Summary
המטרה של פרוטוקול זה היא לשנות את penetrance של פנוטיפים קטלני השלד מוטציה בדג זברה באמצעות ברירה מלאכותית. מוטציות קטלני זין לבגרות וגדלתי עצמם, לכן פרוטוקול זה מתאר שיטת מעקב ובחירה penetrance לאורך הדורות מרובים על-ידי רומא בדיקות.
Abstract
דג זברה מוטנטים פנוטיפים לעיתים קרובות שהיישום penetrant, מתבטא רק בכמה מוטציות. מעניין פנוטיפים המופיעים באופן בלתי עקבי יכול להיות קשה ללמוד, יכול להוביל משתנה מתערב תוצאות. פרוטוקול המתואר כאן הוא פרדיגמה הרבייה פשוטה כדי להגדיל או להקטין penetrance של מוטציות שלד דג זברה קטלני. כי מוטציות קטלני לא יכול להיות bred סלקטיבי ישירות, האסטרטגיה הקלאסי ברירה מלאכותית של רומא בדיקות הוא מועסק. שיטה זו כוללת גם פרוטוקולים עבור דג זברה genotyping Kompetitive אלל PCR ספציפיים (KASP), צביעת דג זברה זחל סחוס ועצם. יישום האסטרטגיה גידול שמתואר כאן יכול להגביר את penetrance של פנוטיפ השלד מעניין הפעלת עוד תוצאות לשחזור ביישומים במורד הזרם. בנוסף, הפחתת את penetrance מוטציה באמצעות אסטרטגיה זו ברירה מלאכותית יכול לחשוף תהליכים התפתחותיים רוב מכריע דורשות בפונקציה של גן שעבר מוטציה. בעוד השלד במיוחד נחשב כאן, אנו מציעים כי מתודולוגיה זו יהיה שימושי עבור כל השורות דג זברה מוטנטים.
Introduction
דג זברה היא מערכת מודל רב עוצמה להבנת התפתחות השלד. עם דג זברה מוטנטים זנים, ביולוגים יכולה לפענח תפקוד הגן במהלך skeletogenesis. עם זאת, דג זברה מוטנטים פנוטיפים השלד יכול להציג עם משתנה penetrance1,2,3,4 אשר יכול לעכב ניתוחים גנטיים ובעיות התפתחותיות. מטרת שיטה זו הוא פי שלושה. ראשית, יצירת קווי מוטציה דג זברה אשר מייצרים באופן עקבי פנוטיפים חמור מאפשר מחקרים התפתחותיים במורד הזרם כמו הקלטה זמן לשגות5 והשתלת6. אלה מיני מחקרים, יכול להיות נכה-ניסיון ללמוד פנוטיפים רק לידי ביטוי באופן בלתי עקבי. שנית, הניחוש הראשון שלי דג זברה זנים יכול להפחית וריאציה הרקע הגנטי, ובכך לקדם הפארמצבטית והעקביות ניסיוני. לדוגמה, ביצוע כל רגע בחיי עיר הכלאה ניתוחים על זן טבעי סלקטיבי אחד יכול להפחית את השתנות מבלבלים ולחזק את המסקנות. שלישית, יצירת זנים קשות ורכות תחשוף את הסידרה פנוטיפי כולה יכולה לנבוע מוטציה מסוימת.
במבט ראשון, ברירה מלאכותית של מוטציות קטלני נראה בלתי אפשרי. איך זן אחד של penetrance כאשר בעלי החיים הם הבקיע עבור הבחירה מתים? למרבה המזל, שיטות ריבוי סלקטיבי לפי בחירה משפחה, במיוחד רומא בדיקות, הדגימו יעילות תוכניות עבור שנים רבות7,8לגידול בעלי חיים. תוכניות אלה משמשים בעיקר מלאכותית עבור התכונות קיימים רק מין אחד, כמו ייצור החלב בפרות או ייצור הביצים של התרנגולות. הזכרים של המינים הללו לא הבקיע ישירות, אבל הצאצאים שלהם הם הבקיע, לאחר מכן, ערך מוקצית עם ההורים. מגזרים של אסטרטגיה זו, פרוטוקול המובאת כאן כרוכה הבקיע את קבוע, מיטה צאצא מוטציה של זוג דג זברה כי הם משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים עבור הגן המוטנטי עניין. Penetrance של הפנוטיפ של צאצא מוטציה קטלנית homozygous מוקצה ההורים כאשר מחליטים אנשים אשר יהיה לייצר את הדור הבא של הקו. אנו מוצאים כי שיטה זו היא אמצעי יעיל של הסטה penetrance דג זברה מוטנטים השלד קטלני1.
