Summary
Zebra balığı içinde öldürücü iskelet mutant fenotipleri alellerle tarafından seçici üreme değiştirmek için bu iletişim kuralını hedefidir. Ölümcül mutantlar yetişkinliğe büyüdü ve kendilerini bred, bu nedenle bu protokolü izleme ve sınama döl tarafından birden fazla nesilden alellerle seçmek için bir yöntem açıklanır.
Abstract
Zebra balığı mutant fenotipleri çoğu kez eksik olarak penetrant, sadece bazı mutantlar tezahür. Tutarsız bir şekilde görünür ilginç fenotipleri çalışmaya zor olabilir ve sonuçları semptomlarıdır için yol açabilir. Burada açıklanan artırmak ve öldürücü Zebra balığı iskelet mutantlar alellerle azaltmak için bir basit üreme paradigma protokolüdür. Ölümcül mutantlar seçerek doğrudan yetiştirilmiş olamaz çünkü döl test klasik seçici üreme stratejisi istihdam edilmektedir. Bu yöntem aynı zamanda Kompetitive alleli belirli PCR (KASP) Genotipleme Zebra balığı ve boyama larva Zebra balığı kıkırdak ve kemik için protokolleri içerir. Burada açıklanan yetiştiriciliği strateji uygulayarak downstream uygulamalarında daha fazla tekrarlanabilir sonuçlar sağlayan ilginç bir iskelet fenotip alellerle artırabilir. Buna ek olarak, bu seçici üreme stratejisi aracılığıyla mutant alellerle azalan en önemlisi mutasyona uğramış gen işlevi gerektiren gelişim süreçlerini ortaya çıkarabilir. İskelet özellikle burada kabul edilir iken, önerdiğimiz bu yöntemi tüm Zebra balığı mutant satırları için faydalı olacaktır.
Introduction
Zebra balığı iskelet gelişimi anlamak için güçlü modeli bir sistemdir. Zebra balığı mutant suşları ile biyologlar gen işlevini skeletogenesis sırasında çözebilir. Ancak, Zebra balığı iskelet mutant fenotipleri gelişimsel ve genetik analizler engel olabilir değişken alellerle1,2,3,4 ile sunabilir. Bu yöntemin amacı üç katlı. İlk olarak, sürekli olarak ciddi fenotipleri üretmek Zebra balığı mutant satırlar gibi hızlandırılmış kayıt5 ve nakli6aşağı akım gelişim çalışmaları sağlar. Bu tür çalışmalar sadece tutarsız bir şekilde tezahür fenotipleri çalışmaya çalışırken tarafından sakat kalabilir. İkinci olarak, Zebra balığı suşları akraba evliliği genetik arka plan varyasyon, böylece deneysel tutarlılık ve tekrarlanabilirlik teşvik düşürebilir. Örneğin, tüm in situ hibridizasyon analizlere bir seçmeli olarak doğuştan zorlanma karıştırıcı değişkenliği azaltmak gerçekleştirip sonuçlara güçlendirmek. Üçüncü olarak, ağır ve hafif suşları üreten belirli bir mutasyon neden olabilir tüm fenotipik serisi ortaya çıkaracaktır.
İlk bakışta, ölümcül mutantlar seçici üreme imkansız görünüyor. Seçim için attı hayvanlar ölü olduğunda nasıl bir cins alellerle için? Neyse ki, Aile seçimi, özellikle test, döl tarafından seçici ıslahı için yöntemleri programları birçok yıl7,8için yetiştiriciliği hayvancılık etkinliğini göstermiştir. Bu programlar çoğunlukla sadece bir seks, ineklerin süt üretimi veya tavuk yumurta üretimi gibi mevcut özellikleri için seçici ıslahı için kullanılır. Bu tür erkekler doğrudan, attı olamaz ama onların döl attı ve bir değer daha sonra ailesine atanır. Bu stratejiden borçlanma, burada sunulan Protokolü faiz bir mutant gen için heterozigoz olan sabit ve lekeli mutant yavruları Zebra balığı bir çift gelen puanlama içerir. Bir fenotip içinde homozigoz öldürücü mutant çoluk çocuk alellerle ailesine hangi bireyler nesil satırında üretecek karar verirken atanır. Biz bu yöntemi alellerle Zebra balığı öldürücü iskelet mutantlar1vites için etkili bir yol bulmak.
