Summary
이 프로토콜의 목표 zebrafish에 치명적인 골격 돌연변이 고기 penetrance 선택적인 breeding에 의해 변경 하는 것입니다. 치명적인 돌연변이 성인 기에 성장 될 수 없는 자신을 사육, 따라서이 프로토콜 추적 하 고 여러 세대에 걸쳐 penetrance 테스트 자손에 의해 선택 하는 방법에 설명 합니다.
Abstract
Zebrafish 돌연변이 고기는 수시로 불완전 하 게 침투 하 고, 일부 돌연변이 명시. 일관성 없이 나타나는 재미 있는 고기 공부 하 고, 어려울 수 있으며 결과 혼동으로 이어질 수 있습니다. 여기에 설명 된 프로토콜은 증가 하 고 감소에 치명적인 zebrafish 골격 돌연변이 penetrance 간단 번 식 패러다임 이다. 치명적인 돌연변이 수 없습니다 선택적으로 사육 될 직접, 때문에 자손 테스트의 고전적인 선택적 번 식 전략 채택 된다. 이 메서드는 또한 Kompetitive 대립 유전자 특정 PCR (KASP) 유전형 zebrafish 및 얼룩 애벌레 zebrafish 연골과 뼈에 대 한 프로토콜을 포함합니다. 여기에 설명 된 농업 전략 적용 다운스트림 응용 프로그램에 더 많은 결과 재현할 수 있도록 재미 있는 골격 표현 형의 penetrance를 증가할 수 있다. 또한,이 선택적 번 식 전략을 통해 돌연변이 penetrance 감소 가장 결정적인 돌연변이 유전자의 기능을 해야 하는 개발 프로세스를 밝힐 수 있다. 골격은 구체적으로 간주 하지만 여기, 우리는이 방법론은 모든 zebrafish 돌연변이 라인에 대 한 도움이 될 것입니다 제안 합니다.
Introduction
Zebrafish는 골격 발달을 이해 하기 위한 강력한 모델 시스템입니다. 돌연변이 제 브라 긴장와 생물학 skeletogenesis 동안 유전자 기능을 해독할 수 있습니다. 그러나, zebrafish 골격 돌연변이 고기 가변 penetrance1,2,,34 개발 및 유전자 분석을 방해할 수 있는 제시할 수 있습니다. 이 방법의 목적은 3 겹 이다. 첫째, 지속적으로 심각한 고기 생산 zebrafish 돌연변이 라인 생성 시간 경과 기록5 와 이식6같은 다운스트림 발달 연구 수 있습니다. 연구의 이러한 종류 고기 일관성 명단만 공부 하 여 무력화 될 수 있습니다. 둘째, zebrafish 긴장 inbreeding 유전 배경 변화, 따라서 실험 일관성과 재현성을 홍보를 줄일 수 있습니다. 예를 들어 모든 현장에서 수행 교 잡 분석 한 선택적으로 타고 난된 긴장에 수 혼란 가변성을 감소 하며 결론을 강화. 셋째, 심각 하 고 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 특정 돌연변이에서 발생할 수 있는 전체 phenotypic 시리즈를 발표할 예정 이다.
언뜻 보기에 치명적인 돌연변이의 선택적인 breeding 불가능 보인다. 선택에 대 한 득점은 동물 들이 죽은 때 어떻게 penetrance에 대 한 하나의 품종을 수 있습니까? 다행히, 가족 선택, 테스트, 특히 자손에 의해 선택적인 breeding 방법 많은 년7,8에 대 한 프로그램을 사육 하는 가축에 효과 증명 하고있다. 이 프로그램 주로 암소에 우유 생산 또는 할 꺼야에 계란 생산 한 섹스에만 되는 특성에 대 한 선택적인 breeding에 사용 됩니다. 이 종족의 남성을 직접 득점 수 없습니다 하지만 그들의 자손은 득점 하 고 값은 부모에 게 할당. 이 전략에서 대출, 여기에 제시 된 프로토콜 고정 및 스테인드 돌연변이 자손 zebrafish의 쌍에서 관심사의 돌연변이 유전자에 대 한 heterozygous는 득점을 포함 한다. 어떤 개인은 라인에 다음 세대를 생산할 예정 이다 결정할 때 homozygous 치명적인 돌연변이 자손의 표현 형의 penetrance 부모에 게 할당 됩니다. 우리는이 방법은 penetrance zebrafish 치명적인 골격 돌연변이1에 이동 하는 효과적인 수단을 찾으십시오.