בדומה מחקרים אחרים, פרוטוקול ריבוי סלקטיבי זה לוקח תחת שיקול קריטריונים כמו גודל תטולה, ההישרדות של הצאצאים, התפתחות תקינה של העוברים, יחס9. עם זאת, גורמים אלו כל נחשבים בהקשר של רקע מוטציה עם המטרה של הסטה של penetrance מוטציה. לכן, פרוטוקול זה מרחיב פרדיגמות מלאכותית הקודם על-ידי המציע שיטה כדי לחזק ניתוחים מוטציה התפתחותית, כמו גם להגביר את הרקע הומוגניות.
פרוטוקול זה דורש genotyping נרחב, לכן חשוב לפתח פרוטוקול אמין, מהיר genotyping מראש. ישנם רבים genotyping הפרוטוקולים הזמינים10,11, עם זאת אנו מוצאים את KASP genotyping12,13,14 הוא מהיר יותר, עלות גבוהה יותר יעילה ואמינה יותר מאשר שיטות מבוסס על אנזים הגבלה המחשוף של רצפי מוגבר10. לכן, אנו כוללים את פרוטוקול KASP בעבודה זו. בנוסף, אנו מתמקדים השלד פנוטיפים מוטציה בפרוטוקול זה, לכלול הליך של אדום כחול/Alizarin Alcian מכתים ששונה בין הפרוטוקולים הקודמים15.
השיטה המתוארת כאן היא אסטרטגיה פשוטה עבור העברת penetrance מוטציה קטלנית כלפי מעלה או כלפי מטה. בעוד פרוטוקול זה מתמקד פנוטיפים מוטציה השלד, אנו מאמינים שזה יהיה שימושי אסטרטגיה האחזקה של כל הקווים דג זברה מוטנטים. למעשה, התועלת של אסטרטגיה זו רבייה סביר חורג דג זברה. אנו צופים כי פרוטוקול זה יכול להיות שונה כדי להזיז penetrance במגוון רחב של אורגניזמים. הסטה penetrance קטלני על-ידי בדיקת רומא יכול לעזור לדחוף קדימה את ההתקדמות של כל חוקר גנטיקה התפתחותית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים פרוטוקול זה הושלמה בשנת בהתאם ותאימות עם מאוניברסיטת קולורדו, של אוניברסיטת אורגון מוסדיים טיפול בעלי חיים, שימוש ועדות (IACUC).
1-הכנת המניה מתחילה שלא נבחרו
- זיהוי שירות heterozygous של אלל mutant הריבית על ידי פין קליפ 11 genotyping מלאי של מלא-אחים בעלי חיים על ידי שיטת הבחירה, כגון 13 , 12 , KASP 14. פרוטוקול זה בוצעה עם המתח דג זברה mef2ca b1086.
- KASP genotyping
הערה: צבעי יסוד מסוים אלל KASP תוכננו על ידי החברה המספקת את ריאגנטים (ראה טבלה של חומרים). כדי להשיג 6-carboxyl-X-rhodamine (רוקס) לצבוע הריכוז המתאים עבור המכונה PCR בזמן אמת מסוימת לבקר באתר האינטרנט של החברה. µL- המקום הרקמה זנב דג זברה ב-50 מאגר פירוק (טריס 10 מ מ (pH 8.3), 50 מ מ אשלגן כלורי, MgCl 1.5 מ מ 2, 0.3% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 0.3% Octylphenyl-פוליאתילן גליקול). להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל Proteinase-K לכל טוב של 96-ובכן PCR צלחת וכן תקציר הצנטרפוגה תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 2-5 h ואחריו צעד איון 94 ° C 20 דקות. להכניס למקרר תוצר פירוק לאחר עיכול.
הערה: פירוק מוצרים יכול לשמש בהצלחה במשך מספר חודשים לאחר ההכנה. כאשר רקמות היה lysed באמצעות 50 מ"מ NaOH, התגובות KASP היו לא מוצלח. ממצאים אלה מראים כי שיטת NaOH ההכנה דנ א גנומי אינה תואמת ל- KASP. - לכמת את הדנ א באמצעות ספקטרופוטומטרים. לדלל את תבנית DNA גנומי באמצעות מים כיתה ביולוגיה מולקולרית, כך כל התגובה מכילה כ- 20-30 ננוגרם.
הערה: לכמת דגימות 4 או 5, בריכה אותם ולאחר מכן להכין דילולים עבור כל הדגימות מבוסס על הממוצע. בעת שימוש בפרוטוקול זה על הזנב הבוגרים רקמות, לדילול מטריים לעתים קרובות מספיק. כימות מדויק של ריכוז הדנ א אינה נדרשת.
µL - הוסף 0.14 של פריימר KASP לערבב, 5 µL של המאסטר KASP לערבב עבור דגימה על קרח לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL לערבב היטב לפני בקצרה צריך שתוציאו לאסוף תוכן בתחתית השפופרת.
