Summary
このプロトコルの目的は、選択的な育成によってゼブラフィッシュにおける致命的な骨格変異表現型の浸透度を変更することです。致命的な突然変異体が大人に成長することはできません彼ら自身を繁殖、このプロトコルが追跡とテストの子孫によって複数の生成を通して浸透度を選択するための方法を記述するため。
Abstract
ゼブラフィッシュ変異体の表現型は、不完全な浸透、のみいくつかの変異で発症しました。一貫性のない表示興味深い表現型は難しいことができ、結果を交絡につながることができます。ここで説明されているプロトコルは、致命的なゼブラフィッシュ骨格変異の浸透度を上げたり下げたりする簡単な繁殖パラダイムです。致命的な突然変異体は、選択的に直接飼育できません、ために、間接検定の古典的な選択的な繁殖戦略を採用します。このメソッドには、Kompetitive の対立遺伝子特定の PCR (KASP) ジェノタイピング ゼブラフィッシュと染色のゼブラフィッシュ稚魚軟骨と骨のプロトコルも含まれています。ここで説明されている飼育方法を適用することは、下流のアプリケーションでより再現性のある結果を有効にする興味深い骨格表現型の浸透度を増やすことができます。さらに、この選択的な繁殖戦略によって突然変異の浸透度を減少させる最も重要な変異遺伝子の機能を必要とする発達のプロセスを表示できます。骨格、特にここと見なされます、この方法論はすべてゼブラフィッシュ突然変異系統の有用であることを提案します。
Introduction
ゼブラフィッシュは、骨格開発を理解するための強力なモデル システムです。ゼブラフィッシュ変異株の生物学者は骨格中に遺伝子の機能を解読できます。ただし、ゼブラフィッシュ骨格変異表現型を発達・遺伝的解析を妨げることができる変数の浸透度1,2,3、4を提示できます。このメソッドの目的は三重です。コマ撮り録画5と移植6のような下流の発達研究が初めに、一貫して重度の表現型を作り出すゼブラフィッシュ突然変異系統を生成できます。研究のこれらの種類は、一貫性のないマニフェストのみ表現型を研究しようとして不自由することができます。第二に、ゼブラフィッシュ系統を近親交配は遺伝的背景変化、実験的一貫性と再現性を促進を減らすことができます。1 つ選択的に交のハイブリダイゼーション解析できますたとえば、すべてその場で実行する交絡のばらつきを抑えることし、結論を強化します。第三に、重度と軽度の株を生成すると、特定の突然変異に起因することができます全体の表現型シリーズが明らかになります。
最初一見で、致命的な突然変異体の選択的な育成は不可能だと思います。選択範囲を獲得している動物が死んでいるとき、浸透のための 1 つの品種をいかにできるか。幸いなことに、家族の選択、テスト、特に子孫によって選択的な育成法は、畜産87,年多くのためのプログラムの有効性を実証しています。これらのプログラムは、のみ牛の牛乳生産や鶏の卵の生産のような 1 つのセックスに存在する形質の選択的な繁殖のため主に使われます。これらの種の男性は直接得点できないが、彼らの子孫を獲得しているし、両親に値が割り当てられます。この戦略から借りて、ここで提示されたプロトコルには、固定と染色変異子孫ゼブラフィッシュのペアからの興味の突然変異遺伝子のヘテロ接合体の得点が含まれます。個人の行に次の世代が生成されますを決定する際、両親にホモ接合体致死突然変異体の子孫の表現型の浸透度が割り当てられます。私たちはゼブラフィッシュ致死の骨格変異体1での浸透度をシフトの効果的な手段をこの方法には見つけます。
他の研究と同様に、この選択的な繁殖のプロトコルは、クラッチ ・ サイズ、子孫の生存、胚および性比9の正常な開発のような検討規準の下でかかります。ただし、これらの要因は、すべての突然変異の浸透度をシフトの目的と変異の背景のコンテキストで考慮されます。したがって、このプロトコルは、背景の均質性を増加し同様、突然変異体の発達の分析を強化する方法を提供することによって前の選択的な繁殖のパラダイムを拡張します。
このプロトコルは、事前に信頼性の高い、迅速なジェノタイピング プロトコルを開発する上で重要な広範な遺伝子型を必要です。多くジェノタイピング プロトコル10、11、しかし我々 は見つける KASP ジェノタイピング報12,13,14はより速くよりコスト効率的、かつより信頼性の高いメソッド増幅されたシーケンス10の制限の酵素の胸の谷間に基づいています。したがって、この作業で KASP プロトコルを含めます。さらに、このプロトコルで骨格変異体の表現型に着目し、, アルシアン ブルー/アリザリン赤染色前のプロトコル15から変更のプロシージャが含まれます。
