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Immunology and Infection

Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come Escherichia Coli e Shigella flexneri

Published: September 23, 2017 doi: 10.3791/56216
Automatic Translation
1
1Institute of Natural and Mathematical Sciences, Massey University

ERRATUM NOTICE

Summary

Presentato qui è un metodo semplice per la creazione di una libreria di inserimento ad alta densità trasposone in Escherichia coli o Shigella flexneri mediante coniugazione batterica. Questo protocollo permette la creazione di una collezione di centinaia di migliaia di mutanti unici nei batteri mediante l'inserimento casuale di genomica di un trasposone.

Abstract

Mutagenesi transposon è un metodo che permette la rottura del gene tramite l'inserimento casuale di genomica di un pezzo di DNA chiamato un trasposone. Il protocollo seguito viene delineato un metodo per il trasferimento ad alta efficienza tra ceppi batterici di un plasmide che harboring un trasposone contenente un marcatore di resistenza alla kanamicina. La transposase plasmide-borne è codificato da un gene di variante tnp che inserisce il trasposone il genoma del ceppo destinatario con bassissima distorsione inserzionale. Questo metodo consente quindi la creazione di grandi librerie mutante in cui i trasposoni sono stati inseriti in posizioni uniche genomiche a un destinatario ceppo di batteri o Escherichia coli o Shigella flexneri . Utilizzando coniugazione batterica, al contrario di altri metodi come l'elettroporazione o trasformazione chimica, raccolte di grandi dimensioni con centinaia di migliaia di cloni unici possono essere creati. Questo produce librerie di inserimento ad alta densità, con inserimenti che si verificano come spesso come ogni 4-6 paia di basi in geni non essenziali. Questo metodo è superiore ad altri metodi come permette per un metodo poco costoso, facile da usare e ad alta efficienza per la creazione di una libreria di inserimento trasposone denso. La biblioteca di trasposone può essere utilizzata in applicazioni a valle quali trasposone sequenziamento (Tn-Seq), per dedurre le reti di interazione genetica, o più semplicemente, in mutazionale (avanti genetica) schermi.

Introduction

La creazione di librerie di mutagenesi transposon nei batteri è utile per una vasta gamma di applicazioni, che spaziano dalle scoperte di geni di virulenza in batteri patogeni1,2, agli studi di geni essenziali3, 4 , 5 , 6, per l'identificazione delle interazioni genetiche reti7,8,9. Critica a questi studi è la possibilità di creare una vasta libreria di mutanti. L'uso dei trasposoni (brevi frammenti di DNA che si inserisce in modo casuale in un genoma) è un semplice mezzo di interrompere la funzione del gene, come l'inserimento di un trasposone all'interno del telaio di lettura aperto o regione regolatrice del gene spesso altererà la funzione o l'espressione del gene.

Qui delineato è un metodo per la creazione di una libreria di trasposone in e. coli o S. flexneri di Coniugazione batterica usando il plasmide pJA110. Ci sono due vantaggi principali nell'utilizzo di questo plasmide. Il primo vantaggio è che la variante della transposase Tn10 espresso dal plasmide pJA1 è inducibile e ha inserzione bassa polarizzazione11,12, che significa che il trasposone si integrerà in modo casuale nel genoma quando isopropilico Β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) viene aggiunto ai media. Il trasposone contiene un indicatore di resistenza alla kanamicina, consentendo la selezione di mutanti con gli inserti di trasposoni nel cromosoma del ceppo destinatario. Il secondo vantaggio del plasmide pJA1 è che contiene un R6K mutante origine di replicazione. L'origine di mutanti R6K di replicazione richiede il gene di pir lambda in ordine per la manutenzione del plasmide13. Come il plasmide non può replicare in pir - ceppi, si sarà perso nel ceppo destinatario (Figura 1). Questo assicura che Tn10 transposase viene rimosso dalla cella e non è più attivo, riducendo ulteriormente le mutazioni dopo l'evento iniziale trasposizione.