Benzer şekilde diğer çalışmalar, bu seçici ıslahı Protokolü dikkate ölçütü debriyaj boyutu, çoluk çocuk yaşama, embriyo ve cinsiyet oranı9normal gelişimi gibi altında alır. Ancak, bu faktörlerin tüm mutant alellerle değişen hedefi mutant bir arka plan bağlamında kabul edilir. Bu nedenle, bu iletişim kuralı önceki seçici ıslahı paradigmalar gelişimsel mutant analizleri güçlendirmek hem de arka plan homojenliği artırmak için bir yöntem sunarak genişletir.
Güvenilir, hızlı Genotipleme Protokolü önceden geliştirmek önemlidir bu yüzden geniş Genotipleme, bu iletişim kuralı gerektirir. Orada birçok Genotipleme protokolleri kullanılabilir10,11, ancak biz KASP Genotipleme12,13,14 bulmak daha hızlı, daha verimli ve daha güvenilir--dan yöntemleri maliyetidir restriksiyon enzimi bölünme güçlendirilmiş dizileri10üzerinde temel. Bu nedenle, bu çalışmada KASP iletişim kuralı içerir. Ayrıca, bu iletişim kuralını iskelet mutant fenotipleri odaklanmak ve Alcian mavi/Alizarin Red önceki iletişim kuralları15değiştirilmiş boyama için bir yordam içerir.
Burada açıklanan yöntemi öldürücü mutant alellerle yukarı veya aşağı doğru kayması için basit bir stratejidir. Bu iletişim kuralı iskelet mutant fenotipleri üzerinde duruluyor olsa da, tüm mutant Zebra balığı satırlarının yetiştiriciliği için yararlı bir strateji olacağına inanıyoruz. Aslında, büyük olasılıkla bu üreme stratejisi yarar Zebra balığı uzanır. Biz bu protokolü alellerle organizmaların geniş bir aralıktaki kaydırmaya değiştirilebilir tahmin. Döl sınayarak öldürücü alellerle değişen ileri herhangi bir gelişimsel genetikçi ilerlemesini itme yardımcı olabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Tüm deneyler bu protokol için açıklanan uygun olarak ve Colorado Üniversitesi ve University of Oregon kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komiteleri (IACUC) ile uyum içinde tamamlanmıştır.
1. Seçili olmayan başlangıç stok hazırlanması
fin tarafından ilgi mutant gen- tespit heterozigoz taşıyıcılarının küçük 11 ve Genotipleme tam kardeş hayvanların bir hisse senedi seçtiğiniz yöntemi tarafından gibi KASP 12 , 13 , 14. Bu iletişim kuralı Zebra balığı mef2ca b1086 gerilme ile gerçekleştirildi.
- KASP Genotipleme
Not: Alleli belirli astar KASP için (bkz. Tablo reçetesi) reaktifler sağlayan şirket tarafından tasarlanmıştır. Uygun 6-karboksil-X-rodamine (ROX) boya konsantrasyon belirli gerçek zamanlı PCR makinesi için elde etmek için şirket Web sitesini ziyaret edin.- Yer Zebra balığı kuyruk doku 50 µL lizis arabelleği (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, % 0.3 iyonik olmayan yüzey aktif, %0,3 Octylphenyl-polietilen glikol). 10 mg/ml İndinavir-K bir 96-şey PCR plaka ve Özet kuyu başına 10 µL termal cycler 55 ° c 2-5 h 20 min 94 ° C inactivation adım gelir için ekleyin. Lizis ürün sindirim. sonra buzdolabında
Not: lizis ürünleri başarıyla hazırlık sonra birkaç ay için kullanılan. Doku 50 mM NaOH kullanarak lysed zaman KASP reaksiyonlar başarısız oldu. Bu bulgular NaOH yöntemi genomik DNA hazırlık KASP ile uyumlu değildir öneririz. - Bir Spektrofotometre kullanarak genomik DNA ölçmek. Böylece yaklaşık 20-30 ng her reaksiyon içerir moleküler biyoloji sınıf su kullanarak genomik DNA şablonu sulandırmak.