다른 연구와 마찬가지로,이 선택적인 breeding 프로토콜 클러치 크기, 자손의 생존, 배아, 그리고 섹스 비율9의 정상적인 개발 고려 조건에서 걸립니다. 그러나, 이러한 요인은 돌연변이 penetrance 이동의 목적으로 돌연변이 배경의 맥락에서 모두 간주 됩니다. 따라서,이 프로토콜 배경 동질성을 증가 뿐만 아니라 발달 돌연변이 분석을 강화 하는 방법을 제공 하 여 이전 선택적인 breeding 패러다임을 확장 합니다.
이 프로토콜 사전에 안정적이 고 신속한 유전형 프로토콜을 개발 하는 것이 중요 하다 그래서 광범위 한 유전형을 요구 한다. 그러나 많은 유전형 프로토콜 사용할 수 있는10,11, 우리는 KASP 유전형12,,1314 찾을 빠릅니다, 더 비용 효율적인, 그리고 방법 보다 더 신뢰할 수 있는 증폭된 시퀀스10의 제한 효소 절단을 기반으로 합니다. 따라서, 우리는이 작품에서 KASP 프로토콜을 포함. 또한, 우리는이 프로토콜에 골격 돌연변이 고기에 집중 하 고 Alcian 블루/알리자린 레드 얼룩 이전 프로토콜15수정 절차를 포함.
여기 설명 하는 방법을 상향 또는 하향 치명적인 돌연변이 penetrance 변화는 간단한 전략입니다. 이 프로토콜은 골격 돌연변이 고기에 초점을 맞추고, 하는 동안 우리는 모든 돌연변이 제 브라 라인의 축산에 대 한 유용한 전략 될 것입니다 믿습니다. 사실,이 번 식 전략 가능성의 유틸리티 zebrafish 넘어 확장 됩니다. 우리가 예측 penetrance 생물의 광범위 한 범위에서 이동이 프로토콜을 수정할 수 있습니다. 치명적인 penetrance 자손 테스트 하 여 이동 하는 것은 어떤 발달 유전학의 진도 앞으로 밀어 것을 도울 수 있다.
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Protocol
이 프로토콜에서 설명 하는 모든 실험 따라 그리고 콜로라도의 대학 및 대학 오 레 곤 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 완성 되었습니다.
1. 선택 되지 않은 시작 재고 준비
- 식별 heterozygous 항공사의 지 느 러 미에 의해 돌연변이 체 대립 유전자의 클립 11 및 유전형 전체 형제 동물의 주식 선택의 방법으로와 같은 KASP 12 , , 13 14. 이 프로토콜 zebrafish mef2ca b1086 긴장 수행 되었다.
- KASP 유전형
참고: KASP 위한 대립 유전자 특정 뇌관 (재료의 표 참조) 시 약을 제공 하는 회사에 의해 설계 되었습니다. 특정 실시간 PCR 기계에 대 한 적절 한 6-carboxyl-X-rhodamine (ROX) 염료 농도 회사 웹사이트를 방문. 세포의 용 해 버퍼 (10 mM tris (pH 8.3), 50 m KCl m, 1.5 m m MgCl 2, 0.3% 비 이온 계면 활성 제, 0.3 %Octylphenyl-폴 리 에틸렌 글리콜)의- 장소 zebrafish 꼬리 조직 50에서 µ L. 2-5 h 20 분 94 ° C 비활성화 단계 뒤 55 ° C에서 열 cycler에 96-잘 PCR 플레이트 및 다이제스트의 당 성분을 K 10 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 소화. 세포 제품을 냉장
참고: 세포 제품 준비 후 몇 달 동안 성공적으로 사용 될 수 있습니다. 조직 50 m m NaOH를 사용 하 여 lysed 했다 때 KASP 반응 실패 했다. 이 발견은 건의 한다 genomic DNA 준비의 NaOH 메서드 KASP와 호환 되지 않습니다. - 게놈 DNA를 분 광 광도 계를 사용 하 여 계량. 각 반응 포함 약 20-30 ng 되도록 분자 생물학 학년 물을 사용 하 여 게놈 DNA 템플렛을 희석.