הערה: מיקס מאסטר KASP חום, אור רגיש, שומרים מלאי בקרח ולהימנע אור ישיר- - Pipet 5 µL של פריימר/מאסטר לערבב פתרון לתוך הבארות של צלחת PCR 96-ובכן אופטי מתאים המכונה PCR בזמן אמת בשימוש.
- Pipet 5 µL של מדולל (כ 5-7 ng/µL) דגימות די אן איי תבנית לתוך כל טוב ואני האחות עם פיפטה לערבב.
- µL 5 להוסיף מים נטולי נוקלאז 3 בארות כדי לשמש כפקדי לא-תבנית (NTC) ולהוסיף 5 µL מסוג מדולל אישר homozygous בר, משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים homozygous מוטציה דנ א בתבנית עבור פקדים חיובי.
- הצב של החותם שטיחות מובהק על הבטחת הצלחת הסרט הוא אטום לחלוטין על כל טוב.
- Centrifuge בקצרה את הצלחת ב g x 600 כדי לאסוף את התוכן בתחתית וכדי להסיר את הבועות מהתערובת.
הערה: למנוע את הצלחת על קרח, מגן אור עד מוכן להמשיך. - להשתמש בתוכנית אופניים שמוצג בטבלה 1 לביצוע התגובה העיקרית KASP.
- להציג את העלילה פיזור וכתוצאה מכך המופק על ידי המחשב ניתוח. תגובת מוצלח יציג 4 קבוצות נפרדות של נקודות על המגרש ( איור 3): שלושה לטעום קיבוצים המתאים גנוטיפ, ולקיבוץ אחד NTCs ליד המקור. הפקדים חיובית צריך לארגן עם הקיבוץ הדגימה המתאימה.
- אם התוכנית המחשב אינו מזהה את העלילה קיבוצים כמו המקביל ספציפיים אחרים, נוסף על אופניים ערכות עשוי להיות נחוץ (טבלה 2). חזור על התוכנית נוספים עד המחשב מזהה קיבוצים חזק על ידי גנוטיפ.
- לייצא את התוצאות genotyping בקובץ הגיליון האלקטרוני קל לשימוש ללא ניתוח.
- המקום הרקמה זנב דג זברה ב-50 מאגר פירוק (טריס 10 מ מ (pH 8.3), 50 מ מ אשלגן כלורי, MgCl 1.5 מ מ 2, 0.3% ללא יונית חומרים פעילי שטח, 0.3% Octylphenyl-פוליאתילן גליקול). להוסיף 10 µL של 10 מ"ג/מ"ל Proteinase-K לכל טוב של 96-ובכן PCR צלחת וכן תקציר הצנטרפוגה תרמי ב 55 מעלות צלזיוס במשך 2-5 h ואחריו צעד איון 94 ° C 20 דקות. להכניס למקרר תוצר פירוק לאחר עיכול.
- בית החיות משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מזוהה יחד על מערכת המים הראשי.
2. הראשונה בסיבוב של רומא הניקוד
- של Pairwise לחצות heterozygotes אח
- אחרי החיות להתאושש הסרטון סנפיר, להגדיר pairwise intercrosses. השתמש חוצצים כדי להבטיח עוברי סינכרונית 16.
- לאסוף את העוברים ולשמור את זוגות הורים מבודד רביה כלובים.
- לפקח מבוגרים מבודד כך אגרסיבי דגים יכול להיות מופרדים או מסופק עם כיסוי (דגים גרוסים רשתות יפה עבודה). הדג צריך להיות מוזן ואת המים שלהם השתנה בעקבות הנחיות IACUC בזמן במים סטטי.
- העובר לגידול
- הבמה ומעלים את העוברים דג זברה רימות תחת תנאים סטנדרטיים 17 עד.
- לאסוף חיות phenotypically פראי-סוג באמצעות פיפטה מזכוכית ביום 5 או 6, כאשר השלפוחית מנופח ב 75% של המצמד. למקם סוגים הפרוע פנוטיפי בחדר הילדים הקלטה של הורים אשר הניב אותם.
הערה: עם אללים mutant כי הם גן # מושגים בסיסיים קטלני, מה שנכון של מוטציות רבות השלד, מוטציות homozygous להיכשל טופס שלפוחיות שחייה 18 , 19. לכן, סוגי הפרוע פנוטיפי בקלות מבחינים מן אחיהם מוטציה בהתבסס על שלפוחיות שחייה המנופח.
- מכתים עצם סחוס אדום כחול/Alizarin Alcian
- עזים ומתנגד בזחלים, אל תנפח את שלפוחיות שחייה באמצעות 0.17 g/L Tricaine-S העובר בתקשורת. לאסוף חיות לתוך צינורות microcentrifuge 1.5 mL עם כוס רחב נשא pipet פסטר. הוספת הזחלים לא יותר מ 100 למחזור.