ここで説明する方法は、上向きまたは下向きに致死突然変異の浸透度をシフトのため簡単な戦略です。このプロトコルは、骨格の変異体の表現型に焦点を当て、すべてのゼブラフィッシュ変異体ラインの飼育のための有用な戦略であろうと信じています。実際には、可能性がありますこの繁殖戦略の有用性は、ゼブラフィッシュを超えて拡張します。我々 は、有機体の広い範囲に浸透度をシフトするこのプロトコルを変更できることを予測します。子孫テストによって致命的な浸透度をシフト任意の発達の遺伝学の進歩を進めることができます。
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Protocol
やコロラド大学とオレゴン州機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) の大学の遵守にこのプロトコルで記述されているすべての実験が完成します
。1 です選択されていない開始在庫を準備する
- 識別フィンが興味の突然変異体の対立遺伝子のヘテロ接合体キャリア クリップ 11 および遺伝子型解析における兄弟動物の在庫による選択、のよう。KASP 12 , 13 , 14。このプロトコルはゼブラフィッシュ mef2ca b1086 ひずみで実行されていました 。
- KASP ジェノタイピング
注: KASP の対立遺伝子特定のプライマー (材料表 参照) 試薬を提供する会社によって設計されています。取得するには、特定のリアルタイム PCR マシンの適切な 6-カルボキシル基-X-ローダミン (ロックス) 色素の濃度は、会社のウェブサイトをご覧ください。- 場所ゼブラフィッシュ尾組織 50 μ L (10 mM トリス (pH 8.3) 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.3% 非イオン性界面活性剤、0.3% = ポリエチレン ・ グリコール) 換散バッファーの。サーマルサイクラー 20 分 94 ° C 不活化ステップ 2 5 h の 55 ° c に 10 μ L/ウェルの 96 ウェル PCR プレートとダイジェスト プロテイナーゼ K を 10 mg/mL を追加します。消化後溶解製品を冷蔵
注: 換散製品を準備の後数ヶ月間正常に使用できます。組織はだった 50 mM NaOH を使用して溶解し, とき KASP 反応は成功しなかった。ゲノム DNA の準備の NaOH メソッドが KASP で互換性がないことが示唆します 。
- は、分光光度計を使用してゲノム DNA を定量化します。各反応が約 20-30 ng を含むように分子生物学グレードの水を使用してゲノムの DNA のテンプレートを希釈します
。 注: 4 または 5 のサンプルを定量化に、プール、平均値に基づいて、すべてのサンプルの希釈液を準備します。大人の尾組織にこのプロトコルを使用する場合、1: 100 希釈通常十分です。DNA 濃度の正確な定量が必要ではありません 。
ミックス KASP プライマーの - 追加 0.14 μ L と 1.5 mL 容マイクロ チューブとチューブの下部に内容を収集するために簡単に遠心分離前によくミックスに氷のサンプルあたりミックス KASP マスターの 5 μ L.
メモ: KASP のマスターの組合せは熱と光に敏感、氷の在庫を保持して、直接光を避ける 。
- プライマー/マスターのピペット 5 μ L は、使用されているリアルタイム PCR マシンに適した光 96 ウェル PCR プレートのウェルにソリューションをミックスします 。
- ピペット 5 μ L の希釈 (約 5-7 ng/μ L) 各 DNA テンプレートのサンプルも、ミックスにピペットで吸い出しなさい 。
- 3 井戸なしテンプレート コントロール (NTC) として機能し、肯定的なコントロールのヘテロ接合体、ホモ接合体の変異 DNA テンプレート希薄確認ホモ野生型の 5 μ L を追加するヌクレアーゼ フリー水の追加 5 μ L.