L'uso di Coniugazione batterica per spostare il plasmide pJA1 dal ceppo donatore al destinatario ceppo è vantaggioso per diversi motivi. Coniugazione è semplice e poco costoso per eseguire e non ha bisogno di attrezzature speciali, come un electroporator. Inoltre, l'elevata efficienza della coniugazione batterica consente una libreria molto grande (> 2 x 105 unico inserimenti) deve essere realizzata con pochi millilitri (mL) di pernottamento coltura batterica6. Il processo richiede circa due ore di hands-on tempo insieme a tempo per l'incubazione e la crescita dei batteri. Langridge et al. 14 riportati esecuzione 130 elettroporazioni per creare una libreria di mutagenesi transposon di dimensioni simili a quello descritto qui8, che si raggiunge con una singola coniugazione. L'uso di 130 elettroporazioni richiede manodopera intensiva e richiede molto tempo preparazione di celle electrocompetent e l'utilizzo di molti materiali costosi (ad es., elettroporazione cuvette), ad un costo di più di $1.000 USD in consumabili da solo. Altri studi10 hanno utilizzato metodi simili, ma con diversi ceppi batterici e raggiunto ben più piccola libreria dimensioni (unità di formazione di Colonia 5 x 104 ) rispetto segnalato qui.

Note sul ceppo donatore: il ceppo di donatore utilizzato qui è il ceppo di e. coli BW2076715 contenenti il plasmide di trasposoni pJA116. Ceppo BW20767 puoi coniugare ad altri ceppi, rendendo il trasferimento del plasmide pJA1 altamente efficiente. Inoltre, cosa importante, BW20767 è lambda pir +. Come accennato in precedenza, il plasmide pJA1 è solo in grado di essere mantenuto in ceppi che contiene il gene di pir di lambda. Questo ceppo è kanamicina e ampicillina resistente. Il plasmide pJA1 contiene il marcatore di resistenza all'ampicillina, e un indicatore di resistenza alla kanamicina è contenuto all'interno del trasposone. Questo ceppo è coltivato con selezione di plasmide utilizzando ampicillina a 100 µ g/mL. È anche la pena notare che altri ceppi che harboring costitutivamente espresso transposase geni sono noti per essere instabile e mentre la transposase usato qui è sotto inducibile di controllo, rimane un basso rischio di espressione che perde. Per questo motivo, è suggerito che il passaggio di questo ceppo deve essere ridotto al minimo e una vena fresca dovrebbe essere preso da una cultura congelata per ogni nuova preparazione di biblioteca. Il ceppo di donatore utilizzato qui è disponibile dal nostro laboratorio su richiesta.

Note sul ceppo destinatario: il ceppo destinatario può essere un ceppo di scelta, come laboratorio K12-derivato ceppi di e. coli o ceppi di S.flexneri (Vedi anche, discussione). Il ceppo destinatario deve avere un indicatore di resistenza antibiotica aggiuntiva che non è resistenza alla kanamicina, in modo che il ceppo di donatore può essere selezionato contro. Per il ceppo destinatario, un ceppo di MG1655 di e. coli è qui utilizzato con una mutazione spontanea introdotto l'acido nalidixico. Il mutante spontaneo l'acido nalidixico è stato selezionato dalla placcatura 2 ml di coltura durante la notte in 200 aliquote µ l sui piatti che contengono l'acido nalidixico 30 µ g/ml. Un singolo clone di MG1655 che era resistente ad acido nalidixico per diventare il destinatario ceppo è stato selezionato. Inoltre, il ceppo destinatario deve essere lambda pir negativo, come descritto in precedenza.

Panoramica: Una volta coniugazione batterica ha avuto luogo e il plasmide pJA1 ha spostato dal ceppo donatore nel ceppo destinatario, l'aggiunta di IPTG ai media inducono l'espressione del gene del tnp , che è sotto il controllo di IPTG-viscoelastico lacIq/Ptac promotore (Figura 1). Il gene di tnp su pJA1 è un mutante transposase che ha una frequenza più bassa di inserimento a hot spot6,10,11. Al momento oltre e induzione con IPTG, il trasposone è attivato e inserito in modo casuale nel genoma. Il plasmide non può essere mantenuto nel ceppo lambda pir-destinatario e viene perso.

Protocol

Attenzione: se si utilizza S. flexneri come un ceppo destinatario, siete pregati di notare che S. flexneri è un patogeno umano che possa causare malattie gastrointestinali. Gli esperimenti che coinvolgono S. flexneri devono essere eseguiti con biosicurezza adeguate precauzioni (designate BSL-2 in Europa e Stati Uniti d'America o PC2 in Nuova Zelanda). Tutti gli esperimenti condotti in video associato a questo protocollo sono stati fatti utilizzando il ceppo destinatario ben caratterizzato non patogeni di e. coli MG1655 in un ambiente di PC1. Lavoro con Shigella flexneri precedentemente è stato effettuato in un laboratorio BSL-2 presso il Biozentrum a Basilea, come descritto nel 6.

