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Summary
여기에 제시 된 대장균 또는 Shigella flexneri 세균성 활용을 사용 하 여 고밀도 transposon 삽입 라이브러리를 만들기 위한 간단한 방법이입니다. 이 의정서는 transposon의 임의의 게놈 삽입 하 여 독특한 돌연변이 박테리아에 수천의 수백의 컬렉션의 창조를 허용 한다.
Abstract
Transposon mutagenesis는 transposon 라는 DNA의 조각의 무작위 게놈 삽입을 통해 유전자 중단을 허용 하는 방법입니다. 프로토콜 아래 대 저항 마커를 포함 하는 transposon 은닉 하는 플라스 미드의 세균 변종 사이의 높은 효율 전송 하는 방법을 설명 합니다. 플라스 미드 부담 transposase 변형 tnp 유전자는 transposon 매우 낮은 insertional 바이어스 받는 사람 긴장의 게놈으로 삽입 하 여 인코딩됩니다. 이 메서드는 따라서 있는 transposons 대장균 또는 Shigella flexneri 박테리아의 받는 사람 부담에 독특한 게놈 위치에 삽입 된 큰 돌연변이 라이브러리의 생성을 수 있습니다. 세균성 활용, electroporation 또는 화학 변환 같은 다른 방법에 반대를 사용 하 여 독특한 클론의 수천의 수백을 가진 큰 라이브러리를 만들 수 있습니다. 이 비 필수적인 유전자에 있는 모든 4-6 기본 쌍으로 자주 발생 하는 삽입 된 고밀도 삽입 라이브러리를 생성 합니다. 이 메서드는 다른 방법에 우수한 조밀한 transposon 삽입 도서관의 창조에 대 한 저렴 한, 사용 하기 쉬운 고 능률 방법에 대 한 수 있습니다. 유전 상호 작용 네트워크, 유추 (Tn-Seq), 연속 transposon 같은 다운스트림 응용 프로그램 또는 더 간단 하 게, mutational transposon 라이브러리를 사용할 수 있습니다 (앞으로 유전) 화면.
Introduction
박테리아에서 transposon mutagenesis 라이브러리의 창조는 세균성 병원 체1,2, 독성 유전자의 발견에서 필수 유전자3, 의 연구에 이르기까지 응용 프로그램의 다양 한 유용 4 , 5 , 6, 유전자 상호 작용의 id에7,,89네트워크. 이러한 연구에 중요 한 돌연변이의 큰 도서관을 만드는 기능이입니다. Transposons (짧은 조각 DNA의 게놈에 무작위로 삽입)의 사용은 유전자 기능을 방해 하는 간단한 수단으로 열려있는 독서 프레임 또는 유전자의 규제 지역 내의 transposon의 삽입 함수 또는 식에 자주 중단 됩니다. 유전자.
여기에 설명 된 플라스 미드 pJA110를 사용 하 여 세균성 활용 하 여 대장균 또는 S. flexneri transposon 도서관의 창조를 위한 방법이입니다. 이 플라스 미드를 사용 하 여 두 가지 주요 이점이 있다. 첫 번째 장점은 pJA1 플라스 미드에서 표현 Tn10 transposase의 변종 유도할 수 있는 이며 낮은 삽입 바이어스11,12는 transposon 게놈에 무작위로 통합할 것입니다 의미 했다 때 이소프로필 Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)는 미디어에 추가 됩니다. transposon 대 저항 마커를, 받는 사람 긴장의 염색체에 돌연변이 transposon 삽입과 선택에 대 한 수 있도록 포함 되어 있습니다. PJA1 플라스 미드의 두 번째 장점은 그것 포함 하는 복제의 R6K 돌연변이 기원입니다. 복제의 R6K 돌연변이 출처 람다 pir 유전자를 플라스 미드13의 유지 보수에 대 한 순서 대로 필요합니다. 플라스 미드는 pir- 긴장에 복제할 수 없습니다로 받는 사람 부담 (그림 1)에서 손실 될 것입니다. 이렇게 하면 Tn10 transposase 셀에서 제거 되 고 더 이상 활성 상태 인지, 초기 전위 이벤트 후 추가 변이 감소 시키기.