- フィルムは、各ウェルに密閉を確保するプレートを光学的に透明フィルム シールを配置します 。
- 簡単に 600 x g 下部にコンテンツを収集し、ミックスから泡を削除にプレートを遠心します
。 : 注意氷のシールド板の光から続行する準備が整うまで 。
- メイン KASP 反応を実行する 表 1 に示されているサイクリング プログラムを使用します 。
- は、解析コンピューターによって生成される結果の散布を表示します。( 図 3) のプロット ポイント 4 のグループが表示されます成功した反応: 遺伝子型、および原点の近く NTCs の 1 つのグループに対応するグループ化のサンプル 3 つ。ポジティブ コントロールを適切なサンプル グループを分離する必要があります 。
- コンピューター プログラムが特定遺伝子型、追加セットをサイクリングに該当するグループは、プロットを認識しない場合は、(表 2) を必要です。コンピューターが遺伝子型によってタイトなグループを認識するまで追加のプログラムを繰り返します 。
- ジェノタイピングの結果をスプレッドシート ファイルより簡単に使用および分析のためにエクスポートします 。
- 場所ゼブラフィッシュ尾組織 50 μ L (10 mM トリス (pH 8.3) 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.3% 非イオン性界面活性剤、0.3% = ポリエチレン ・ グリコール) 換散バッファーの。サーマルサイクラー 20 分 94 ° C 不活化ステップ 2 5 h の 55 ° c に 10 μ L/ウェルの 96 ウェル PCR プレートとダイジェスト プロテイナーゼ K を 10 mg/mL を追加します。消化後溶解製品を冷蔵
- メインの水システムに識別されたヘテロ接合体動物の家します
2. の最初円形の子孫得点
ペア intercrosses- 動物が鰭クリップから回復後を ペアワイズ交差兄弟のヘテロ接合体 の設定。胚が同期 16 ように仕切りを使用します 。
- 胚を収集し、繁殖ケージで分離された親のペアを保持します 。
- 孤立した大人を監視は、ので、積極的な魚を分離またはカバーを提供できます (細切り魚は、仕事をうまくネット)。魚を供給する必要があり、水の交換が静的な水の中 IACUC ガイドラインに従う 。
- 胚の飼育
- ステージ、標準条件 17 の下で幼虫にゼブラフィッシュ胚を上げる 。
- は、クラッチの 75% に膨らんだ膀胱を泳ぐとき、5 または 6 の日にガラス ピペットを使用して野生型表現型動物を収集します。保育園で親のそれらが得られた記録表現型の野生タイプを配置します
。 注: は劣性致死的な多くの骨格変異の本当である突然変異体の対立遺伝子のホモ接合体変異体フォームうきぶくろ 18 , 19 に失敗します。したがって、表現型の野生型が簡単に水増しうきぶくろに基づく変異兄弟から識別できます 。
- アルシアン ブルー/アリザリン赤軟骨と骨染色
- 0.17 g/L Tricaine を使用した浮袋を膨らませるいない幼虫の麻酔-胚メディアで S。ワイドボア ガラス パスツール ピペットで 1.5 mL 遠心チューブに動物を収集します。チューブあたり 100 以上の幼虫を追加します 。
- は各チューブから胚水分を取り除き 1 ml あたりチューブ 1 × PBS で 2% パラホルムアルデヒドの動物を修正します
。 注意:水性 PFA は可燃性と深刻な皮膚や眼の炎症を引き起こします。手袋、眼の保護など適切な保護具を着用し、使用後はよく手を洗うです 。
- ロック 1 時間; 長い固定骨染色を損ないます。この中に定期的にチューブをチェックと幼虫がないようにすべての後続の揺動手順を側面に貼り付けになるかチューブの底に群生します 。
- ガラス ピペットを使用してチューブから定着剤を削除したり、50% エタノールと 10 分のための石の 1 つの mL を追加
- 染色液 0.5% の 20 μ L を追加することによって新鮮な準備アルシアンの 1 mL あたりアリザリン赤プレミックス (0.04% アルシアン ブルー/10 mM MgCl 2/80% エタノール)。50% エタノールを削除したり、各チューブ、およびロックにソリューションを一晩染色の 1 mL を追加します。幼虫は、5 日前まで汚れに残ることが 。
- は、チューブから汚れのソリューションを削除し、各チューブに 80% エタノール/10 mM MgCl 2 ソリューションの 1 つの mL を追加します。少なくとも 1 h; のチューブをロックします。明確アルシアン ブルー染色を作り出すことができる一晩をすすぎします 。
- 80% エタノール/10 mM チューブからの MgCl 2 ソリューションを削除し、50% エタノール 1 mL を加える; 5 分の岩