Nota: il seguente esperimento è fatto in modo efficace due volte. La prima parte (passo 1.1 - passo 4,5) viene eseguita per trovare la migliore diluizione per placcatura fuori la biblioteca, dove l'obiettivo è quello di trovare una diluizione della coniugazione che dà molte diverse colonie per piastra, ma non così tanti che forma un prato. Si tratta di ridurre la concorrenza tra mutanti con significativamente ridotta fitness e quelli con fitness più robusto. La seconda parte (passaggi 5.1-7,4) è la creazione della biblioteca finale, dove molti piatti sono disseminate della diluizione appropriata della biblioteca.

1. a preparare un giorno prima dell'esperimento

  1. inoculare, da un'azione congelate, il ceppo di donatore in 2 mL di brodo LB, Millers ricetta (NaCl a 10 g/L) che contenevano ampicillina a 100 µ g/mL. Il ceppo di donatore utilizzato qui è il ceppo di e. coli BW20767 15 che harboring il plasmide pJA1 11. L'uso di ampicillina mantiene la selezione per il plasmide pJA1.
  2. Inoculare, da una singola Colonia o azione congelate, il ceppo destinatario in 2 mL di LB media con un indicatore di resistenza diverso da ampicillina o kanamicina. Il destinatario ceppo usato qui è l' Escherichia coli " wild-type " ceppo MG1655 17 , 18 con un mutante di resistenza spontanea all'acido nalidixico. È cresciuto a 30 µ g/mL di acido nalidixico.
  3. Piastre di agar di 1,5% contenenti brodo di Luria 20 preparare (in piatti di petri di 90 mM, circa 12,5 mL). Piastre di agar carente antibiotico possono depositare a 4 ° C per diversi mesi fino all'uso.
  4. Piastre di agar di 1,5% contenenti brodo di Luria 20 preparare (in piatti di petri di 90 mM, circa 12,5 mL) contenente sia l'acido nalidixico 30 µ g/ml e kanamicina a 50 µ g/mL (LBA Nal30 Kan50). Piastre di agar contenente antibiotici possono essere memorizzati al buio a 4 ° C per diversi mesi fino all'uso.
  5. Preparare 200 mL di terreno LB sterile. LB media può essere conservato a temperatura ambiente per diversi mesi.
  6. Preparare 1 mL di 100mm brodo sterile di IPTG, secondo produttore ' istruzioni s.

2. Accoppiamento o coniugazione batterica

  1. centrifuga 1 mL di coltura durante la notte del ceppo donatore per 1 minuto a 14.000 x g a temperatura ambiente. Gettare il terreno di crescita. Questo passaggio viene eseguito per rimuovere tutti i supporti di crescita contenenti antibiotici.
  2. Risospendere il pellet cellulare in 110 µ l di LB (non contenenti antibiotici), concentrando così la cultura.
  3. Usando pinze sterili, posizionare un filtro sterile nitrocellulosa (in alternativa un sterile pezzo di carta assorbente può essere utilizzato, vedere materiali elenco) in mezzo di una piastra LBA (non contenenti antibiotici). La targhetta di etichettatura " controllo negativo: donatore ".
  4. Utilizzando una pipetta, goccia 50 µ l della cultura donatore concentrato sul filtro.
  5. Ripetere i punti 2.1-4 per il ceppo destinatario, etichettatura la piastra " controllo negativo: destinatario. "
  6. Per la biblioteca, goccia 50 µ l del donatore (dal punto 2.2) e 50 µ l del ceppo destinatario (dal punto 2.5) su un singolo filtro sterile su una piastra di LBA (queste piastre non devono contenere antibiotici). Questa targhetta di etichettatura " biblioteca. " accoppiamento si verifica perché il donatore e il ricevente sono a stretto contatto fisico sul filtro.
  7. Posizionare le piastre di agar che contiene i filtri a 37 ° C per 6 h.