받는 사람 부담을 기증자 긴장에서 pJA1 플라스 미드 이동 세균성 활용을 사용 하 여 여러 가지 이유로 유리 하다. 활용은 간단 하 고 저렴 한 수행 하 고는 electroporator와 같은 특별 한 장비를 필요 하지 않습니다. 또한, 세균성 활용의 고효율 대용량 라이브러리에 대 한 허용 (> 2 x 105 독특한 삽입) 하룻밤 세균성 문화6의 단지 몇 밀리 리터 (mL)와 함께 달성. 프로세스는 약 두 시간의 실습 보육에 대 한 시간 함께 하 고 박테리아의 성장을 걸립니다. Langridge 외. 14 라이브러리를 만드는 transposon mutagenesis는 크기의 것과 유사한 130 electroporations 수행을 보고 설명 여기8, 단일 활용으로 이루어집니다. 130 electroporations 사용 하 여 electrocompetent 세포의 노동 집중 하 고 시간이 걸리는 준비와 많은 비싼 물질 (예, electroporation 큐 벳), 비용의 이상의 $1000 달러 혼자 소모품에 사용 해야합니다. 다른 연구10 사용 유사한 방법, 그러나 다른 세균성 긴장, 및 달성된까지 작은 라이브러리 크기 (5 x 104 콜로 니 형성 단위) 보다 여기에서 보고 된.
기증자 스트레인에 노트: 여기 사용 기증자 변형 대장균 스트레인 BW2076715 pJA1 transposon 플라스 미드16를 포함 하는. 스트레인 BW20767 pJA1 플라스 미드의 양도 매우 효율적인 다른 긴장을 단백 결합 수 있습니다. 또한, 중요 한 것은, BW20767는 람다 pir +. 앞에서 설명 했 듯이, 플라스 미드 pJA1는만 람다 pir 유전자 포함 된 긴장에 유지 될 수 있다. 이 긴장 대 이며 암 피 실린 내성입니다. PJA1 플라스 미드 암 피 실린 저항 마커를 포함 하 고 대 저항 마커는 transposon 포함. 이 긴장에서 100 µ g/mL 암 피 실린을 사용 하 여 플라스 미드에 선택과 성장 이다. 그것은 또한 constitutively 표현 transposase 유전자를 품고 다른 긴장을 안정, 알려져 있다 지적 가치가 및 transposase 사용 하는 동안 여기에서 유도할 수 있는 제어, 새 식의 낮은 위험이 남아 있다. 이러한 이유로, 그것은 좋습니다이 긴장의 통과 최소화 해야 하 고 신선한 행진 각 새로운 라이브러리 준비에 대 한 고정 된 문화에서가지고 야 한다. 여기에 사용 되는 기증자 스트레인 요청 시 우리 연구소에서 제공 됩니다.
받는 사람 스트레인에 대 한 정보: 받는 사람 부담 선택, S.flexneri (또한, 토론 참조)의 변종 대장균 의 K12 파생 실험실 긴장 등의 변형 수. 기증자 스트레인에 대 한 선택할 수 있도록 받는 사람 긴장 대 저항, 그는 추가 항생제 저항 표식이 있어야 합니다. 받는 사람 스트레인에 대 한 대장균 MG1655 긴장 여기 소개 자연 nalidixic 산 돌연변이 함께 사용 됩니다. 자발적인 nalidixic 산 돌연변이 30 µ g/mL에서 nalidixic 산을 포함 하는 접시에 200 µ L aliquots에서 하룻밤 문화의 2 mL에 밖으로 도금에 의해 선정 되었다. MG1655의 단일 복제 받는 사람 긴장 되기 nalidixic 산에 저항 했다 선정 됐다. 또한, 위에서 설명한 대로 받는 사람 부담 람다 pir 부정 되어야 합니다.