- チューブから 50% エタノール溶液を削除し 25% エタノールや 5 分岩の 1 つの mL を追加
- チューブから 50% エタノール溶液を削除し、作りたての 1 mL 3% H 2 O を追加 2 /0.5% KOH 漂白溶液。チューブ マイクロ チューブ ラック約 10 分、またはソリューション部の上部でかすかな茶色の着色を見ることができるまでに立つせキャップ オープンのままにします
。 注: ソリューションの上に泡を形成層です。貧しい二重染色で結果が漂白タイミングはこの段階で必要以上に注意してください 。
- 漂白ソリューションを削除し、25 %glycerol/0.1% 島の 1 つの mL を追加; 1 h に 10 分間ロック
- チューブから 25% glycerol/0.1% KOH 溶液を削除したり、各チューブは、一晩に 10 分間、ロックする 50% glycerol/0.1% KOH 溶液の 1 mL を追加します 。
- は 50% glycerol/0.1% KOH 溶液をチューブから削除し、再び各管に 50% glycerol/0.1% KOH 溶液を追加します。ロッキング一晩役立つ幼虫内に蓄積することができます空気の泡を削除します。使用されていないときにストアが 4 ° C で骨格の準備をステンド グラスします 。
- 表現型得点
- スコア ステンド選択された表現型の浸透度の突然変異体の子孫。・ ニコルズ ら の 1 突然変異体の異所性骨発生に対してスコア化した
。 注: ゼブラフィッシュの両親は、静的な水、アリザリン赤染色時間と衰退することができますので、それは骨格の準備を完了する数日以内のスケルトンをスコアすることが重要です 。
- 浸透度は、表現型は、遺伝子型の割合です。次の式によってパーセントの浸透度を計算:
% 浸透 = (表現型の突然変異体)/(突然変異体の合計数) × 100
- スコア ステンド選択された表現型の浸透度の突然変異体の子孫。・ ニコルズ ら の 1 突然変異体の異所性骨発生に対してスコア化した
3。家族の選択
- 選択 2 高浸透と次世代のための 2 つの低浸透度家族。浸透度、に加えて伝達; への家族を選ぶときに、多産と活力を考慮することが重要です。これの詳細についての 議論 を参照してください 。
- 各親ペア サブ在庫識別子を与える: 家族、.01.02、等
- 家のいくつかの混合セックスとメイン システムの親ペア ' の仲間 ' 魚。仲間の魚は、色素沈着やフィン構造の変化など、永続的な明らかにの特徴的な機能で任意のゼブラフィッシュの行をすることができます
。 注: 多くの研究者は正常にのみ繁殖の水槽にペアを維持、いくつかの仲間の魚でペアを集合住宅で良好な結果がみられます。このオプションの手順によりより大きい学校に保管する動物のつがいと必要に応じて彼ら何度も交差することができます簡単に取得します。大規模なフル兄弟家族を生成する親のペアを繰り返し交差ことができます。繰り返し同じ親ペアを横断する前に、少なくとも 1 週間待つ 。
- ステップ 2.2.2 から幼虫の家族をカリングしますを次世代用に選択されなかった。 。
- 変異兄弟から浸透度を持った選択された家族から野生型兄弟幼虫を含むタンクのラベルし、として通常成人に発生します 。
- 次世代は、少なくとも 4 つのフル兄弟家族、2 つのラインが上昇と下降線の 2 つを持っている 。
- 幼虫が成熟に達したら、新しい世代のステップ 1 から開始プロトコルを繰り返します 。
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Representative Results
このプロトコルは、長期飼育技術理解できないゼブラフィッシュ骨格変異体 (図 1) に便利です。子孫がテストすることによって選択的な繁殖は、全体的な浸透度下向きと上向き数世代 (図 2) でシフトを得られるはず。筆者らは, 選択的な育成の 2 つのラウンドは 17% から 31平均浸透度下方を行なった。同様に、私たちの上向きのラインで私たちシフト平均浸透上方 63% から 93% に 3 世代で。選択的な育成の 4 つのラウンドの後、浸透度は下向きか上向きを応答しない場合、得点される表現型が子孫のテストで選抜育種に敏感である可能性が。