3. Attivazione del trasposone pJA1 di IPTG induzione della Transposase

  1. preparare tre fiale conici di 15 mL contenente 2 mL di LB con IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM (cioè, 20 µ l di stock di 100 mM di IPTG). Ciascuna etichetta: controllo del donatore, controllo del destinatario e biblioteca.
  2. Rimuovere le piastre dall'incubatrice dopo 6 h di crescita a 37 ° C (dal punto 2.4). Alcuni la crescita batterica deve essere visibile sul filtro.
  3. Usando pinze sterili, rimuovere il filtro di carta dal controllo dei donatori e inserirlo nel flaconcino da 15 mL conica contrassegnata come donatore controllo (dal punto 3.1). Fare lo stesso per il controllo del destinatario e la biblioteca.
  4. Toccare i tubi per ottenere la carta da filtro sul fondo del flaconcino conico da 15 mL e garantire che esso sia completamente sommersa in lb.
  5. Vortex le provette per almeno un minuto in alto per dissociare i batteri del filtro di nitrocellulosa. Il LB dovrebbe diventare torbida con cellule batteriche ( Figura 2).
  6. Con perle di vetro sterile o una spatola sterile, piastra 200 µ l della sospensione di batteri agitati con vortex dal controllo dei donatori sulle piastre di LBA Nal30 Kan50 con l'etichetta " controllo del donatore, 200 µ l ".
  7. Ripetere il passaggio precedente (3.6) per il controllo destinatario, le piastre di etichettatura " controllo destinatario, 200 µ l ".
  8. Ripetere il passaggio precedente (3,7) per la biblioteca, le piastre di etichettatura " biblioteca, 200 µ l ".
  9. Effettuare ulteriori diluizioni (cioè, 1:5, diluizioni 01:10 e 1: 100, mediante LB non contenenti antibiotici come diluente) della libreria. Piastra di 200 µ l di libreria non diluito e ulteriori diluizioni su opportunamente etichettato piastre LBA Nal30 Kan50.
    10. Incubatore
  10. piastre posto in 37 ° C per 18 h. cloni con trasposoni inserita in un gene che causa una grande perdita di idoneità potrebbe richiedere più tempo per crescere e compaiono sulla lastra. Ci dovrebbe essere una varietà di formati di Colonia ( Figura 3). Donatore e destinatario ceppo piastre non dovrebbero avere nessuna colonie su di loro.

4. Scegliere la diluizione appropriata della libreria che deve essere utilizzato per la raccolta finale di mutante

  1. determinare una diluizione della biblioteca da 3,9 di passaggio che produce molte colonie di varie dimensioni che sono adeguatamente distanziati. L'obiettivo è quello di ottenere colonie come molti come possibile su una piastra, ma non così tanti che le colonie si fondono uno in altro e si contendono le risorse. Questo numero deve essere di circa 500-2.000 colonie per piastra. Nella Figura 3 è riportato un esempio delle densità di Colonia appropriato su una zolla.
  2. Registrare il numero di colonie sulle piastre.
  3. Calcolare la frequenza di coniugazione (il numero di conjugants a cellula ricevente). Questo dovrebbe essere nella gamma di 1 x 10 -4 a 1 x 10 -6 19.
  4. Determinare il numero di mutanti desiderato nella raccolta finale basato su applicazioni a valle. Molti utenti richiedono semplicemente una libreria con i mutanti come molti come possibile. Per generare come molti inserimenti trasposone come teoricamente possibili (un inserimento ogni coppia di basi), obiettivo per approssimativoly lo stesso numero di colonie come coppie di basi nel genoma (cioè, ~4.5 x 10 6 per e. coli) completamente per saturare il genoma con tutti gli inserimenti possibili trasposoni. È importante notare che molti mutanti che harboring gli inserimenti in essenziale o funzionalmente importanti geni non sarà in grado di essere recuperati, come queste mutazioni sarà fatale per il destinatario.
  5. Calcolare quanto volume della libreria iniziale è necessaria per creare una biblioteca della dimensione desiderata. Ad esempio, la dimensione desiderata biblioteca è 5 x 10 4 mutanti. La diluizione con la migliore spaziatura delle colonie da 3,9 passo era 200 µ l di un 01:10 diluizione. Il numero di colonie su questa piastra è stimato essere circa 2.000 colonie. Se sono necessari 5 x 10 4 mutanti e ogni piatto ha 2.000 colonie, quindi 25 piastre saranno necessarie a questa diluizione.

5. Creazione della biblioteca mutante finale

  1. ripetere i passaggi 1 a 3,8, regolazione del numero di piastre a passo 1.4 come necessario (vedere il punto 4.4).
  2. Al punto 3.9, piastra la diluizione scelta nel passaggio 4.1 su come molti piatti come necessario per creare la libreria della dimensione desiderata (Vedi punto 4.4).

