation

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References

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विकास जीवविज्ञान अंक १२७ Zebrafish craniofacial कंकाल चयनात्मक प्रजनन संतान परीक्षण परिवार चयन Kompetitive एलील विशिष्ट पीसीआर पशुपालन उपास्थि penetrance जीन उत्परिवर्ती phenotype
संतति परीक्षण द्वारा स्थानांतरण Zebrafish घातक कंकाल उत्परिवर्ती Penetrance
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Brooks, E. P., Nichols, J. T.… More

Brooks, E. P., Nichols, J. T. Shifting Zebrafish Lethal Skeletal Mutant Penetrance by Progeny Testing. J. Vis. Exp. (127), e56200, doi:10.3791/56200 (2017).

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