Not: 4 veya 5 örnekleri ölçmek, onları havuz, sonra dilutions ortalama olarak dayalı tüm örnekleri için hazırlamak. Bu iletişim kuralı için yetişkin kuyruk doku kullanırken, 1: 100 seyreltme genellikle yeterli olur. DNA toplama kesin miktar gerekli değildir.
Mix - Ekle 0,14 µL KASP astar ve örnek bir 1.5 mL microcentrifuge tüp ve mix kısaca içeriği tüp alt toplamak için centrifuging çok önce içine buzda başına karışımı 5 µL KASP ustanın.
Not: KASP ana mix ısı ve hassas ışık, buz üzerinde hisse senedi tutmak ve doğrudan güneş ışığı önlemek. - Kullanılan gerçek zamanlı PCR makinesi için uygun bir 96-şey optik PCR plaka kuyu içine damlalıklı 5 µL astar/Master mix çözüm.
- , Damlalıklı 5 µL seyreltilmiş (yaklaşık 5-7 ng/µL) DNA şablon örnekleri her şey ve karıştırmak için bir pipet ile Aspire edin.
- Nükleaz ücretsiz su 3 Kuyu no-şablonu denetimler (NTC) hizmet ve tür seyreltilmiş teyit homozigoz vahşi, heterozigoz ve homozigoz mutant DNA template olumlu denetimler için 5 µL eklemek için Ekle 5 µL.
- Bir optik net film mühür plaka film her şey tamamen mühürlü sağlanması üzerine yerleştirin.
- Kısaca bir santrifüj kapasitesi 600 x g içeriği alt toplamak için ve baloncuklar karışımından kaldırmak için plaka.
Not: buz ve kalkan tabağa ışıktan devam etmek için hazır kadar devam. - Ana KASP reaksiyonu gerçekleştirmek için Tablo 1 ' de gösterilen Bisiklete binme programını kullanın.
- Analiz bilgisayar tarafından üretilen elde edilen dağılım çizim görüntüleyin. Başarılı bir tepki Arsa ( şekil 3) puan 4 ayrı gruplandırmalar gösterecektir: üç örnek gruplandırmalar karşılık gelen genotip ve NTCs kaynağını yakınındaki bir gruplandırması. Pozitif denetimler uygun örnek gruplandırma ile ayırmak. Eğer bilgisayar programı does değil tanımak karşılık gelen belirli genotip, kümeleri Bisiklete binme ek olarak gruplandırmalar olabilir arsa
- (Tablo 2) gerekli. Bilgisayar sıkı gruplandırmalar tarafından genotip tanıyana kadar ek program yineleyin.
- Daha kolay kullanım ve analiz için bir elektronik tablo dosyasına Genotipleme sonuçlarını aktarın.
- Yer Zebra balığı kuyruk doku 50 µL lizis arabelleği (10 mM tris (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, % 0.3 iyonik olmayan yüzey aktif, %0,3 Octylphenyl-polietilen glikol). 10 mg/ml İndinavir-K bir 96-şey PCR plaka ve Özet kuyu başına 10 µL termal cycler 55 ° c 2-5 h 20 min 94 ° C inactivation adım gelir için ekleyin. Lizis ürün sindirim. sonra buzdolabında
- Birlikte ana su sistemi üzerinde tanımlanan heterozigoz hayvanlar evi.
2. ilk yuvarlak döl puanlama
- hayvanlar fin klipten kurtardıktan sonra
- ikili kardeş heterozygotes çapraz ikili intercrosses kadar ayarla. Bölücüler embriyolar zaman uyumlu 16 emin olmak için kullanın.