6. Stima della densità di libreria

  1. contare quante colonie ci sono per piastra e quindi ottenere una stima approssimativa di quanto densa la libreria è. Ad esempio: un totale di 2 x 10 5 colonie sono placcati. Il genoma di MG1655 di e. coli è circa 4,5 x 10 6 paia di basi. Di conseguenza, una biblioteca con circa 2 x 10 5 inserti significa che c'è un inserto in media ogni 22 paia di basi e che ogni gene dovrebbe essere mutato circa 45 volte, dato che un gene è circa 1 x 10 3 paia di basi. Inserimenti in geni essenziali sono suscettibili di essere molto sottorappresentati in questa libreria, e così la densità nei geni non essenziali rischia di essere superiore a questo. Questa sorta di calcolo fornisce uno con un'ampia stima della densità di trasposoni.

7. Pool di trasposone biblioteca e deposito

  1. dopo il conteggio colonie, aggiungere 1 mL di LB (o più, se necessario) alla piastra di biblioteca e usare una spatola sterile per grattare via i batteri dalla piastra. Rimuovere la sospensione batterica e posto in un flaconcino da 50 mL o 15 mL conico. Ripetere per tutte le piastre.
  2. Vortex la sospensione di batteri riuniti per un minuto per omogeneizzare la sospensione.
  3. Aggiungere glicerolo sterile ad una concentrazione finale del 20%.
    1. Preparare aliquote di µ l 100 x 20 in provette da 0,25 mL per facile ri-crescita.
    2. Preparare almeno due o più 1ml aliquotare in cryovials.
  4. Conservare tutte le aliquote a -80 ° C

Representative Results

Dopo 18 ore di crescita, piastre devono contenere molte colonie con una varietà di formati di Colonia (Figura 3). Colonia diverse dimensioni indicano cloni di fitness diversi e sono un buon segno che il protocollo ha lavorato. I controlli del donatore e del ricevente non dovrebbero avere nessuna crescita sulle piastre. Utilizzando il protocollo di cui sopra dovrebbe produrre oltre 2 x 105 unità formanti colonie (CFU). Scalabilità in una sola volta il protocollo a cinque coniugazioni replicare dovrebbe produrre circa 1 x 106 CFU. Nel precedente lavoro, analisi mediante sequenziamento di nuova generazione ha indicato che tale libreria scalabilità deve cedere > 2 x 105 inserimenti unico6. A molto alta CFU (cioè, 1 x 106 CFU) il tasso di inserimenti unici dovrebbe al plateau, come tutti gli inserimenti (non irreversibile) disponibili diventano rappresentati.

Figure 1
Figura 1 : Schematico di Coniugazione batterica e inserimento di trasposoni nel cromosoma. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 : Immagine di filtri sommersi LB Media prima e dopo nel Vortex. Prima nel Vortex, le cellule sono bloccate al filtro e i media è chiaro. Dopo Vortex, media diventa torbida come cellule sono venuti fuori il filtro e sono nella media. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 : (A) piastra rappresentante della libreria trasposone dopo 18 ore di crescita. (B) primi piani di dimensioni di Colonia. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Discussion

Il protocollo descritto qui consente la costruzione di una libreria di inserimento denso. Questo metodo consente la creazione di una libreria di trasposone con oltre 2 x 105 mutanti di trasposone unico utilizzando sotto 5 mL di coltura volume6. Esso è relativamente facile da effettuare, utilizza reagenti disponibili nei laboratori di microbiologia più elementari, è scalabile e richiede poco in termini di costose attrezzature o materiali di consumo quali cuvette di elettroporazione.

Un vantaggio significativo di questo metodo è che, in teoria, l'utente ha ampia latitudine nella scelta del destinatari enterobacterial ceppi. Questa carta, così come altri11, utilizzare e. coli come un ceppo destinatario, tuttavia il plasmide pJA1 è stato utilizzato con successo con altre specie enterobacterial destinatario come Shigella flexneri6 e Salmonella enterica sierotipo Typhimurium ceppo SL134410. Teoricamente, l'origine γ di replicazione (oriR6Kγ) in pJA1 consente questo plasmide essere mantenuta in un host vasta gamma19, permettendo che il ceppo destinatario è pir +. Recentemente, sono stati descritti nuovi metodi che consentono per la costruzione del pir + in una gamma di ceppi enterobacterial20, dando ulteriore flessibilità. Inoltre, la regione di300 paia di basi mob dal plasmide RP4 in pJA1 consente il trasferimento coniugativi di questo plasmide ad una vasta gamma di gram negativi ceppi batterici19. In poche parole, questo metodo potrebbe teoricamente essere utilizzato con una varietà di ceppi di destinatario, purché siano soddisfatte diverse condizioni: il ceppo è pir+ ed è contrassegnato con una resistenza agli antibiotici diversi da kanamicina e diverso dal ceppo di donatore.