- להסיר העובר מים מהצינור כל ולתקן חיות ב מ 1 ל 2% paraformaldehyde ב 1 x PBS למחזור.
התראה: כדורגלן מימית דליק, יגרום לגירוי העור והעין רציני. ללבוש ציוד מגן אישי המתאים כגון כפפות הגנה העין, רחץ את ידיך ביסודיות לאחר שימוש. - אבן 1 h; קיבוע יותר פוגע עצם מכתים. לבדוק את הצינורות באופן קבוע במהלך זה, כל והשלבים נדנדה על מנת להבטיח את הזחלים לא להיות תקוע בצד או התגבש בתחתית השפופרת.
- להסיר את מקבע משפופרות באמצעות פיפטה של זכוכית, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול, ו רוק במשך 10 דקות Premix אדום Alizarin לכל 1 מ ל Alcian
- הכן טרי מכתימה את הפתרון על-ידי הוספת 20 µL של 0.5% (0.04% Alcian כחול/10 מ מ MgCl 2 / 80% אתנול). הסר את 50% אתנול, להוסיף 1 מ"ל של צביעת לפתרון כל שפופרת, ו רוק בן לילה. הזחלים יכולה להישאר בתיקייה הכתם עד 5 ימים.
- להסיר הפתרון כתם של הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 80% אתנול/10 מ מ MgCl 2 פתרון כל שפופרת. רוק הצינורות במשך לפחות שעה; שטיפה לילה יכול לייצר כתם כחול Alcian ברור יותר.
- להסיר את 80% אתנול/10 מ מ MgCl פתרון 2 מן הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% אתנול; אבן 5 דק.
- להסיר את הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל של 25% אתנול וביו -רוק עבור 5 דק.
- להסיר הפתרון אתנול 50% מן הצינורות ולהוסיף 1 מ"ל טריה 3% H 2 O 2 <פתרון הלבנת KOH /sub>/0.5%. להשאיר את כמוסות פתוח ולתת הצינורות לעמוד במעמד מיקרו-שפופרת למשך כ- 10 דקות או עד צבע חום חלש ניתן לראות את החלק העליון של הפתרון.
הערה: שכבה של טופס בועות על הפתרון. זהירות העיתוי נדרש בשלב זה, כמו מעל הלבנת וכתוצאה מכך כתם זוגי המסכן. - להסיר הפתרון הלבנה והסרת להוסיף 1 מ"ל של 25% glycerol/0.1% קו; אבן 10 דקות לח' 1
- ולהסיר 25% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות, להוסיף 1 מ"ל של 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת, רוק 10 דקות ללון.
- להסיר 50% glycerol/0.1% קו פתרון של הצינורות ולהוסיף שוב 50% glycerol/0.1% קו פתרון כל שפופרת. נדנדה בין לילה יסייע להסיר בועות אוויר זה יכול להצטבר בתוך הזחלים. חנות צבעונית ההכנות השלד ב 4 ° C כאשר אינו בשימוש.
- פנוטיפ הניקוד
- ציון צבעונית צאצא מוטציה. עבור penetrance של פנוטיפ שנבחר. ב. ניקולס et al. 1 מוטציות זכו עבור כל מופע של עצם חוץ רחמי-
הערה: מאחר דג זברה ההורים במים סטטי הכתם האדום Alizarin יכול לדעוך עם הזמן, זה חשוב להבקיע שלדים בתוך ימים ספורים של השלמת הכנת השלד. - Penetrance הוא היחס גנוטיפ בעל פנוטיפ. לחשב את אחוז penetrance לפי הנוסחה הבאה:
% penetrance = (מוטציות עם פנוטיפ) / (מספר כולל של מוטציות) × 100
- ציון צבעונית צאצא מוטציה. עבור penetrance של פנוטיפ שנבחר. ב. ניקולס et al. 1 מוטציות זכו עבור כל מופע של עצם חוץ רחמי-
3. בחירת המשפחה
penetrance גבוהה- בחר שתי, שתי משפחות penetrance נמוך עבור הדור הבא. בנוסף penetrance, חשוב לשקול פוריות, מרץ כאשר בוחרים אילו משפחות להפיץ; ראה דיון לקבלת פרטים נוספים על זה.
- לתת כל זוג הורים מזהה מלאי sub: המשפחה.01,.02, וכו
- בית זוגות הורים במערכת המרכזית בסקס מעורב מספר ' לוויה ' דגים. לוויה דגים יכולים להיות כל קו דג זברה עם תכונות מזהות קבוע, ברור, כגון מבנה פיגמנטציה או סנפיר שינו.