개요: 세균성 활용 자리를 차지 하 고 pJA1 플라스 미드는 받는 사람 긴장으로 기증자 스트레인에서 이동, 미디어 IPTG의 추가 것의 표현을 유도 IPTG-유도할 수 있는의 통제, tnp 유전자 lacIq/Ptac 발기인 (그림 1). PJA1에 tnp 유전자 돌연변이 transposase 핫스팟6,,1011에 삽입의 낮은 주파수를가지고 이다. 추가와 IPTG와 유도 transposon는 활성화 하 고 게놈에 무작위로 삽입. 플라스 미드는 람다 pir 받는 긴장에 유지 될 수 없습니다 하 고 손실 됩니다.
Protocol
주의: S. flexneri 받는 사람 부담, 사용 하는 경우는 참고 하시기 바랍니다 S. flexneri 위장 질환을 일으킬 수 있는 인간 병원 체. 적절 한 biosafety 주의 (유럽 및 미국에서 BSL-2 또는 뉴질랜드에서 PC2 지정)와 S. flexneri 관련 실험을 수행 되어야 합니다. 이 프로토콜와 관련 된 비디오에서 수행 하는 모든 실험 끝났다 비 병원 성 대장균의 특징이 잘 받는 사람 긴장을 사용 하 여 p c 1에 MG1655. 6에 설명 된 대로 Shigella flexneri 작업 이전 바젤, Biozentrum에 BSL 2 lab에서 수행 되었다.
참고: 다음 실험은 두 번 수행 하 고 효과적으로. 첫 번째 부분 (4.5 단계 1.1-단계)는 라이브러리, 목표 잔디 양식을 주는 접시, 당 많은 개별 식민지 하지만 그리 많은 그 활용의 희석을 찾기 위해 도금에 대 한 최고의 희석을 수행 됩니다. 이 크게 감소 피트 니스와 함께 돌연변이 더 강력한 피트 니스와 그 간의 경쟁을 줄이는 것입니다. 두 번째 부분 (단계 5.1-7.4) 최종 라이브러리, 많은 접시는 라이브러리의 적절 한 희석의 확산은의 창조 이다.
1.를 준비 1 일 이전에 실험
- Inoculate, 냉동된 재고, 파운드 국물의 2 개 mL에 기증자 스트레인에서 밀러 레시피 (10 g/l NaCl) 미디어에서 100 µ g/mL 암 피 실린 포함. 여기 사용 기증자 스트레인은 대장균 스트레인 BW20767 15 pJA1 플라스 미드 11 은닉. 암 피 실린의 사용 유지 pJA1 플라스 미드에 대 한 선택.
- 단일 식민지 또는 냉동된 주식, 암 피 실린 또는 대 저항 표시와 함께 파운드 미디어의 2 mL에 받는 사람 긴장에서 Inoculate. 여기에 사용 되는 받는 사람 긴장은 대장균 " 야생 타입 " MG1655 17 , 18 nalidixic 산에 자연 저항 돌연변이와 스트레인. 30 µ g/mL nalidixic 산에서 재배.
- 준비 20 Luria 국물 1.5 %agar 포함 하는 (에서 90 mM 페 트리 접시, 약 12.5 mL) 접시. 항생제를 부족 한 천 배지는 4 ° C에서 사용까지 몇 달 동안 저장 될 수.
- 20 Luria 국물 준비 포함 1.5% 한 천 배지 (90 mM 페 트리 접시, 약 12.5 mL)에 포함 된 두 nalidixic 산 30 µ g/mL에서 50 µ g/mL (LBA Nal30 Kan50)에 대. 항생제를 포함 한 천 배지 사용까지 몇 달 동안 4 ° C에서 어둠 속에 저장할 수 있습니다.
- 살 균 파운드 미디어의 200ml를 준비합니다. LB 미디어는 몇 달 동안 실내 온도에 저장 될 수.