成功 KASP では、手順、タイトな遺伝子型に対応するサンプルのグループ化は、コンピューター プログラムによって認識されるべきし、NTCs には十分なサイクルがされた後、プロットの原点近くに位置する必要がありますは (図 3) を実行します。KASP 散布プロット データはしっかりとグループ化されません 1 つの NTC で汚染が検出された場合、プログラムは遺伝子型を決定することができません。ほとんどのサンプルは、グループ化、遺伝子型によって認識されますが、まだいくつかはあいまいである、未定のサンプル データ セットから省略する遺伝子型クラスターを認識するプログラムができます。未定サンプル呼び出しとあいまいな遺伝子型のグループが次から生じる: 原点、原点付近を検索する過剰希釈テンプレート DNA サンプルを引き起こす近く NTCs がグループ化できません汚染反応混合物の下で希釈テンプレート DNA、または反応サイクルの数が足りません。汚染が疑われる場合は、新鮮な NTCs を準備します。
成功したアルシアン ブルー/アリザリン赤染色が鮮やかな染色透明ではない骨・軟骨の (図 4 a) 要素またはかすかな (図 4 b)。軟骨要素の境界が鮮明な表示され、コンドロが識別できること。アリザリン赤骨染色は、通常より 2 つの汚れの凝り性です。扇型 opercle (op) 骨と棒形の光線 branchiostegal (br) が成功 6 日ポスト受精 (dpf) 骨染色 (図 4 a, op, br) の良い指標です。漂白の手順は、色の他の組織を完全にクリアしながら骨と軟骨の汚れをフェードしない必要があります。成功した染色し、クリア後も、目が茶色の色調をあります。あまりにも集中しているアルシアン ブルーは分析不可能 (図 4) を行う他の組織からはクリアされません。アルシアン ブルー素材のテーブルで説明している以外のベンダーからも貧しい軟骨汚れを生成できます。
図 1.子孫をテストして骨格の浸透のための選択的な育成の概要。(A) 遺伝子のヘテロ接合体キャリアを識別するために突然変異体のラインからフル兄弟家族。(B)対クロス識別されたヘテロ接合体の兄弟と両親の子孫を獲得することができますまで隔離を保つため。(C)は、保育園では、成人に発生して、軟骨と骨の染色の水増しうきぶくろなし変異体幼虫を修正する水増しうきぶくろと野生型表現型幼虫を配置します。(D)スコア アルシアン ブルーの各クラッチ/アリザリン赤染色浸透度の変異動物。家族を図り上向きと下向きに繁殖する、大人へとそれぞれの家族から表現型野生型を選択します。(E)家親ペアの仲間との全兄弟の大家族を生成する何度も交差することができますように。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2.間接検定で骨格変異の浸透度をシフトの例です。本稿に記載されている選択的な育成mef2cab1086のゼブラフィッシュ変異体に掛けられました。この実験では、私たちは、opercle と、branchiostegal レイ ・致命的なホモ接合体変異体の異所性骨の高または低浸透度を選択しました。突然変異体の子孫の異所性骨の浸透度は、ように浸透度によって色分けされていた親ペアに割り当てられました。この数字は、1から変更されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3.KASP ジェノタイピングおよび結果の分析に使用ソフトウェアからのスクリーン ショット。
この成功の KASP 反応でタイトなサンプル グループは形作られました。ブルー ポイントは、ホモ接合体変異体、緑のポイントがヘテロ、赤いポイント野生型ホモ、黒い正方形 NTCs。 グループは、コンピューター プログラムによって示されました。NTCs は少しは反応混合物の汚染を示すプロットの原点近くにあります。遺伝子型を割り当てられていない不定のサンプルは x で示されます。この成功した完了した実行で現在未定のサンプルはございません。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4.良い、悪い、醜いアルシアン ブルー/アリザリン赤骨格準備。
(A)新鮮な素敵なステンド グラス、クリア軟骨と骨染色の例を示します。明確な軟骨要素、簡単に可視化された赤 opercle (op)、branchiostegal レイ (br) 骨に注意してください。(B)弱い軟骨染色色あせたアリザリン赤染みが表示されます。このサンプルは、何ヶ月も結果色あせた軟骨だけでなく、opercle と branchiostegal の線を区別することは困難であるボーン 4 ° C で座っていた。(C)過剰染色幼虫あまりアルシアン ブルーが使用されました。スケール バーは、200 μ m です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
選択的な育成は遺伝子機能の機微を発表します。