הערה: בעוד חוקרים רבים לשמור בהצלחה רק זוגות בתוך מיכל רבייה, תוצאות חיוביות נראים על ידי דיור זוגות עם כמה דגים לוויה. שלב אופציונלי זה מאפשר זוגות של חיות יוחזקו בבתי ספר גדולים יותר, לאחזר בקלות אז הם יכולים להיות שוב ושוב חצו כנדרש. זוגות הורים ניתן חצה שוב ושוב כדי ליצור משפחות גדולות מלא-אחים; לחכות לפחות שבוע לפני חוזר חוצה את אותו זוג הורים- - ללקט את המשפחות הזחל מ שלב 2.2.2. אשר לא נבחרו עבור הדור הבא.
- תווית המיכלים המכילים את הזחלים פראי-סוג אחים ממשפחות שנבחרו עם penetrance של אחיהם מוטציה ולגדל לבגרות כרגיל.
- הדור הבא יהיו לפחות ארבע משפחות מלא-אחים, 2 עבור שורת כלפי מעלה ו-2 עבור שורת כלפי מטה-
- כאשר הזחלים מגיעים לבגרות מינית, חזור על פרוטוקול החל השלב הראשון עם הדור החדש.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
פרוטוקול זה היא טכניקה גידול לטווח ארוך שימושי עבור הבנה דג זברה מוטנטים השלד (איור 1). ברירה מלאכותית על ידי רומא בדיקות אמור להניב משמרת ב- penetrance הכללית כלפי מטה והן כלפי מעלה תוך מספר דורות (איור 2). בעבודה הקודמת, שני סיבובים של ברירה מלאכותית הסיע את penetrance הממוצע כלפי מטה מ- 17% ל- 3%1. באופן דומה, בקו שלנו כלפי מעלה, אנחנו העביר את penetrance הממוצע כלפי מעלה מ- 63% 93% תוך שלוש דורות. אם לאחר ארבעה סיבובים של ברירה מלאכותית penetrance אינו מגיב כלפי מטה או כלפי מעלה, זה אפשרי כי פנוטיפ זה הוא להיות הבקיע אינה רגישה מלאכותית על ידי רומא בדיקות.
ב KASP מצליח לבצע הליך, חזק קיבוצים של דגימות המתאים גנוטיפ צריך להיות מוכר על ידי תוכנית מחשב, NTCs צריך להיות ממוקם ליד מקור העלילה לאחר מחזורים מספיק כבר (איור 3). אם הנתונים מגרש פיזור KASP לא מקובצים בחוזקה או זיהום ב- NTC אחד מזוהה, התוכנית תהיה אפשרות לקבוע אחרים. אם רוב דוגמאות מוכרות על ידי גנוטיפ קיבוץ, אבל יש עדיין כמה זה אינם חד משמעיים, תוך השמטת לא נקבע דגימות ערכת הנתונים עשוי לאפשר לתוכנית מזהה genotyping אשכולות. מדגם לא נקבע שיחות וקיבוץ גנוטיפ רב-משמעי העלולות לנבוע הבאות: תערובות התגובה מזוהמים שבו NTCs יקבץ לא ליד המקור, DNA תבנית מדולל יתר גורם דגימות לאיתור ליד המקור, תחת-מדולל תבנית ה-DNA , או מספר מספיק של התגובה מחזורים. להכין NTCs טריים אם יש חשד לזיהום.
כתם אדום כחול/Alizarin Alcian מוצלח חייב זאת לצד צבעונית עצם סחוס אלמנטים (איור 4A) שאינם שקופים או להתעלף (איור 4B). הגבולות של האלמנטים הסחוס אמור להופיע פריך, chondrocytes בודדים תהיה ניכרת. הכתם עצם Alizarin האדום הוא בדרך כלל בררניים יותר הכתמים שני. עצם opercle בצורת מניפה (op) ואת מקל בצורת קרני branchiostegal (br) הם אינדיקטורים טובים של 6 ימים מוצלח פוסט הפריה (dpf) עצם כתם (איור 4A, op, br). הצעד הלבנת צריכים דוהה את הכתמים עצמות, סחוס במהלך ניקוי מלא הרקמות האחרות של צבע. העיניים יהיה גוון חום גם לאחר צביעת ולניקוי מוצלחת. כחול Alcian כי היא מרוכזת מדי לא תנקה של רקמות אחרות ביצוע ניתוח אפשרי (איור 4C). Alcian הכחולה של ספקים מזו המתוארת בטבלה של החומר גם להפיק כתמי הסחוס המסכן.