- 제조 업체에 따라 100 m m의 1 mL IPTG, 살 균 재고 준비 ' s 지침.
2. 세균성 Mating 또는 활용
실 온에서- 14000 x에서 1 분간 기증자 스트레인의 숙박 문화의 원심 분리기 1 mL g. 성장 매체를 버리십시오. 이 단계는 항생제를 포함 하는 모든 성장 매체를 제거 이루어집니다.
- 110 µ L의 파운드 (항생제를 포함 하지 않는), 따라서 문화 집중으로 셀 펠 릿 resuspend.
- 집게를 사용 하 여 살 균, 살 균 nitrocellulose 필터 위치 (또는 살 균 압 종이 조각을 사용할 수 있습니다 참조 하십시오 자료 목록)는 LBA 플레이트 (항생제를 포함 하지 않는)의 중간에. 접시를 라벨 " 부정적인 제어: 기증자 ".
- 는 피 펫을 사용 하 여 드롭 필터에 집중된 기증자 문화 50 µ L.
- 반복 단계 2.1-4 받는 사람 긴장을 위한 접시를 라벨 " 부정적인 제어: 받는 사람. "
- 라이브러리, 드롭 (이 번호판 없어야 항생제)는 LBA에 단일 살 균 필터에 (2.5 단계)에서 받는 사람 긴장의 (2.2 단계)에서 기증자 및 50 µ L의 50 µ L. 이 접시를 레이블 " 라이브러리. " Mating 기증자와 받는 사람 필터에 가까운 신체 접촉에서 때문에 발생 합니다.
- 장소 6 h. 위해 37 ° C에서 필터를 포함 하는 한 천 배지
3. PJA1는 Transposase의 IPTG 유도 함으로써 Transposon의 활성화
- 준비 3 15 mL 원뿔 튜브 1mm (즉, IPTG의 100 m m 재고 20 µ L)의 최종 농도에 IPTG와 파운드의 2 개 mL를 포함 하. 각 레이블: 기증자 제어 받는 사람 컨트롤 및 라이브러리.
- 성장 (단계 2.4)에서 37 ° C에서의 6 h 후 인큐베이터에서 플레이트를 제거합니다. 일부 세균 성장 필터에 표시 되어야 합니다.
- 집게를 사용 하 여 살 균, 기증자 컨트롤에서 필터 종이 제거 하 고 기증자 제어 (3.1 단계)에서 라고 표시 된 15 mL 원뿔 유리병에 넣습니다. 받는 사람 컨트롤 및 라이브러리에 대 한 동일한 작업을 수행.
- 15 mL 원뿔 유리병의 하단에 필터 종이 고 파운드에 완전히 빠져들 수 있도록 튜브를 누릅니다
- 적어도 전체와 동 관을 nitrocellulose 필터에서 박테리아를 끊을 높은 분. LB 세균 세포 ( 그림 2)와 흐린 될 해야 합니다.
- LBA Nal30 Kan50 플레이트 표시에 기증자 컨트롤에서 vortexed 박테리아 서 스 펜 션의 200 µ L 플레이트 메 마른 유리 구슬 또는 살 균 분산기를 사용 하 여 " 기증자 제어, 200 µ L ".
- (3.6)의 위 단계를 반복 하 여 라벨 번호판 받는 사람 컨트롤에 대 한 " 받는 사람 컨트롤, 200 µ L ".
- (3.7) 위 단계를 반복 하 여 판 라벨 라이브러리에 대 한 " 도서관, 200 µ L ".
- 확인 추가 희석 (즉, 1:5, 1시 10분과 1: 100 희석, 파운드는 희석제로 항생제를 포함 하지 않는 사용 하 여) 라이브러리의. 플레이트 200 µ l undiluted 라이브러리에 추가 희석의 적절 하 게 표시 LBA Nal30 Kan50 판.