참고: 4 또는 5 샘플 계량, 그들, 수영장 다음 평균에 따라 모든 샘플에 대 한 희석을 준비 합니다. 이 프로토콜을 성인 꼬리 조직에 사용 하는 경우 1: 100 희석은 종종 충분 합니다. DNA 농도의 정확한 정량화는 필요 하지 않습니다. - 추가 0.14 µ L KASP 뇌관의 혼합 및 1.5 mL microcentrifuge 튜브와 튜브의 하단에 내용을 수집 centrifuging 짧게 전에 잘 믹스에 얼음에 샘플 당 혼합 KASP 마스터의 5 µ L.
참고: KASP 마스터 혼합 열 및 민감한 빛 얼음에 대 한 재고 유지 이며, 직접 빛을 하지 마십시오. - 피펫으로 5 µ L 뇌관/마스터의 믹스 솔루션 사용 되 고 실시간 PCR 기계에 대 한 적합 한 96-잘 광학 PCR 격판덮개의 우물으로.
- 피펫으로 5 µ L의 희석 (약 5-7 ng / µ L) 각 DNA 템플릿 샘플 고를 섞어 피 펫과 발음.
- Nuclease 무료 물 3 웰 스 노-템플릿 컨트롤 (NTC)으로 희석된 확인된 homozygous 야생 타입, 긍정적인 컨트롤 heterozygous 및 homozygous 돌연변이 DNA 템플렛의 5 µ L을 추가 하는 추가 5 µ L.
- 영화에 각 잘 완전히 밀봉 판 보장 광학 투명 필름 밀폐 장소.
- 짧게 원심 600 x g 하단에 내용을 수집 하 고 믹스에서 거품을 제거 하 고 접시.
참고: 진행 준비까지 빛에서 얼음 및 방패에 접시를 유지. - 표 1에 표시 된 순환 프로그램을 사용 하 여 주요 KASP 반응을 수행 하.
- 볼 결과 점도 분석 컴퓨터에 의해 제작. 성공적인 반응 플롯 ( 그림 3)에 포인트의 4 가지 그룹을 표시 됩니다: 3 샘플 유전자, 및 원점 근처 NTCs의 한 그룹에 해당 하는 그룹. 긍정적인 컨트롤 적절 한 샘플 그룹화와 분리 해야 합니다.
- 컴퓨터 프로그램에 해당 특정 genotypes, 추가 세트 자전거 하로 그룹화 될 수 있습니다 음모를 인식 하지 못하는 경우 (표 2) 필요 합니다. 반복 하 여 추가 프로그램 유전자 형에 의해 꽉 그룹을 인식 하는 컴퓨터.
- 유전형 결과 쉽게 사용 및 분석에 대 한 스프레드시트 파일에 내보냅니다.
- 장소 zebrafish 꼬리 조직 50에서 µ L. 2-5 h 20 분 94 ° C 비활성화 단계 뒤 55 ° C에서 열 cycler에 96-잘 PCR 플레이트 및 다이제스트의 당 성분을 K 10 mg/mL의 10 µ L를 추가 합니다. 소화. 세포 제품을 냉장
- 함께 주 물 시스템에 식별된 heterozygous 동물 집.
2.는 첫 번째 라운드의 자손 득점
- 동물 핀 클립에서 복구 후 쌍 형제 heterozygotes 크로스
- 인덱스도 intercrosses을 설정. 디바이 더를 사용 하 여 되도록 배아 동기 16.
- 배아를 수집 하 고 계속 감 금 소를 사육에서 고립 된 부모의 쌍.
- 호전적인 물고기 분리 하거나 커버와 함께 제공 될 수 있도록 격리 된 성인 모니터링 (났습니다 물고기 멋지게 작업 그물). 물고기를 먹여야 한다 고 그들의 물 고정 물에 IACUC 지침 변경.
- 태아 양육
- 무대 고 표준 조건 17에서 애벌레를 zebrafish 태아.
- Phenotypically 야생-타입 동물 수영 방광 클러치의 75%에 증가 될 때 5 또는 6에 유리 피 펫을 사용 하 여 수집 합니다. 어떤 부모 그들을 굴복 녹음 보육원에서 phenotypic 야생 종류 배치.