Un passo fondamentale nel protocollo si trova nello stimare il numero corretto di celle a piastre fuori al punto 4.1. Se colonie sono spaziate troppo da vicino, si trovano a competere per i nutrienti sulla piastra e meno forma mutanti sono outcompeted. Questo può portare a una riduzione del numero totale di mutanti. In alternativa, se le colonie sono distanziati troppo distanti, ci saranno anche alcune colonie sulla piastra, e il numero totale di piastre di agar necessari per realizzare una grande biblioteca diventa oneroso. Pertanto, il raggiungimento del giusto equilibrio in termini di numeri di Colonia per ciascuna piastra è importante.

È importante eseguire i controlli elencati nel protocollo per garantire che i passaggi sono funziona come descritto. In particolare, quando si utilizza l'acido nalidixico come una Counter-selezione contro il ceppo di donatore, è importante garantire che le piastre di controllo negativo donatore sono liberi delle colonie. Questo è perché non ci può essere un tasso basso (circa 1 x 10-10)21 di resistenza spontanea all'acido nalidixico, producendo falsi positivi. In genere, il tasso di Coniugazione e la trasposizione è circa 2 x 10-4 19. Di conseguenza, il tasso di Coniugazione e la trasposizione è diversi ordini di grandezza maggiori rispetto al tasso di resistenza spontanea all'acido nalidixico. Di conseguenza, il tasso di falsi positivi rispetto agli eventi di vera trasposizione è molto basso e ritenuto trascurabile quando il protocollo sta lavorando. Tuttavia, se i tassi di coniugazione o trasposizione sono significativamente ridotti, (da bassa efficienza di accoppiamento e/o mancanza di induzione del gene transposase con IPTG) e il protocollo è scalato per compensare questo, allora il numero di falsi positivi (cloni che non hanno il trasposone inserito) può anche aumentare.

Possono essere apportate alcune modifiche ai tempi di incubazione in passaggi 3.2 e 3.10. Passaggio 3,2 Stati che coniugazione dovrebbe verificarsi per 6 h, ma nella nostra esperienza, questo passaggio di tempo può essere variato (cioè, 4-7 h) senza modificare significativamente i risultati. Inoltre, nel passaggio 3.10, il periodo di tempo che le colonie sono incubate sulle piastre di agar può anche essere regolato. Questo può essere variato a seconda della media raddoppiare il tasso di tempo o crescita del ceppo destinatario. Inoltre, nella nostra esperienza, 18 h ha prodotto una varietà di formati di Colonia, che indica una raccolta di diversi fitness. Tuttavia, colonie con notevolmente ridotta fitness potrebbero richiedere più tempo a crescere e così potrebbero non essere visibile dopo 18 h. Se questo metodo è utilizzato per trovare i cloni di fitness estremamente ridotti, tempi di incubazione più lunghi e meno colonie sul piatto per ridurre l'affollamento (cioè, 48h, 50-300 colonie) possono essere utilizzati.

Ulteriori insidie di questo metodo sono che non è possibile utilizzare un ceppo destinatario che è già resistente alla kanamicina. È possibile scambiare il marcatore di resistenza alla kanamicina nel plasmide pJA1 per un marcatore selezionabile alternativo, come la resistenza al cloramfenicolo per superare questo ostacolo. Può anche essere la pena di notare che, in teoria, è possibile utilizzare un destinatario ceppo che è resistente all'ampicillina, come il pJA1 plasmide contenente l'indicatore di resistenza all'ampicillina è perso poco dopo trasposizione.

La creazione di una libreria di trasposone denso in background genetico di scelta è potenzialmente vantaggiosa per molte applicazioni a valle. Ad esempio, una libreria di trasposone denso può essere utilizzata per identificare i mutanti auxotrofi utilizzando replica plating22 o identificare mutanti che sono difettosi nella creazione di un'infezione1,2. Più recentemente, come i costi del sequenziamento del DNA sono scesi e nuove tecnologie come il sequenziamento di nuova generazione sono diventati banale, librerie di trasposoni sono state utilizzate con sequenziamento DNA profondo per comprendere essenzialità di gene, funzione del gene e genetica interazioni farmacologiche. Alcuni di questi metodi sono esaminati in 23 e includono metodi come sequenza di inserimento diretto trasposone sito (TraDIS), sequenziamento trasposone (Tn-seq), inserimento di alto-rendimento rilevamento di sequenziamento profondo (HITS) e sequenziamento di inserimento ( INSeq). Tutti questi metodi a valle si affidano la costruzione di librerie di inserzione del trasposone denso. Mentre altri vettori potrebbero essere necessario impiegare metodi particolari a valle, il protocollo descritto qui dà una panoramica dei punti salienti procedurali da seguire.