- Embriyo toplamak ve kafesleri ıslahı izole ebeveyn çiftleri devam.
- İzlemek izole yetişkin böylece ayrılmış veya kapak ile sağlanan agresif balık (rendelenmiş balık ağları iş güzel). Balık beslenen ve onların su değişti statik su iken IACUC yönergeleri izleyerek.
- Embriyo yetiştirme
- sahne ve Zebra balığı embriyolar için standart koşullar 17 altında larvaların yükseltmek.
- Phenotypically vahşi türü hayvanlar Yüzme kesesi debriyaj % 75'i şişirilir, günde 5 veya 6 cam pipet kullanırken toplamak. Fenotipik vahşi türleri hangi ebeveynlerinin onları vermiştir kayıt odasında yerleştirin.
Not: birçok iskelet mutantlar doğrudur, çekinik öldürücü, çoğu mutant gen ile form yüzmek sidiktorbası 18 , 19 için homozigoz mutantlar başarısız. Bu nedenle, fenotipik vahşi türleri kolayca şişirilmiş yüzmek bladders dayalı mutant onların kardeşleri dan ayırt edilebilir.
- Alcian mavi/Alizarin Red kıkırdak ve kemik boyama
- 0,17 g/L Tricaine kullanarak kendi yüzme bladders şişirmek değil larva anestezi-S embriyo medya. Hayvanlar bir geniş-geçişli cam Pasteur damlalıklı 1.5 mL microcentrifuge tüpler içine toplamak. Tüp başına en fazla 100 larva ekleyin.
- Her tüpünden embriyo su kaldırmak ve 1 mL 1 x PBS tüp başına % 2 paraformaldehyde hayvan düzeltin.
Uyarı: Sulu PFA yanıcı ve ciddi deri ve göz tahrişine neden olur. Uygun kişisel koruyucu ekipman eldiven ve göz koruması gibi giymek ve yıkama eller iyice kullanımdan sonra. - İçin 1 h rock; uzun fiksasyonu ve kemik boyama bozar. Tüpler bu sırasında düzenli olarak kontrol edin ve hiçbir larvaların sağlamak için tüm sonraki sallanan adımlar tarafına sıkışmış olmak veya tüpün dibine clumped.
- Cam pipet kullanarak tüpler üzerinden sabitleştirici kaldırmak, 1 mL % 50 etanol, ve 10 dakika süreyle rock eklemek
- Hazırlama 20 µL % 0,5 ekleyerek çözüm boyama taze Alizarin Red başına Alcian 1 mL premix (%0,04 Alcian mavi/10 mM MgCl 2 / %80 etanol). % 50 etanol kaldırmak için çözüm her tüp ve rock gecede boyama 1 mL ekleyin. Larvalar 5 gün için leke kalır.
- Leke çözüm tüpler kaldırın ve 1 mL % 80 etanol/10 mm MgCl 2 çözüm her tüp için ekleyin. Tüpler için en az 1 h rock; bir gecede durulama daha net bir Alcian mavi leke üretebilir.
- % 80 etanol/10 mM tüpler MgCl 2 çözümden kaldırmak ve 1 mL % 50 etanol ekleyin; 5 dk. için rock
- Tüpler % 50 etanol çözümden kaldırmak ve % 25 etanol ve rock 5 dakika süreyle 1 mL ekleyin
- % 50 etanol çözüm tüpler kaldırın ve 1 mL taze hazırlanan % 3 H 2 O ekleyin 2 /0.5% KOH beyazlatma çözüm. Kapaklar açık ve tüpler yaklaşık 10 dk ya kadar soluk kahverengi renklendirme çözüm üst kısmında görülebilir bir mikro-tüp rafa stand izin bırakın.