참고: 있는 치명적인, 사실 많은 골격 돌연변이 열성 돌연변이 체 대립 유전자와 homozygous 돌연변이 형태로 수영 방광 18 , 19 실패. 그러므로, phenotypic 야생 종류 수 있습니다 쉽게 분별 수 비정상적된 수영 방광에 따라 그들의 돌연변이 체 형제 자매에서.
- Alcian 블루/알리자린 레드 연골과 뼈 얼룩
- 0.17 g/L Tricaine를 사용 하 여 그들의 수영 방광 팽창 하지 않는 애벌레 Anesthetize-배아 미디어에 S. 넓은 구멍 유리 파스퇴르 피펫으로 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 동물을 수집 합니다. 튜브 당 이상의 100 애벌레 추가.
- 각 관에서 배아 물을 제거 하 고 관 당 1 x PBS에 2 %paraformaldehyde 1 mL에 동물 수정.
주의: 수성 PFA 가연성 이며 심각한 피부와 눈 자극을 일으킬 것 이다. 장갑과 눈 보호와 같은 적절 한 개인 보호 장비를 착용 하 고 사용 후 손을 씻으십시오. - 1 h 바위; 더 긴 고정 손상 뼈 얼룩. 이 기간 동안 정기적으로 튜브를 확인 하 고 없는 애벌레를 보장 하기 위해 모든 이후 락 단계 측면에 붙어 되거나 튜브의 하단에 clumped.
- 유리 피 펫을 사용 하 여 튜브에서 정착 액 제거, 50% 에탄올과 락 10 분의 1 mL을 추가
- 준비 20 µ L의 0.5%를 추가 하 여 솔루션 얼룩 신선한 공기로 Alcian의 1 mL 당 알리자린 레드 (0.04 %Alcian 블루/10 m m MgCl 2 / 80% 에탄올). 50% 에탄올을 제거, 각 관, 그리고 바위에 솔루션을 하룻밤 얼룩의 1 mL를 추가 합니다. 애벌레는 최대 5 일 동안 얼룩에 남아 있을 수 있습니다.
- 튜브에서 얼룩이 솔루션을 제거 하 고 각 관을 80% 에탄올/10 m m MgCl 2 솔루션의 1 mL를 추가 합니다. 적어도 1 시간;에 대 한 튜브를 록 명확 하 게 Alcian 블루 얼룩을 생산할 수 있는 하룻밤을 rinsing.
- 80% 에탄올/10 m m MgCl 2 솔루션 튜브에서 제거 및 추가 50% 에탄올의 1 mL; 5 분에 대 한 바위
- 튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 25% 에탄올과 락 5 분의 1 mL을 추가
- 튜브에서 50% 에탄올 솔루션을 제거 하 고 추가 1 mL 신선한 3% H 2 O 2 /0.5% 코 표백 솔루션입니다. 뚜껑 열기와 튜브 마이크로 튜브 랙 또는 희미 한 갈색 채색 솔루션의 위쪽 부분에서 볼 수 있습니다 때까지 약 10 분에 서 보자.
참고: 솔루션 위에 거품 형태의 레이어. 주의 타이밍은이 단계에서 필요 이상으로 표백 귀 착될 것 이다 가난한 더블 얼룩. - 표백 솔루션 제거 및 추가 25 %glycerol/0.1% 코의 1 mL; 1 h. 10 분 바위
- 튜브에서 25 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거, 각 관, 하룻밤에 10 분 동안 바위에 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션의 1 mL을 추가.
- 튜브에서 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 제거 하 고 다시 각 튜브를 50 %glycerol/0.1% 코 솔루션을 추가 합니다. 락 하룻밤 도움이 됩니다 애벌레 내부 누적 될 수 있는 공기 방울을 제거. 사용 하지 않는 저장소 4 ° C에서 골격 준비 스테인드.
- 형 점수
- 점수 스테인드 penetrance 선택한 표현 형의 대 한 돌연변이 자식. 니콜스 외에 1 돌연변이 소성 뼈의 모든 발생에 대 한 득점 했다.