Disclosures

L'autore non ha nulla di divulgare.

Acknowledgments

Grazie al laboratorio di Chiesa del George per il gentile dono del plasmide pJA1. Ringrazio Fabienne Hamburger e Alex Boehm dal laboratorio Jenal Urs presso il Biozentrum a Basilea per aiuto con coniugazione batterica e per fornire il ceppo BW20767. Ringrazio anche Olin Silander per modifiche utili. Finanziamenti per questa ricerca è stato fornito dai fondi da Massey University in Nuova Zelanda e l'iniziativa Svizzera in Systems Biology (progetto "Battaglia X" assegnato a Dirk Bumann) presso l'Università di Basilea, Svizzera.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.45 micron nitrocellulose filters (sterile) Millipore HAWP02500 Alternatively blotting paper can be used (listed below)
Blotting paper cut into ~ 1 inch circles, then autoclave/sterilized in foil. There is no difference in efficiency between the nitrocellulose filters or blotting paper GE life Sciences: product Grade 3MM Chr Blotting Paper, sheet, 46 × 57 cm 3030-917 Alternatively nitrocellose filters can be used (listed above)
Metal Forceps, sterile VWR/Global Science New Zealand MURRE009/01
Petri dishes, sterile, 90 mm diameter, 68 mL volume,  12.5 mL working volume. Interlab New Zealand 2303-1090
Sterile glass spreaders VWR/Global Science New Zealand NZNZSPREADER Alternatively sterile glass beads can be used for spreading culture onto plates (listed below)
Sterile glass beads VWR/Global Science New Zealand HERE1080603 Alternatively a sterile glass spreader can be used for spreading culture onto plates (listed above)
Nalidixic acid (optional) GoldBio.com N-015-250
Ampicillin sodium salt BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA0839.0025 prepare according to manufacturer recommendation
Kanamycin sulfate BioChemica VWR/Global Science New Zealand APLIA1493.0010
IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)  Thermofisher New Zealand FMTR0393
Difco Agar granulated Fort Richard Laboratries/Interlab New Zealand 214530
Luria Broth Base (Miller's LB Broth Base) Thermofisher 12795-084
Glycerol bidistilled 99,5 % VWR/Global Science New Zealand VWRC24388.320
15 ml polypropelene sterile conical vials  VWR/Global Science New Zealand CORN430791
Microcentrifuge tubes, flat cap, 1.7ml, Ultra-clear PP, graduated, autoclavable and freezable VWR/Global Science New Zealand AXYGMCT-175-C
50ml Centrifuge tubes, Falcon, PP, conical, printed graduation, with flat screw caps, sterile VWR/Global Science New Zealand BDAA352070
Name Company Catalog Number Comments
Equipment
Incubator at 37C
Autoclave for sterilizing media 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Camacho, L. R., Ensergueix, D., Perez, E., Gicquel, B., Guilhot, C. Identification of a virulence gene cluster of Mycobacterium tuberculosis by signature-tagged transposon mutagenesis. Mol Microbiol. 34 (2), 257-267 (1999).
  2. Hensel, M., Shea, J. E., Gleeson, C., Jones, M. D., Dalton, E., Holden, D. W. Simultaneous identification of bacterial virulence genes by negative selection. Science. 269 (5222), 400-403 (1995).
  3. Glass, J. I., Assad-Garcia, N., et al. Essential genes of a minimal bacterium. PNAS. 103 (2), 425-430 (2006).
  4. Salama, N. R., Shepherd, B., Falkow, S. Global transposon mutagenesis and essential gene analysis of Helicobacter pylori. J Bacteriol. 186 (23), 7926-7935 (2004).
  5. Akerley, B. J., Rubin, E. J., Camilli, A., Lampe, D. J., Robertson, H. M., Mekalanos, J. J. Systematic identification of essential genes by in vitro mariner mutagenesis. PNAS. 95 (15), 8927-8932 (1998).
  6. Freed, N. E., Bumann, D., Silander, O. K. Combining Shigella Tn-seq data with gold-standard E. coli gene deletion data suggests rare transitions between essential and non-essential gene functionality. BMC Microbiology. 16 (1), 1-14 (2016).
  7. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nature Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  8. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  9. Gawronski, J. D., Wong, S. M. S., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. PNAS. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  10. Chan, K., Kim, C. C., Falkow, S. Microarray-based detection of Salmonella enterica serovar Typhimurium transposon mutants that cannot survive in macrophages and mice. Infect and Immun. 73 (9), 5438-5449 (2005).
  11. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  12. Bender, J., Kleckner, N. IS10 transposase mutations that specifically alter target site recognition. The EMBO Journal. 11 (2), 741-750 (1992).
  13. Shafferman, A., Helinski, D. R. Structural properties of the beta origin of replication of plasmid R6K. J Biol Chem. 258 (7), 4083-4090 (1983).
  14. Langridge, G. C., Phan, M. D., et al. Simultaneous assay of every Salmonella Typhi gene using one million transposon mutants. Genome Research. 19 (12), 2308-2316 (2009).
  15. Metcalf, W. W., Jiang, W., Daniels, L. L., Kim, S. K., Haldimann, A., Wanner, B. L. Conditionally replicative and conjugative plasmids carrying lacZ alpha for cloning, mutagenesis, and allele replacement in bacteria. Plasmid. 35 (1), 1-13 (1996).
  16. Badarinarayana, V., Estep, P. W., et al. Selection analyses of insertional mutants using subgenic-resolution arrays. Nature biotechnol. 19 (11), 1060-1065 (2001).
  17. Guyer, M. S., Reed, R. R., Steitz, J. A., Low, K. B. Identification of a Sex-factor-affinity Site in E. coli as γδ. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 45 (0), 135-140 (1981).
  18. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  19. Alexeyev, M. F., Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  20. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  21. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  22. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  23. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri
Posted by JoVE Editors on 05/20/2018. Citeable Link.