איור 1 . סקירה סכמטי של ברירה מלאכותית על השלד Penetrance על-ידי בדיקת רומא- (א) גנוטיפ משפחה מלא-אחים משורת מוטציה לזהות שירות heterozygous. (B) Pair-wise קרוס אחים משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים מזוהה, ולשמור על ההורים מבודדים עד can be הבקיע את הצאצאים. (ג) מקום phenotypically פראי-סוג הזחלים עם שלפוחיות שחייה המנופח בחדר הילדים יגודל לבגרות, ולתקן הזחלים מוטנטים ללא שלפוחיות שחייה המנופח הסחוס, העצם מכתים. (ד) ציון כל אחד מצמד של Alcian כחול/אדום Alizarin צבעונית חיות עבור penetrance. בחר אילו משפחות ניתן לגדל כלפי מעלה וכלפי מטה ולגדל את סוגי הפרוע פנוטיפי מכל משפחה לבגרות. (ה) בית הורים זוגות עם חברים, כך הם יכולים להיות חצו שוב ושוב כדי ליצור משפחות מלא-אחים גדול. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 . דוגמה של הסטה השלד Penetrance מוטציה על ידי רומא בדיקות. ברירה מלאכותית כמתואר בכתב יד זה הוחל על המוטציה mef2cab1086 דג זברה. בניסוי זה, בחרנו עבור penetrance גבוהה או נמוכה של העצם חוץ רחמי בין opercle של קרן branchiostegal של מוטציות homozygous קטלני. Penetrance של עצמות חוץ רחמי של צאצא מוטציה היה להקצות את זוג הורים, מי היה בצבעים לפי penetrance כפי שמוצג. איור זה שונה מ-1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 . מסך נורה מתוך תוכנה המשמש KASP Genotyping וניתוחים תוצאות.
בתגובה KASP מוצלח, נוצרו קבוצות המדגם חזק. כחול נקודות הם מוטציה homozygous, נקודות ירוקות הן משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, נקודות אדומות homozygous פראי-סוג, ריבועים שחורים הם ש-ntcs. הקיבוצים נקבעו על-ידי התוכנית במחשב. NTCs ממוקמות ליד מקור העלילה המסמלת מעט זיהום תערובת ללא תגובה. דוגמאות לא נקבע שלא הוקצו עדיין של גנוטיפ להיות מסומן x. ישנם אין דוגמאות לא נקבע נוכח בהפעלה זו הושלמה בהצלחה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 . טוב, רע ומכוער Alcian כחול/Alizarin אדום ההכנות השלד.
(א) מוצגת דוגמה של טרי, ויטראז'ים ואי יפה סחוס ועצם כתם. הערה של אלמנטים ברורים הסחוס ואת בקלות מטמיעים אדום opercle (op) ועצמות ריי (br) branchiostegal. (B) הסחוס חלש כתם אדום Alizarin נמוג הכתם מוצג. דוגמה זו ישבה 4 ° C במשך חודשים רבים וכתוצאה הסחוס דהויה, כמו גם opercle ו- branchiostegal ריי עצמות קשה להבחין. (ג) יתר מוכתם זחל אשר שימשה גם הרבה כחול Alcian. סרגל קנה מידה הוא 200 μm. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ברירה מלאכותית חשפה הדקויות של הפונקציה ג'ין
הסטה פנוטיפים מוטציה כדי להיות יותר או פחות חמור על ידי ברירה מלאכותית היא דרך פשוטה לקבל תובנות חדשות הגן פונקציה. כאשר לעומת בשיטות סטנדרטיות של גידול שלא נבחרו, פרוטוקול המובאת כאן יכולות להניב הבנה יותר מלאה של פנוטיפים מוטציה. באופן ספציפי, על ידי יצירת זנים כי הם קשים, בקונסנזוס פנוטיפים מוטציה מלאה תוכל להיחשף, ובהם כמה שהיו לניכוי עם מניות שלא נבחרו. לפיכך, תפקידים התפתחותיים חדשים עבור הגן שנבחנה ניתן לגלות. לעומת זאת, יצירת זנים מתון יכול לחשוף את התפקידים חיונית ביותר עבור הגן עניין. קחו, לדוגמה, רק הפנוטיפ יחיד נמשכת ב מוטציות מתון. כאן סביר כי התהליך ההתפתחותי הנשאר שיבשו בנימה זו קלה מהזנים דורש את הפונקציה של הגן. לפיכך, הסדרה מלאה פנוטיפי של מוטציה נתון ניתן להבין בצורה יותר מלאה באמצעות ברירה מלאכותית.
הימנעות דיכאון הרבעה
הצאצא של יחידים קשורות להפגין הישרדות מופחתת ופוריות, במערכות רבות מהחי והצומח, כולל דג זברה20. המכונה דיכאון נישואי קרובים, רוב הדגמים לשער זה גדל homozygosity-לוקוסים עם אללים ברישול רצסיבי או אללים כי מועילים כמו heterozygotes ביסוד זו תופעה21. מחקרים עם דג זברה שניצודו חושפים תדר נמוך של אללים ברישול אוכלוסיות טבעי22. יתר על כן, מעבדה זנים כמו AB נוקתה נוספת של מוטציות הקרים קטלני23. לפיכך, נראה שכי גידול זהיר עלולה לאפשר נישואי קרובים לא מוגדר של השורות שנבחרו דג זברה... ואכן, דו ח זה התבצעה חשף שאת דג זברה יכול להישמר על ידי הרבעה מלא-אחים דורות לפחות 169.