참고: zebrafish 부모는 고정 물에 알리자린 레드 얼룩 시간 함께 사라질 수 있기 때문에, 그것은 중요 한 골격 준비 완료의 몇 일 이내에 해골 점수. - Penetrance는 표현 형을 가진 유전자 형의 비율 이다. 다음 수식에 의해 계산 하는 백분율 penetrance:
%penetrance (표현 형을 가진 돌연변이) = / (돌연변이의 총 수) × 100
- 점수 스테인드 penetrance 선택한 표현 형의 대 한 돌연변이 자식. 니콜스 외에 1 돌연변이 소성 뼈의 모든 발생에 대 한 득점 했다.
3. 가족 선택
- 선택 2 높은 penetrance, 다음 세대에 대 한 두 개의 낮은 penetrance 가족. Penetrance, 뿐만 아니라 통치와 활기; 전파 하는 가족을 선택할 때 고려 하는 것이 중요 하다 이 대 한 자세한 내용은 토론을 참조 하십시오.
- 줄 각 부모의 쌍 하위 재고 식별자: 가족.01,.02, 등
- 집 여러 혼합된 섹스와 메인 시스템에 부모의 쌍 ' 동반자 ' 물고기. 동반자 물고기 수 영구, 명백한 구별 기능, 변경 된 착 색 또는 탄 미 익 구조 등 어떤 제 브라 라인.
참고: 많은 연구원은 성공적으로 탱크에 쌍만 사육 유지할, 호의 베푸는 결과 볼 수 있습니다 여러 동반자 물고기와 쌍을 주택으로. 이 선택적 단계 더 큰 학교에 보관 하는 동물의 사육을 허용 하 고 그래서 그들은 수 있는 반복적으로 교차 필요에 따라 쉽게 검색. 부모의 쌍 대 전체 형제 가족; 생성 하 반복적으로 교차 수 있습니다. 같은 부모의 쌍 교차 반복 하기 전에 적어도 일주일 기다려. - 추려 단계 2.2.2에서에서 애벌레 가족. 그 다음 세대에 대 한 선택 하지 했다.
- 탱크 그들의 돌연변이 체 형제에서 penetrance로 선택한 가족에서 야생-타입 형제 애벌레를 포함 하 고 정상적으로 성인 기에 발생.
- 차세대 적어도 4 개의 풀-형제 가족, 위쪽 라인에 대 한 두과 아래쪽 라인에 대 한 2를 해야 합니다.
- 애벌레 도달 성적인 성숙, 반복 새로운 세대와 함께 1 단계부터 시작 하는 프로토콜.
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Representative Results
이 프로토콜은 장기 축산 기술 이해 zebrafish 골격 돌연변이 (그림 1)에 대 한 유용. 선택적인 breeding 자손을 테스트 하 여 전반적인 penetrance 하향 및 상향 몇 세대 (그림 2)에 있는 변화를 항복 한다. 우리의 이전 작품에서는, 선택적인 breeding의 2 라운드 3117%에서 평균 penetrance 아래로 몰고. 마찬가지로, 우리의 위쪽 라인에서 우리 이동 평균 penetrance 위쪽으로 63%에서 93%로 3 세대. 선택적인 breeding의 4 라운드 후 아래쪽 또는 위쪽으로 penetrance 응답 하지 않으면, 득점 되는 표현 형 자손 테스트 하 여 선택적인 breeding에 과민 하지 않다 가능 하다.
성공적인 KASP 절차, 유전자 형에 해당 하는 샘플의 그룹화는 컴퓨터 프로그램에 의해 인식 되어야 한다 하 고는 NTCs 작의의 근원에 부근 해야 충분 한 사이클 후 꽉 수행 (그림 3). 경우 KASP 분산형 플롯 데이터를 밀접 하 게 그룹화 하지 또는 한 NTC에 오염 감지, 프로그램 genotypes을 확인할 수 없습니다. 경우 대부분 샘플 그룹화, 유전자 형에 의해 인식 됩니다 하지만 여전히 일부는 모호한, 불확 실한 샘플 데이터 집합에서 생략 유전형 클러스터 인식 프로그램을 허용할 수 있습니다. 알 수 없는 샘플 호출 및 모호한 유전자 그룹화 다음에서 발생할 수 있습니다: 없는 NTCs 원점, 원점 근처 찾을 이상 희석된 템플릿 DNA 샘플을 일으키는 근처 그룹화 하지 것입니다 오염 된 반응 혼합물에서 묽 게 된 템플릿 DNA 또는 반응 주기의 부족 수. 오염이 의심 되는 경우 신선한 NTCs를 준비 합니다.