Not: Çözüm üstüne kabarcıklar formunun bir katmanı. Dikkatli zamanlama bu adımda gerekli olarak üzerinde beyazlatma zavallı bir çift leke sonuçlanır. - Beyazlatma çözüm kaldır ve 1 mL % 25 glycerol/0.1% KOH ekleyin; 10 dk 1 h. kaya
- %25 glycerol/0.1% KOH çözeltisi tüpler kaldırmak için her tüp, kaya gece için 10 dakika için 1 mL % 50 glycerol/0.1% KOH çözeltisi ekleyin.
- % 50 glycerol/0.1% KOH çözüm tüpler kaldırın ve tekrar her tüp için %50 glycerol/0.1% KOH çözeltisi ekleyin. Sallanan bir gecede larva içinde birikebilir hava kabarcıkları kaldırmak yardımcı olacaktır. Mağaza lekeli 4 ° C'de iskelet hazırlıkları ne zaman kullanılıyor.
- Fenotip puanlama
- puan için seçili fenotip alellerle mutant çoluk çocuk lekeli. Nichols vd. 1 mutantlar Ektopik kemik herhangi bir olay için attı.
Not: Zebra balığı anne statik suda ve Alizarin Red leke zamanla, iskelet iskelet hazırlama tamamlama bir kaç gün içinde puanı önemlidir çünkü. - Alellerle bir fenotip vardır bir genotip oranıdır. Yüzde alellerle aşağıdaki formülle hesaplama:
% alellerle (fenotip mutantlarla) = / (mutant toplam sayısı) × 100
- puan için seçili fenotip alellerle mutant çoluk çocuk lekeli. Nichols vd. 1 mutantlar Ektopik kemik herhangi bir olay için attı.
3. Aile seçimi
- Seç iki yüksek alellerle ve iki düşük alellerle aile için en yakın üretme. Alellerle ek olarak, verimlilik ve canlılığı yaymak için hangi aileleri seçerken dikkate almanız önemlidir; tartışma bu konuda daha fazla bilgi için bkz:.
- Her ebeveyn çifti bir alt hisse senedi tanımlayıcı vermek: aile.01,.02, vb
- Ev çeşitli karma seks ile ana sistemdeki ebeveyn çiftleri ' eşlik eden ' balık. Arkadaşı balık herhangi bir Zebra balığı satırı değiştirilmiş pigmentasyon veya fin yapısı gibi kalıcı, belirgin ayırt edici özellikler olabilir.
Not: pek çok araştırmacı başarıyla sadece çift olarak bir tank doğurmak devam ederken, olumlu sonuçlar ile birlikte birkaç arkadaşı balık konut tarafından görülür. Bu isteğe bağlı adım çiftleri daha büyük okullarda tutulması hayvanların üreme sağlar ve onlar tekrar tekrar gerektiği gibi geçti bu yüzden kolayca alındı. Ebeveyn çiftleri art arda büyük tam kardeş aileler oluşturmak için çarpı işareti; en az bir hafta önce aynı ebeveyn çifti geçiş tekrar bekleyin. - Adım 2.2.2 larva ailelerden itlaf. nesil için seçilmiş değil.
- Mutant onların kardeşleri dan alellerle ile seçilen ailelerden gelen vahşi tipi kardeş larva içeren tankları etiket ve yetişkinliğe normal olarak yükseltmek.
- Yeni nesil en az dört tam kardeş aile, iki yukarı doğru satır ve iki aşağı doğru satır için olacak.
- Larva cinsel olgunluğa ulaştığında, yeni nesil bir adımla başlayan Protokolü yineleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu iletişim kuralı bir uzun vadeli hayvancılık anlayış Zebra balığı iskelet mutantlar (şekil 1) yararlı bir tekniktir. Döl test ederek seçici üreme bir kayma genel alellerle hem aşağı hem de yukarı doğru birkaç nesil (Şekil 2) verim. Önceki çalışmalarda, seçici ıslahı iki tur ortalama alellerle aşağı doğru 17'den % %31' e gittim. Benzer şekilde, bizim yukarı doğru çizgi, biz ortalama alellerle yukarı %63 %93 için üç kuşak kaymıştır. Seçici ıslahı dört tur sonra alellerle aşağı veya yukarı doğru yanıt vermiyorsa, atılırsa olur fenotip döl test ederek seçici ıslahı için duyarlı değildir mümkündür.