- 37 ° C에 장소 접시 인큐베이터 transposons 피트 니스의 큰 손실이 발생 하는 유전자에 삽입 된 함께 18 헤 클론에 대 한 성장과 플레이트에 표시 하는 시간이 오래 걸릴 수 있습니다. 다양 한 식민지 크기 ( 그림 3) 이어야 한다. 기증자와 받는 사람 부담 접시 그들에 아무 식민지 있어야.
4. 선택 하는 최종 돌연변이 라이브러리에 사용할 라이브러리의 적절 한 희석
- 다양 한 크기의 많은 식민지를 생성 하는 단계 3.9에서 라이브러리의 희석은 적절 하 게 간격을 확인. 목표는 식민지 서로로 병합 및 리소스에 대해 경쟁 한 접시에 가능 하지만 너무 많은 많은 식민지를 얻는 것입니다. 이 번호는 접시 당 약 500-2000 식민지 이어야 한다. 접시에 적절 한 서식 밀도의 예는 그림 3에 표시 됩니다.
- 접시에 식민지의 수를 기록.
- 활용 (conjugants 받는 사람 셀 당 수)의 주파수를 계산합니다. 이것을 1 x 10 -6 19 1 x 10 -4의 범위에 있어야 한다.
- 다운스트림 응용 프로그램에 따라 마지막 라이브러리에서 원하는 돌연변이의 수를 결정 합니다. 많은 사용자는 단순히 가능한 많은 돌연변이와 라이브러리가 필요합니다. 많은 transposon 삽입 이론적으로 가능한 생성 하 (하나의 삽입 모든 기본적인 쌍), 대략적인 목표로ly (즉, 대장균에 대 한 ~4.5 x 10 6) 게놈에 있는 기본적인 쌍으로 식민지의 동일한 수 완전히 모든 가능한 transposon 삽입 된 게놈을 포화. 그것은, 많은 돌연변이 에센셜에 삽입을 은닉 또는 이러한 돌연변이 받는 사람에 게 치명적인 것으로 기능적으로 중요 한 유전자 복구할 수 없게 됩니다.
- 얼마나 많은 양의 초기 라이브러리 원하는 크기의 라이브러리를 만드는 데 필요한 계산 합니다. 예를 들어 원하는 라이브러리 크기는 5 x 10 4 돌연변이입니다. 단계 3.9에서 식민지의 최고의 간격으로 희석은 1시 10분의 200 µ L 희석. 이 접시에 식민지의 수는 약 2000 식민지를 것으로 추정 됩니다. 5 x 10 4 돌연변이 필요 하 고 각 플레이트는 2000 식민지 경우 25 접시가이 희석에 필요 합니다.
5. 최종 돌연변이 도서관의 창조
- 반복 단계 1-3.8 (단계 4.4 참조)을 필요에 따라 단계 1.4에서 격판덮개의 수를 조정.
- 단계에서 3.9, 접시 원하는 크기의 라이브러리를 작성 하는 데 필요한 만큼 접시에 4.1 단계에서 선택 하는 희석 (단계 4.4 참조).
6. 라이브러리 밀도 추정
- 거기 얼마나 많은 식민지는 접시 당 계산 하 고 그로 인하여 얼마나 밀도 도서관은의 대략적인 견적을 얻을. 예: 2 x 10 5 식민지의 총 도금. 대장균 MG1655 게놈은 약 4.5 x 10 6 기본적인 쌍. 따라서, 약 2 × 10 5 라이브러리 삽입 한 삽입 평균 이다 모든 22 기본적인 쌍 그리고 각 유전자 해야 변경 될 약 45 배, 주어진 그 한 유전자는 약 1 × 10 3 기본적인 쌍. 필수 유전자에 삽입이이 라이브러리에서 아주 underrepresented 될 것 이며 따라서 비필수 유전자 밀도 이것 보다 더 큰 될 가능성이 높습니다. 계산의이 종류는 transposon 밀도의 광범위 한 견적 하나를 제공 합니다.