פרוטוקול זה מדגיש כמה צעדים פשוטים אך קריטי כדי להבטיח כי דג זברה המפגרים קווים להמשיך לייצר מספיק צאצא כדי להיות שימושי עבור מחקרים התפתחותיים. הדבר הקריטי ביותר של אסטרטגיה זו ברירה מלאכותית הוא תהליך הבחירה עצמה. ראשית, פיתוח חיות חייב יהיה בקפידה פיקוח כך משפחות עם ליקויים התפתחותיים או ליקויים, לא מקושרים כדי המוטציה של עניין, ניתן לבחור לאכיפה נגד. השני, קלאץ גודל להתייחס, כמו ריבוי סלקטיבי דורש משפחות גדולות. בנוסף בחירת זוגות תשואות גדולים מצמדים, משפחות גדולות יכול להיווצר באמצעות החזרה חוצה של אותו זוג הורים. שמירת זוגות הורים טנקים עם רבים אחרים לוויה דגים, אשר הם בקלות וריחו מורגש זוג הרבייה, כגון פיגמנטציה או סנפיר מוטציות, מאפשר דיור לטווח ארוך של זוגות בקבוצות גדולות conspecific רבייה, תוך שהוא מאפשר להם עדיין להיות בקלות לזהות ולאחזר. פרקטיקה זו מקדמת סביבה חברתית בריאה איפה זוג הורים מוזמנים שואל עם אחרים דג זברה24. עדיין החוקר יכול בקלות לאחזר את זוג ההורים כך שהם ניתן חצה שוב ושוב, המאפשרים את הדור של משפחות מלא-אחים גדול מאוד.
בחירת הפנוטיפ לבחירה
פרוטוקול זה כרוכה מידה רבה של פנוטיפ הניקוד. לפיכך, מגבלה אחת היא כי הבחירה צריך להחיל על פנוטיפ כי הוא קל להמחיש וציון במהירות. זה חשוב גם להחליט איזה חיות במה קבועה, צבעונית הבקיע. עבור עצם הפנוטיפים, זהו יתרון להמתין עד 6 dpf מכיוון שהעצם יותר פיתחו25 , בקלות רבה יותר ולקבל תוצאה. עבור סחוס תכנים פנוטיפים מוטציה, מתאים לעתים קרובות 4 dpf פנוטיפ הבקיע26,27. להחליט מתי לתקן את בעלי החיים, חשוב לשקול אם הגן עניין יש תפקידים pleiotropic שמוביל התפתחותית פנוטיפים מוטציה ברקמות אחרות, אשר עלולה לגרום בלבול פגמים משנית. לדוגמה, עם מוטציות השלד המציגים גם בצקת לב שחשוב לתקן-dpf 4 לפני פגמים משניים כמו עיכוב כללי chondrogenesis להתבטא26.
פשטות, בחרנו בינארי התמקדות penetrance עבור שלנו מלאכותית שיטת הניקוד. עם זאת, פנוטיפים מוטציה שתהיה גם אקספרסיביות משתנה. בעתיד מחקרים, זה יהיה מעניין לבחון אם, כמו penetrance, אקספרסיביות הוא רגיש מלאכותית. כלומר, התדירות של צורות ספציפיות עצם חוץ רחמי ניתן לשנות באמצעות ברירה מלאכותית?
פרוטוקול זה מתאר את האסטרטגיה הקלאסי ברירה מלאכותית של רומא הבחירה ויישומו מחקרים גנטיים התפתחותית דג זברה. שיטות גידול ישיר המתוארים כאן אפשריות במעבדה כלשהי, אפילו במתקנים קטנים. דרך סלקטיבי רבייה, אחד היתרונות הגדולים של המערכת דג זברה, ניתן לשלוט גנטיקה צייתן, ללמוד על תפקוד הגן מוטציות פיתח, כמו גם מוטציות אותם להפיץ במשך עשרות שנים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות צ'אק קימל להדרכה, ג'ון דאוד לעזרה בפיתוח אסטרטגיה זו רבייה, ווקר Macie שלה לעבודה בלשפר את הכתם השלד, ואת Charline ווקר בוני אולמן לעצות מועילות דג זברה. עבודה זו נתמכה על ידי K99/R00 DE024190 כדי JTN.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
- Nichols, J. T., et al. Ligament versus bone cell identity in the zebrafish hyoid skeleton is regulated by mef2ca. Development. 143 (23), 4430-4440 (2016).