Başarılı bir KASP, gruplandırmalar örneklerinin genotip için karşılık gelen bilgisayar programı ile tanınması gerektiğini ve yeterli devir edildikten sonra arsa kökeni NTCs yer almalıdır sıkı (şekil 3) müdahalede. KASP dağılım çizim verisini sıkıca gruplandırılmış değil veya bir NTC kirlenme tespit programı genotip belirlemek mümkün olmayacaktır. Çoğu örnekleri gruplandırma genotip tarafından tanınan, ancak hala bazı belirsiz olan veri kümesinden belirsiz örnekleri atlama program Genotipleme kümeleri tanımak için izin verebilir. Belirsiz genotip gruplandırma ve belirsiz örnek aramalar aşağıdaki neden olabilir: kontamine reaksiyon karışımları içinde NTCs değil grup kökeni, kaynağı bulmak için aşırı seyreltilmiş şablon DNA örnekleri neden yakınındaki altında-seyreltilmiş şablon DNA , veya yetersiz sayıda tepki döngüleri. Kirlenme şüphesi varsa taze NTCs hazırlayın.
Başarılı bir Alcian mavi/Alizarin Red leke vibrantly saydam olmayan kemik ve kıkırdak öğeleri (4A rakam) lekeli sahip veya zayıf (şekil 4B). Kıkırdak öğeleri sınırlarını net görünür ve bireysel kondrosit discernable olacak. Alizarin Red kemik leke genellikle daha titiz iki lekeler var. Yelpaze şeklinde opercle (op) kemik ve branchiostegal ışınları (br) şeklinde sopa (şekil 4A, op, br) başarılı 6 gün sonrası döllenme (dpf) kemik leke iyi göstergeleri vardır. Ağartma adım kemik ve kıkırdak lekeleri tam renk diğer dokuların temizlenmesi sırasında yavaş yavaş değil. Gözleri kahverengi bir renk tonu bile başarılı boyama ve Temizleme sonra olacak. Çok yoğun Alcian mavi analiz imkansız (şekil 4 c) yapma diğer dokulardan belli değil. Alcian mavi malzemenin tabloda açıklanan farklı satıcılardan da zavallı kıkırdak lekeler oluşturabilir.
Resim 1 . Döl test ederek iskelet alellerle için seçici ıslahı şematik bakış. (A)genotip heterozigoz taşıyıcıları tanımlamak için bir tam-kardeş aileden mutant bir çizgi. (B) Pair-wise tanımlanan heterozigoz kardeşler çapraz ve ailesi çoluk çocuk attı kadar izole tutmak. (C) phenotypically vahşi türü larvaları ile şişirilmiş yüzmek sidiktorbası yetişkinliğe kaldırdı ve kıkırdak ve kemik boyama için şişirilmiş yüzmek sidiktorbası olmadan mutant larva düzeltmek kreş yerleştirin. (D) her debriyaj Alcian mavi Puan edinildi/mutant hayvanlar için alellerle Alizarin Red lekeli. Hangi aileler yukarı ve aşağı doğru yetiştirilmiş ve her aile fenotipik vahşi türlerinden yetişkinliğe yükseltmek seçin. (E) böylece onlar tekrar tekrar büyük tam kardeş aileler oluşturmak için geçti ebeveyn ev arkadaşları ile çiftleri. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 . İskelet Mutant alellerle döl sınayarak değişen örnek. Seçici üreme bu el yazması açıklandığı gibi Zebra balığı mef2cab1086 mutant için uygulandı. Bu deneyde, biz yüksek veya düşük alellerle Ektopik kemik opercle ve branchiostegal ray öldürücü homozigoz mutantlar arasında için seçildi. Ektopik kemik içinde mutant çoluk çocuk alellerle alellerle tarafından gösterildiği gibi renk kodlu ebeveyn çifti için atandı. Bu rakam1' den güncellenmiştir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 . KASP Genotipleme ve sonuçları analiz için kullanılan yazılım ekran görüntüsü.