7. Transposon 라이브러리 및 스토리지 풀링
- 식민지, 계산 후 라이브러리 플레이트에 파운드 (또는 더, 필요에 따라)의 1 mL을 추가 하 고 메 마른 분산기를 사용 하 여 접시에서 박테리아를 다쳤어요. 세균 현 탁 액을 제거 하 고 50 mL 또는 15 mL 원뿔 유리병에. 모든 플레이트에 대 한 반복.
- 소용돌이 풀링된 박테리아 서 스 펜 션 전체 분에 대 한 현 탁 액을 균질 하.
- 최종 농도 20%의 살 균 글리세롤 추가.
- 100 x 20 µ L aliquots 0.25 mL 튜브에 쉽게 다시 성장에 대 한 준비.
- 적어도 두 개 이상의 1 mL cryovials에서 aliquot 준비.
- -80 ° C에서 모든 aliquots 저장
Representative Results
18 시간 후 성장, 번호판 식민지 크기의 다양 한 많은 식민지를 포함 한다 (그림 3). 다른 식민지 크기 다양 한 피트 니스의 클론을 나타냅니다 그리고 프로토콜 왔다 좋은 징조. 기증자와 받는 사람 컨트롤 플레이트에 성장이 있어야 합니다. 위의 프로토콜을 사용 하 여 이상의 2 x 105 콜로 니 형성 단위 (CFU) 항복 한다. 한 번에 5 복제 활용형을 프로토콜 확장 약 1 x 106 CFU 항복 한다. 이전 작업에서 다음 세대 시퀀싱을 사용 하 여 분석을 확장된 라이브러리 양보 해야 표시 > 2 x 105 독특한 삽입6. 매우 높은 CFU (즉, 1 x 106 CFU)에서 독특한 삽입의 속도으로 예상 된다 고원, 모든 사용 가능한 (사소한) 삽입 표시 될.
그림 1 : 세균성 활용 및 염색체로 transposon의 삽입의 도식. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : Vortexing 전후 파운드 미디어에서 submersed 필터의 이미지. Vortexing, 전에 셀 필터에 붙어있는 고 언론은 분명 하다. Vortexing, 후 미디어 셀 필터 떨어져와 서 하 고 미디어에 흐린 된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : (A) 후 성장의 18 h transposon 라이브러리의 대표적인 접시. (B) 가까이 식민지 크기의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
여기에 설명 된 프로토콜 밀도 삽입 라이브러리의 건설에 대 한 수 있습니다. 이 메서드는 아래 문화 볼륨6의 5 mL을 사용 하 여 2 x 10 이상의5 독특한 transposon 돌연변이와 transposon 도서관의 창조에 대 한 수 있습니다. 비교적 쉽게 수행 하는, 가장 기본적인 미생물학 실험실에서 사용할 수 있는 시 약을 사용 하 여, 확장 이며 고가의 장비 또는 소모품 electroporation 큐 벳 등의 방법으로 약간을 요구 한다.
이 방법의 중요 한 이점은, 이론적으로, 사용자가 넓은 위도 enterobacterial 받는 사람 종자의 선택에서입니다. 그러나이 종이, 다른 사람 뿐만 아니라11, pJA1 플라스 미드 Shigella flexneri6 와 살 모 넬 라 enterica 다른 enterobacterial 받는 사람 종으로 성공적으로 사용 된 받는 사람 부담으로 대장균 을 사용합니다 serovar Typhimurium 변형 SL134410. 이론적으로, 복제 (오 라R6Kγ) pJA1에서의 γ 기원이 플라스이 미드는 광범위 한 호스트 범위19, 수 있도록 받는 사람 긴장은 유지 될 수 pir +. 최근, 새로운 방법은 설명는 pir + enterobacterial 긴장20, 추가 융통성을 주는 범위에서의 건설을 허용 하는. 또한, pJA1에서 RP4 플라스 미드에서300 자료 쌍 폭도 지역 그램 부정적인 박테리아 긴장19의 광범위에이 플라스 미드의 conjugative 전송을 허용합니다. 간단히 말해서,이 방법은 이론적으로 사용 될 수 다양 한 받는 사람 긴장, 여러 조건으로: 긴장은 pir+, 기증자 스트레인 이외의 대 이외는 항생제 저항으로 표시 됩니다.