- Sheehan-Rooney, K., Swartz, M. E., Zhao, F., Liu, D., Eberhart, J. K. Ahsa1 and Hsp90 activity confers more severe craniofacial phenotypes in a zebrafish model of hypoparathyroidism, sensorineural deafness and renal dysplasia (HDR). Dis Model Mech. 6 (5), 1285-1291 (2013).
- Cox, S. G., et al. An essential role of variant histone H3.3 for ectomesenchyme potential of the cranial neural crest. PLoS Genet. 8 (9), e1002938 (2012).
- DeLaurier, A., et al. Role of mef2ca in developmental buffering of the zebrafish larval hyoid dermal skeleton. Dev Biol. 385 (2), 189-199 (2014).
- McGurk, P. D., Ben Lovely, C., Eberhart, J. K. Analyzing Craniofacial Morphogenesis in Zebrafish Using 4D Confocal Microscopy. J Vis Exp. (83), e51190 (2014).
- Kemp, H. A., Carmany-Rampey, A., Moens, C. Generating chimeric zebrafish embryos by transplantation. J Vis Exp. (29), e1394 (2009).
- Lush, J. L. Progeny test and individual performance as indicators of an animal's breeding value. J Dairy Science. 18 (1), 1-19 (1935).
- Lerner, I. M. Population Genetics and Animal Improvement. , Cambridge University Press. (1950).
- Shinya, M., Sakai, N. Generation of Highly Homogeneous Strains of Zebrafish Through Full Sib-Pair Mating. G3. 1 (5), 377-386 (2011).
- Neff, M. M., Neff, J. D., Chory, J., Pepper, A. E. dCAPS, a simple technique for the genetic analysis of single nucleotide polymorphisms: experimental applications in Arabidopsis thaliana genetics. Plant J. 14 (3), 387-392 (1998).
- Xing, L. Y., Quist, T. S., Stevenson, T. J., Dahlem, T. J., Bonkowsky, J. L. Rapid and Efficient Zebrafish Genotyping Using PCR with High-resolution Melt Analysis. Jove-Journal of Visualized Experiments. (84), e51138 (2014).
- He, C., Holme, J., Anthony, J. SNP genotyping: the KASP assay. Methods Mol Biol. 1145, 75-86 (2014).
- Semagn, K., Babu, R., Hearne, S., Olsen, M. Single nucleotide polymorphism genotyping using Kompetitive Allele Specific PCR (KASP): overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding. 33 (1), 1-14 (2014).
- Yuan, J., Wen, Z., Gu, C., Wang, D. Introduction of high throughput and cost effective SNP genotyping platforms in soybean. Plant Genet Genomics Biotech. 2 (1), 90-94 (2014).
- Walker, M. B., Kimmel, C. B. A two-color acid-free cartilage and bone stain for zebrafish larvae. Biotech Histochem. 82 (1), 23-28 (2007).
- Nasiadka, A., Clark, M. D. Zebrafish breeding in the laboratory environment. ILAR J. 53 (2), 161-168 (2012).
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Dev dyn. 203 (3), 253-310 (1995).
- Schilling, T. F., et al. Jaw and branchial arch mutants in zebrafish I: branchial arches. Development. 123, 329-344 (1996).
- McCune, A. R., Carlson, R. L. Twenty ways to lose your bladder: common natural mutants in zebrafish and widespread convergence of swim bladder loss among teleost fishes. Evol Dev. 6 (4), 246-259 (2004).
- Mrakovčič, M., Haley, L. E. Inbreeding depression in the Zebra fish Brachydanio rerio (Hamilton Buchanan). J Fish Biol. 15 (3), 323-327 (1979).
- Charlesworth, D., Willis, J. H. The genetics of inbreeding depression. Nat Rev Genet. 10 (11), 783-796 (2009).
- McCune, A. R., et al. A low genomic number of recessive lethals in natural populations of bluefin killifish and zebrafish. Science. 296 (5577), 2398-2401 (2002).
- Streisinger, G., Walker, C., Dower, N., Knauber, D., Singer, F. Production of clones of homozygous diploid zebra fish (Brachydanio rerio). Nature. 291 (5813), 293-296 (1981).
- Dreosti, E., Lopes, G., Kampff, A. R., Wilson, S. W. Development of social behavior in young zebrafish. Front Neural Circuits. 9, 39 (2015).
- Eames, B. F., et al. FishFace: interactive atlas of zebrafish craniofacial development at cellular resolution. BMC Dev Bio. 13 (1), 23 (2013).
- Nichols, J. T., Pan, L., Moens, C. B., Kimmel, C. B. barx1 represses joints and promotes cartilage in the craniofacial skeleton. Development. 140 (13), 2765-2775 (2013).
- Sasaki, M. M., Nichols, J. T., Kimmel, C. B. edn1 and hand2 Interact in early regulation of pharyngeal arch outgrowth during zebrafish development. PLoS One. 8 (6), e67522 (2013).