Bu başarılı KASP reaksiyon sıkı örnek gruplar kuruldu. Homozigoz mutant mavi noktaları vardır, yeşil Puan heterozigoz, homozigoz vahşi tipi kırmızı noktalardır ve NTCs. gruplandırmalar bilgisayar program tarafından belirlenen siyah karelerdir. NTCs küçük hiçbir tepki karışımı kirlenme belirten arsa kökeni yer alır. Henüz bir genotip atanmamış olan belirsiz örnekleri ile bir x belirtilen. Belirsiz almıyoruz bu başarılı tamamlanan vadede mevcut vardır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 . İyi, kötü ve çirkin Alcian mavi/Alizarin kırmızı iskelet hazırlıklar.
(A) taze, güzel lekeli ve temizlenen kıkırdak ve kemik leke bir örneği gösterilir. Not farklı kıkırdak öğeleri ve kolayca görüntülenmeyecektir kırmızı opercle (op) ve branchiostegal ray (br) kemikleri. (B) zayıf bir kıkırdak ile soluk Alizarin leke gösterilen kırmızı leke. Bu örnek 4 ° C'de soluk kıkırdak yanı sıra opercle ve branchiostegal ray ayırt etmek zor kemikleri kaynaklanan aylar için oturdu. (C) çok fazla Alcian mavi kullanıldığı bir aşırı lekeli larva. Ölçek çubuğu 200 mikron olduğunu. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Seçici ıslahı Gene işlevi inceliklerini örtüsünü açmak
Daha fazla veya daha az seçici ıslahı tarafından şiddetli olmak mutant fenotipleri değişen gen işlevi yeni anlayışlar kazanmak için basit bir yoludur. Seçili olmayan üreme standart yöntemlerle karşılaştırıldığında, burada sunulan Protokolü mutant fenotipleri çok daha tam bir anlayış yol açabilir. Özellikle, ciddi suşları oluşturarak, mutant fenotipleri tam genişliğini, seçili olmayan hisse senetleri ile alınamıyordu bazı dahil olmak üzere ortaya. Böylece, yeni gelişim roller altında eğitim gen tespit edilebilir. Diğer taraftan, hafif suşları üreten gen ilgi için en önemli rolleri ortaya çıkarabilir. Almak, örneğin, sadece tek bir fenotip hafif mutantlar devam ederse. Burada en kritik hafif gerginlik kesintiye kalır gelişim sürecinin gen işlevini gerektirir muhtemeldir. Bu nedenle, belirli bir mutasyon tam fenotipik dizi daha tam olarak seçici ıslahı yoluyla anlaşılabilir.
Akraba evliliği depresyon önleme
İlgili kişiler dölü Zebra balığı20de dahil olmak üzere çok sayıda hayvan ve bitki sistemlerinde, azaltılmış hayatta kalma ve verimlilik göstermektedir. Akraba evliliği depresyon bilinen, en modelleri bu varsaymak arttı, loci resesif zararlı gen ya da heterozygotes altında yatan bu fenomen21gibi yararlı olan gen ile homozygosity. Çalışmalar vahşi yakalanan Zebra balığı ile doğal nüfus22zararlı gen düşük frekansta ortaya koyuyor. Ayrıca, AB gibi laboratuar suşları daha da öldürücü resesif mutasyonlar23/ temizlendi. Böylece, görünüşe göre o dikkatli yetiştiriciliği seçili Zebra balığı satırlarının belirsiz akraba evliliği izin verebilir. Nitekim, son raporunda bu Zebra balığı tam kardeş akraba evliliği için en az 16 nesiller9tarafından korunabilir ortaya koydu.