프로토콜에 중요 한 단계 단계 4.1에서에서 밖으로 접시를 셀의 적절 한 수를 추정에 놓여 있습니다. 식민지는 너무 밀접 하 게 간격을, 그들은 접시에 양분을 위한 경쟁 하 고 덜 맞는 돌연변이 outcompeted. 이 돌연변이의 총 수에서 감소 될 수 있습니다. 또는 경우 식민지 간격 너무 멀리 떨어져, 접시를 너무 식민지가 될 것입니다 하 고 한 천 배지는 큰 도서관을 달성 하는 데 필요한 총 수 부담이 된다. 따라서, 접시 당 식민지 숫자 측면에서 적절 한 균형을 달성 것이 중요 합니다.
그것은 단계 설명 된 대로 작동 하도록 프로토콜에 나열 된 컨트롤을 수행 해야 합니다. 특히, 기증자 스트레인에 대 한 카운터 선택으로 nalidixic 산을 사용할 때 부정적인 기증자 제어 격판덮개는 식민지의 무료 보장 하는 것이 중요 하다. 이 때문에 낮은 속도 (약 1 x 10-10)21 의 가양성을 생성 하는 nalidixic 산 자연 저항 될 수 있습니다. 일반적으로, 활용 및 전위의 속도가 약 2 x 10-4 19입니다. 따라서, 활용 및 전위의 속도가 몇 배나 nalidixic 산에 자연 저항 속도 보다 큰입니다. 따라서, 진정한 이항 이벤트에 비해 잘못 된 반응의 속도 매우 낮은 프로토콜 작동 될 때 무시할 수 간주. 그러나, 활용 또는 이항의 속도 크게 감소, (에서 낮은 짝짓기 효율 및 IPTG와 transposase 유전자의 감 응 작용의 부족) 및 프로토콜 최대 크기를 조정 하는 경우이 다음 잘못 된 반응의 수에 대 한 보상 (복제 하는 삽입 하는 transposon 하지 않아도) 늘릴 수 있습니다.
일부 수정 단계 3.2 및 3.10에서 보육 시간을 만들 수 있습니다. 3.2 상태 활용 6 h에 대 한 발생 해야 하는 단계 지만 우리의 경험에서는,이 시간 단계 수 (즉, 4-7 h) 결과 크게 변경 하지 않고 다양 한. 또한, 3.10 단계에서 식민지 한 천 배지에서 알을 품는 시간 또한 조정할 수 있습니다. 이 받는 사람 긴장의 시간이 나 성장 속도 두 배로 하는 평균에 따라 변화 될 수 있습니다. 또한, 우리의 경험에 18 h 나왔고 다양 한 식민지 크기, 다양 한 피트 니스의 라이브러리를 나타내는. 그러나, 크게 감소 피트 니스와 식민지 성장 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 및 따라서 보이지 않을 수 있습니다 후 18 h. 이 메서드는 매우 감소 피트 니스의 클론을 찾는 데 사용 되는 경우 더 이상 보육 시간과 적은 식민지 (즉, 48, 50-300 식민지) 크롤 링을 줄이기 위해 접시에 사용할 수 있습니다.
이 방법의 추가 함정 포함 하는 이미 대 한 받는 사람 부담을 사용할 수는 없습니다. PJA1 플라스 미드에이 장애물을 극복 하기 위해 페니 저항 등 대체 선택 가능한 마커 마커 저항 대에 밖으로 스왑 수 있습니다. 그것은 또한 이론적으로, 그것은 암 피 실린 저항 하는 받는 사람 긴장을 사용 하 여, 지적 가치가 있을 수 있습니다, 그리고는 pJA1로 포함 하는 암 피 실린 저항 감 적 플라스 미드 이항 후 손실 됩니다.