성공적인 Alcian 블루/알리자린 레드 얼룩 것입니다 vibrantly 뼈 및 연골 요소 (그림 4A) 투명 하지 않은 얼룩이 있다 또는 희미 (그림 4B). 연골 요소의 경계 선명 하 고, 표시 하 고 개별 chondrocytes 뚜렷한 것. 알리자린 레드 뼈 얼룩은 일반적으로 두 개의 얼룩의 더 몹시 이다. 팬 모양 opercle (op) 뼈와 branchiostegal 광선 (br) 모양의 막대기는 성공적인 6 일 게시물 수정 (dpf) 뼈 얼룩 (그림 4A, op, br)의 좋은 지표. 표백 단계 색상의 다른 조직을 완전히 삭제 하는 동안 뼈와 연골에 얼룩 퇴색 한다. 눈은 이후에 성공적인 얼룩 지우기 갈색 색조를 있을 것 이다. 너무 집중 Alcian 블루 분석 불가능 (그림 4C) 다른 조직에서 지워지지 않습니다. 자료의 테이블에 설명 된 이외의 공급 업체에서 Alcian 블루 또한 가난한 연골 얼룩을 만들 수 있습니다.
그림 1 . 골격 Penetrance 자손 테스트에 대 한 선택적인 Breeding의 도식 개요. (A) 유전자 돌연변이 라인에서 전체 형제 가족 heterozygous 사업자 식별을 (B) 행렬과 교차 확인된 heterozygous 형제 고 부모 자손 득점 수 있습니다 때까지 격리를 유지. (C) , 성인 기에 발생 비정상적된 수영 방광 연골 및 뼈 얼룩 없이 돌연변이 애벌레를 수정 하는 보육원에서 phenotypically 야생-타입 애벌레 비정상적된 수영 방광으로 배치 합니다. (D) 점수 Alcian 블루의 각 클러치/알리자린 레드 스테인드 penetrance 돌연변이 동물. 어느 가족 위쪽으로 그리고 아래쪽으로 사육 될 것 이다 및 인상 성인 각 가족에서 phenotypic 야생 형식을 선택 합니다. 그들은 큰 전체 형제 가족을 생성 하 반복적으로 교차 될 수 있도록 (E) 부모의 집 동료와 함께 쌍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 . 골격 돌연변이 Penetrance 자손 테스트 하 여 이동의 예. 선택적인 사육이이 원고에 설명 된 대로 제 브라 mef2cab1086 돌연변이를 적용 했습니다. 이 실험에서 우리는 opercle와 치명적인 homozygous 돌연변이에 branchiostegal 레이 소성 뼈의 높은 또는 낮은 penetrance 선택. 돌연변이 자손에 소성 뼈의 penetrance 같이 penetrance 여 색 누가 부모의 쌍에 할당 되었다. 이 그림1에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 . 스크린 샷 KASP 유전형 및 결과 분석에 사용 되는 소프트웨어에서.
이 성공적인 KASP 반응에서 꽉 샘플 그룹 형성 되었다. 블루 포인트는 homozygous 돌연변이, 녹색 포인트는 heterozygous, 빨간 포인트는 야생 형 homozygous 되며 검은 사각형 NTCs 그룹 컴퓨터 프로그램에 의해 지정 되었다. NTCs 상징 하는 더 작은 반응 혼합물 오염 하는 작의의 근원에 가까이 있습니다. 유전자 형을 아직 할당 되지 않은 불확 실한 샘플 x 표시 될 것 이다. 이 성공적으로 완료 된 실행에 있는 아무 불확 실한 샘플을 확인 하 고 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 . 좋은, 나쁜와 추악한 Alcian 블루/알리자린 레드 골격 준비.