シフトを詳細または選択的な育成によって重症度の低い突然変異の表現型は、遺伝子の働きに新しい洞察力を得るために簡単な方法です。選択されていない繁殖の標準的な方法と比較すると、ここで提示されたプロトコルは突然変異体の表現型のより完全な理解を得ることができます。具体的には、重度の菌株を生成すると、広範な突然変異体の表現型が明らかにされるが選択されていない株を観察可能ないくつかを含みます。したがって、調査の下で遺伝子の新たな発達的役割を発見できます。逆に、軽度の系統を生成すると、興味の遺伝子のための最も重要な役割が明らかにできます。穏やかな突然変異体の表現型は 1 つだけが解決しないなど、取る。ここで最も重要な弱毒株で混乱したまま発達過程が遺伝子の機能を必要とすることそうです。したがって、選択的な育成によって与えられた突然変異の表現型完全シリーズをより完全に理解できます。
近交弱勢を避ける
関連個人の子孫は、ゼブラフィッシュ20を含む多くの動物および植物システムで減らされた生存と産卵数を示しています。近交弱勢として知られ、ほとんどのモデルを仮定 homozygosity 劣性有害な対立遺伝子とのヘテロ接合体の根底にあるこの現象21は、有益な対立遺伝子座を増加しました。野生で捕獲されたゼブラフィッシュを用いた研究では、自然個体群22で有害な対立遺伝子の低周波を明らかにします。また、AB のような実験室の緊張は、劣性致死突然変異23さらにクリアされました。したがって、その慎重な飼育により、選択したゼブラフィッシュ ラインの不明確な近親交配です。確かに、最近の報告書は、ゼブラフィッシュは少なくとも 16 代9フル兄弟近親交配によって管理でき、明らかにしました。
このプロトコルでは、発達研究に有用であること十分な子孫を生成する近交系ゼブラフィッシュ行を続けられるようにするいくつかの単純だが重要な手順を強調しています。この選択的な繁殖戦略の最も重要な側面は、それ自体選択プロセスです。まず、動物を開発する必要がありますを注意深く監視するに対して厳しく連れの家族発達の欠陥や異常、関心の突然変異にリンク解除を選択できるように。第二に、クラッチのサイズは、選択的な繁殖は、大家族を必要として考慮されなければなりません。収量のペアの選択に加えて、大規模なクラッチ、同じ親ペアの繰り返し交差で大家族を生成できます。大規模な同種のグループのペアを繁殖しながら、簡単にするまだことの長期的な住宅では、魚は、色素沈着やフィンの変異体など、繁殖ペアから一目瞭然ですが、他の多くの仲間と親ペア タンクを保つ識別され、取得されます。この実習では、親のペアは他のゼブラフィッシュ24とショールを無料健康的な社会環境を推進しています。まだ研究者簡単に取得できます親ペア何度も交差することができますので、非常に大規模なフル兄弟家族の生成を有効にします。
選択可能な表現型を選択します。
このプロトコルの表現型の得点の多大な。したがって、1 つの制限は、選択範囲を視覚化し、急速に得点しやすい表現型に適用する必要があることです。また、どの段階動物修正され、得点をするために決定することが重要です。骨の表現型のため骨よりは25を開発しより簡単に得点が 6 dpf まで待たなければ有利です。軟骨パターン化する突然変異体の表現型、4 dpf は26,27得点の表現型に適した多くの場合です。動物を修正する時期の決定、興味の遺伝子にある交二次欠陥の結果することができます他の組織における突然変異表現型発達につながる多面の役割を検討することが重要です。たとえば、骨格変異体を表示も心臓浮腫軟骨分化の一般的な遅延のようなセカンダリ欠陥マニフェスト26前に 4 dpf で修正することが重要です。
わかりやすくするためのスコアリング システムの私達の選択的な繁殖のための浸透度に焦点を当てバイナリを選びました。しかし、突然変異体の表現型には、変数表現力があります。将来的に研究、それは興味深いだろうテスト浸透度のような表現力は選択的な育成に敏感であるかどうかは。つまり、特定の異所性骨形状の周波数は、選択的な育成で変更できますか?
このプロトコルでは、子孫の選択とゼブラフィッシュ発育遺伝学的研究への応用の古典的な選択的な繁殖戦略について説明します。小規模施設でも、任意の研究室では、ここで説明した簡単な畜産の実践が可能です。選択的に繁殖、ゼブラフィッシュ システムの最大の強みの 1 つによって扱いやすい遺伝学は、新たに開発した突然変異体として何十年も反映されている突然変異体の遺伝子機能について学ぶため活きます。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
指導のためチャック キンメル、この繁殖戦略の開発に役立つのジョン ・ ダウド、骨格の汚れを完璧に彼女の仕事の Macie ウォーカーとシャーリーン ウォーカーとボニー ウルマン役に立つゼブラフィッシュのアドバイスを感謝したいと思います。この作品は、JTN に K99/R00 DE024190 によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
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