선택의 유전 배경에서 조밀한 transposon 도서관의 창조는 많은 다운스트림 응용 프로그램에 대 한 잠재적으로 유리한. 예를 들어 auxotrophic 돌연변이 복제 도금22 를 사용 하 여 식별 하거나 감염1,2에서 결함이 있는 돌연변이 식별 밀도 transposon 라이브러리 사용할 수 있습니다. 더 최근에, DNA 시퀀싱 비용 떨어졌다 고 다음 세대 시퀀싱 등 새로운 기술 되 평범한 transposon 라이브러리 사용 되었습니다 깊은 DNA 시퀀싱과 진 본성, 유전자 기능에 대 한 통찰력을 얻을 수 및 유전 상호 작용입니다. 이러한 방법 중 일부 23 에서 검토 하 고 transposon 감독 삽입 사이트 시퀀싱 (TraDIS), transposon 시퀀싱 (테네시-seq), 높은 처리량 삽입 딥 시퀀싱 (안타), 그리고 삽입 시퀀싱 (추적 방법 포함 INSeq)입니다. 이러한 모든 다운스트림 메서드 밀도 transposon 삽입 라이브러리의 건설에 의존합니다. 다른 특정 다운스트림 방법을 사용 해야 할 수도 있습니다, 하는 동안 여기에 설명 된 프로토콜 따라 현저한 절차 포인트에 대 한 개요를 제공 합니다.
Disclosures
저자는 공개 상관이 있다.
Acknowledgments
PJA1 플라스 미드의 종류 선물에 대 한 조지 교회 연구소 감사합니다. 난 감사 합니다 Fabienne 햄버거와 Urs Jenal 연구소에서 알렉스 Boehm 바젤에서 Biozentrum에 세균성 활용에 대 한 BW20767 긴장을 제공. 나는 또한 도움이 편집에 대 한 올린 Silander 감사합니다. 이 연구에 대 한 자금 스위스 바젤 대학에서 뉴질랜드에서 메시 대학교 시스템 생물학 (프로젝트 "전투 X" 더크 Bumann에 게 수 여) 스위스 이니셔티브에서 기금에 의해 제공 했다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) | Millipore | HAWP02500 | Alternatively blotting paper can be used (listed below) |
| Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper | GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm | 3030-917 | Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above) |
| Metal Forceps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | MURRE009/01 | |
| Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume, 12.5 mL working volume. | Interlab New Zealand | 2303-1090 | |
| Sterile glass spreaders | VWR/Global Science New Zealand | NZNZSPREADER | Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below) |
| Sterile glass beads | VWR/Global Science New Zealand | HERE1080603 | Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above) |
| Nalidixic acid (optional) | GoldBio.com | N-015-250 | |
| Ampicillin sodium salt BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA0839.0025 | prepare according to manufacturer recommendation |
| Kanamycin sulfate BioChemica | VWR/Global Science New Zealand | APLIA1493.0010 | |
| IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) | Thermofisher New Zealand | FMTR0393 | |
| Difco Agar granulated | Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand | 214530 | |
| Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) | Thermofisher | 12795-084 | |
| Glycerol bidistilled 99,5 % | VWR/Global Science New Zealand | VWRC24388.320 | |
| 15 ml polypropelene sterile conical vials | VWR/Global Science New Zealand | CORN430791 | |
| Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable | VWR/Global Science New Zealand | AXYGMCT-175-C | |
| 50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile | VWR/Global Science New Zealand | BDAA352070 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Incubator at 37C | |||
| Autoclave for sterilizing media |
References
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- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
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면역학 문제 127 Transposon mutagenesis transposon 삽입 라이브러리 세균성 돌연변이 라이브러리 세균성 활용 짝짓기 세균성 섹스 Tn10 손실의 기능 돌연변이 enterobacteria 박테리아 대장균 이질균 flexneriErratum
Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018.
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An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.
The second paragraph in the Discussion section was updated from:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
to:
A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.
The References section was updated from:
- Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
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