(A) 신선, 멋지게 스테인드 하 고 맑게 된 연골과 뼈 얼룩의 예가 표시 됩니다. 고유한 연골 요소와 쉽게 시각화 된 빨간 opercle (op)와 branchiostegal 레이 (br) 뼈 note. (B) 약한 연골 얼룩 어두운 알리자린 레드 얼룩 표시 됩니다. 이 샘플 4 ° C에서 opercle 및 branchiostegal 레이 서 어두운된 연골 뼈 구별 하기 어려운 결과로 여러 달 동안 토. (C) -스테인드 애벌레 너무 많은 Alcian 블루 사용 되었다. 눈금 막대는 200 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
선택적인 Breeding 유전자 기능의 예민을 발표
더 또는 덜 심각한 선택적인 breeding에 의해 돌연변이 고기 이동 유전자 기능에 새로운 통찰력을 얻을 하는 간단한 방법입니다. 선택 되지 않은 번 식의 표준 방법으로 비교, 여기에 제시 된 프로토콜 돌연변이 고기의 훨씬 더 완전 한 이해를 얻을 수 있습니다. 특히, 심한 긴장을 생성 하 여 돌연변이 고기의 전체 폭 수 계시 될, 선택 되지 않은 주식으로 관찰 되지 않은 것을 포함 하 여. 따라서, 유전자 연구에 대 한 새로운 발달 역할 검색 될 수 있습니다. 반대로, 가벼운 긴장을 생성 하는 것은 관심사의 유전자에 대 한 가장 중요 한 역할 밝힐 수 있다. 받아, 예를 들어 단일 표현 형 가벼운 돌연변이에 지속. 여기 가장 비판적으로 가벼운 긴장에서 방해 남아 발달 과정에서 유전자의 기능 필요 가능성이 높습니다. 따라서, 주어진된 돌연변이의 전체 phenotypic 시리즈 선택적인 breeding를 통해 더욱 완벽 하 게 이해할 수 있습니다.
근 친 결혼 불경기를 피하
관련된 개인의 자손 zebrafish20를 포함 한 많은 동물 및 식물 시스템에서 감소 된 생존과 통치를 보여 줍니다. 근 친 결혼 불경기로 알려진, 대부분 모델 멋 부리 다 하는 해로운 열성 대립 유전자 또는 heterozygotes 기초21이 현상 도움이 되는 대립 유전자 loci에서 homozygosity를 증가. 야생 zebrafish와 연구는 자연 인구22에 해로운 대립 유전자의 낮은 주파수를 공개. 또한, 실험실 긴장 AB 같은 열성 치 사 돌연변이23의 허가 추가 했다. 따라서, 해당 주의 농업 선택한 zebrafish 라인의 무기한 근 친 수 하는 것 같다. 실제로, 최근 보고서 밝혀 그 zebrafish 적어도 16 세대9전체 형제 근 친 결혼에 의해 유지 될 수 있다.
이 프로토콜은 타고 난된 제 브라 라인 개발 연구를 위해 유용한 충분 한 자손을 생산 하기 위해 계속 수 있도록 몇 가지 간단 하지만 중요 한 단계를 강조 합니다. 이 선택적인 breeding 전략의 가장 중요 한 점은 자체 선정 과정입니다. 첫째, 동물을 개발 해야 합니다 신중 하 게 모니터링 발달 결함 또는 이상이, 관심의 돌연변이에 링크 되지 않은 가족에 대 한 엄격 하 게 선정 될 수 있다 그래야. 두 번째, 클러치 크기 선택적인 breeding 대 가족 요구에 따라 고려 되어야 한다. 항복 하는 쌍을 선택 하는 것 외에도 큰 클러치, 대 가족 같은 부모의 쌍의 반복 십자가 통해 생성 될 수 있습니다. 쉽게 될 여전히 있도록 동안 큰 conspecific 그룹에 쌍 번 식의 장기 주택 수 유지 부모의 쌍 탱크에 다른 많은 동반자와 함께 물고기를 쉽게 번 식 쌍 착 색 등 지 느 러 미 돌연변이, 분별 식별 하 고 검색. 이 연습 부모의 쌍은 다른 zebrafish24쇼 얼 무료 건강 한 사회 환경을 촉진 합니다. 그러나 연구원 쉽게 검색할 수 부모의 쌍 그들은 반복, 교차 될 수 있도록 매우 큰 전체 형제 가족의 생성을 활성화.