Bu iletişim kuralı doğuştan Zebra balığı satırları gelişim çalışmaları için yararlı olması için yeterli yavrular üretmek devam emin olmak için birkaç basit ama kritik adımlar vurgular. Bu seçici üreme stratejisi en önemli yönü seçim süreci var. Böylece gelişimsel kusurlar veya anormallikleri, faiz, mutasyon için ayrılmış olan aileler karşı sıkı seçilebilir ilk, hayvanlar geliştirme dikkatle izlenmesi gerekir. Seçici ıslahı geniş aileler gerektirir, ikinci, debriyaj boyutu dikkate alınmalıdır. Verim çiftleri seçeneğinin yanı sıra büyük Debriyajlar, geniş aileler aynı ebeveyn çifti tekrar haçlar oluşturulabilir. Ebeveyn çiftleri tanklarda birçok diğer arkadaşı ile pigmentasyon veya fin mutantlar, gibi üreme çifti üzerinden kolayca ayırt balık tutmak çiftler büyük conspecific gruplar halinde onları hala izin kolayca olsa da hayvancılık uzun vadeli konut için izin verir tespit ve alındı. Bu uygulama ebeveyn çifti ile diğer Zebra balığı24shoal ücretsiz nerede sağlıklı bir sosyal ortam teşvik etmektedir. Onlar tekrar tekrar, geçti böylece henüz araştırmacı kolayca ebeveyn çifti çok büyük tam kardeş aileler oluşturmayı etkinleştirme alabilirsiniz.
Seçilebilir bir fenotip seçme
Bu iletişim kuralı fenotip puanlama büyük bir anlaşma gerektirir. Böylece, bir sınırlama seçimi görselleştirmek ve hızla skor kolay bir fenotip uygulanması gereken bu. Hangi sahne hayvanlar sabit ve puanlama için lekeli karar vermek önemlidir. Kemik fenotipleri için çünkü kemikler daha fazla25 geliştirilen ve daha kolay attı kadar 6 dpf beklemek avantajlıdır. Mutant fenotipleri biçimlenme kıkırdak için 4 dpf kez26,27puanlama fenotip için uygundur. Hayvanlar düzeltmek ne zaman karar vermede, faiz gen pleiotropic rolleri ikincil kusurları semptomlarıdır neden olabilir diğer dokularda gelişim mutant fenotipleri önde gelen olup olmadığını dikkate almak önemlidir. Örneğin, aynı zamanda 4 dpf önce chondrogenesis genel gecikmeden gibi ikincil kusurları düzeltmek önemlidir kalp ödem görüntülemek iskelet mutantlar ile26tezahür.
Kolaylık olması için puanlama sistemi alellerle bizim seçici ıslahı için odaklanan bir ikili seçtik. Ancak, mutant fenotipleri da değişken expressivity sahip olabilirsiniz. Gelecekte çalışmalar, bu test etmek ilginç olacaktır alellerle gibi expressivity seçici ıslahı için duyarlı olup olmadığını,. Diğer bir deyişle, belirli Ektopik kemik şekiller frekans seçici ıslahı yoluyla değiştirilebilir?
Bu iletişim kuralı döl seçimi ve uygulanması Zebra balığı gelişimsel genetik çalışmalar için klasik seçici üreme stratejisi açıklar. Burada açıklanan basit yetiştirme uygulamaları herhangi bir laboratuvarda küçük İmkanları bile mümkündür. Seçici, Zebra balığı sisteminin en önemli güçlerinden biri ıslah yoluyla uysal genetik harnessed olamaz yeni geliştirilen mutantlar hem de yıllardır yayılır mutant gen işlevi hakkında bilgi edinmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Chuck Kimmel rehberlik için John Dowd bu üreme stratejisi geliştirme konusunda yardım için iskelet leke mükemmelleştirmek onun iş Macie Walker ve Charlene Walker ve Bonnie Ullmann yararlı Zebra balığı tavsiye için teşekkür etmek istiyorum. Bu eser K99/R00 DE024190 için JTN tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