An erratum was issued for: Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. The Discussion and References sections have been corrected.

The second paragraph in the Discussion section was updated from:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir+. Recently, new methods have been described that allow for construction of the pir+ in a range of enterobacterial strains20, giving additional flexibility. Additionally, the300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir+, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

to:

A significant benefit of this method is that, in theory, the user has wide latitude in the choice of enterobacterial recipient strains. This paper, as well as others11, use E. coli as a recipient strain, however the pJA1 plasmid has been used successfully with other enterobacterial recipient species such as Shigella flexneri6 and Salmonella enterica serovar Typhimurium strain SL134410. Theoretically, the γ origin of replication (oriR6Kγ) in pJA1 allows this plasmid to be maintained in a broad host range19, allowing that the recipient strain is pir-. The 300 base pair mob region from the RP4 plasmid in pJA1 allows conjugative transfer of this plasmid to a wide range of gram negative bacterial strains19. Simply put, this method could theoretically be used with a variety of recipient strains, as long as several conditions are met: the strain is pir-, and is marked with an antibiotic resistance other than kanamycin and other than the donor strain.

The References section was updated from:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Kvitko, B. H., Bruckbauer, S., et al. A simple method for construction of pir+ Enterobacterial hosts for maintenance of R6K replicon plasmids. BMC Res Notes. 5 (1), 157 (2012).
  4. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  5. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  6. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).

to:

  1. Blattner, F. R., Plunkett, G., et al. The Complete Genome Sequence of Escherichia coli K-12. Science. 277 (5331), 1453-1462 (1997).
  2. Alexeyev, M. F., & Shokolenko, I. N. Mini-Tn10 transposon derivatives for insertion mutagenesis and gene delivery into the chromosome of gram-negative bacteria. Gene. 160 (1), 59-62 (1995).
  3. Barrick, J. E., Yu, D. S., et al. Genome evolution and adaptation in a long-term experiment with Escherichia coli. Nature. 461 (7268), 1243-1247 (2009).
  4. Jacobs, M. A., Alwood, A., et al. Comprehensive transposon mutant library of Pseudomonas aeruginosa. PNAS. 100 (24), 14339-14344 (2003).
  5. van Opijnen, T., & Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nature Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
Creazione di una densa trasposone inserimento Biblioteca mediante coniugazione batterica Enterobacterial ceppi come<em> Escherichia Coli</em> e <em>Shigella flexneri</em>
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Freed, N. E. Creation of a Dense… More

Freed, N. E. Creation of a Dense Transposon Insertion Library Using Bacterial Conjugation in Enterobacterial Strains Such As Escherichia Coli or Shigella flexneri. J. Vis. Exp. (127), e56216, doi:10.3791/56216 (2017).

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