선택 가능한 표현 형을 선택
이 프로토콜 형 득점의 큰 거래를 포함 한다. 따라서, 하나의 제한 선택 쉽게 시각화 하 고 빠르게 점수 표현 형에 적용 될 필요가입니다. 그것은 또한 어떤 단계 동물 고정 되며 득점을 위한 스테인드에 결정 하는 것이 중요입니다. 뼈 고기, 뼈 더25 를 개발 하 고 더 쉽게 득점 될 것 이기 때문에 6 dpf까지 기다려야 유리 하다. 돌연변이 고기를 패턴화 하는 연골에 대 한 4 dpf는 종종 표현 형26,27득점에 적합 합니다. 때 동물을 해결 하기 위해 결정, 그것은 관심사의 유전자는 다 면 발현 성 역할 보조 결함을 혼동 될 수 있습니다 다른 조직에서 발달 돌연변이 고기 선도 경우 고려 하는 것이 중요. 예를 들어 chondrogenesis에 있는 일반적인 지연 같은 보조 결함이 전에 4 dpf에서 해결 하는 것이 중요 하다 심장 부 종 표시 골격 돌연변이와26명단.
편의상, 우리는 시스템 penetrance 우리의 선택적 번 식에 초점을 맞추고 득점 하는 이진을 선택 했다. 그러나, 돌연변이 고기 또한 가변 표현력을 가질 수 있습니다. 미래 연구, 그것은 재미 있을 것입니다 테스트 penetrance, 같은 표현력은 선택적인 breeding에 민감한 경우. 즉, 특정 소성 뼈 모양의 주파수 선택적인 breeding를 통해 변경할 수 있습니다.?
이 프로토콜 자손 선택 및 zebrafish 발달 유전자 연구의 응용의 고전적인 선택적 번 식 전략을 설명합니다. 여기에 설명 된 간단한 농업 사례는 어떤 실험실, 소규모 시설에도 가능 합니다. 선택적인 breeding, zebrafish 시스템의 가장 큰 강점 중 하나를 통해 세공 유전학, 수십 년 동안 전파 된 돌연변이로 새로 개발된 된 돌연변이 유전자 기능에 대해 배울 수 있 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리 지도 대 한 척 Kimmel, 존 다우드가 번 식 전략 개발에 대 한 도움, 골격 얼룩, 완성에 그녀의 작품에 대 한 Macie 워커 및 Charline 워커와 보 니 울만 도움이 zebrafish 조언을 감사 하 고 싶습니다. 이 작품에 JTN K99/R00 DE024190에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Paraformaldehyde, pelleted, solid | Ted Pella Co. | 18501 | Pelleted PFA is a safer alternative to powdered PFA |
| Magnesium Chloride, solid | Acros Organics | 223210010 | |
| 10x PBS, Aqueous | Fisher | BP3994 | |
| 190 proof Ethanol | |||
| Alcian Blue, solid | Anatech Ltd. | 867 | Must be from Anatech |
| Alizarin Red, solid | Sigma | A5533-25G | |
| Glycerol, liquid | Fisher | BP229 1 | |
| Hydrogen peroxide, liquid | Fisher | BP263500 | |
| Potassium hydroxide, solid | Fisher | P250 500 | |
| StepOnePlus Real-time PCR Machine | Applied Biosystems | ||
| MicroAmp Fast Optical 96-well Reaction Plate with Barcode (0.1 mL) | Applied Biosystems | 4346906 | |
| Microseal 'B' seal | BioRad | MSB1001 | |
| KASP Master Mix, High ROX | LGC | KBS-1016-022 | https://www.lgcgroup.com/products/kasp-genotyping-chemistry/#.WOPX41UrKUk |
| KASP By Design Primer Mix | LGC | KBS-2100-100 | |
| Tris HCl, solid | Fisher | BP153 500 | |
| potassium chloride, solid | Fisher | BP366 500 | |
| Tween-20, liquid | Fisher | BP337 100 | |
| Nonidet P40 | ThermoFisher | 28324 | |
| Tricaine-S | Western Chemicals | ||
| Proteinase K | Fisher | BP1700 100 | |
| T100 Thermal Cycler | BioRad | 1861096 | |
| Controlled Drop Pasteur Pipets | Fisher | 13-678-30 | |
| Nanodrop | ThermoFisher | for DNA quantitation |
References
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