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Genetics

खमीर के दौरान समय के साथ mRNA स्तरों को मापने एस. cerevisiae Hypoxic प्रतिसाद

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/56226
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Summary

यहां, हम एक आरएनए-seq का उपयोग करते हुए समय के साथ mRNA स्तरों की निगरानी के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं जो S. cerevisiae कोशिकाओं की hypoxic प्रतिक्रिया के दौरान. इस विधि के लिए किसी भी सेलुलर प्रतिक्रिया के दौरान जीन अभिव्यक्ति का विश्लेषण अनुकूलित किया जा सकता है ।

Abstract

जीन अभिव्यक्ति में जटिल परिवर्तन आम तौर पर एक सेलुलर प्रतिक्रिया के एक बड़े हिस्से मध्यस्थता । प्रत्येक जीन अद्वितीय कैनेटीक्स के साथ अभिव्यक्ति बदल सकता है के रूप में जीन कई उत्तेजनाओं में से एक के विशेष समय से विनियमित है, रास्ते या माध्यमिक प्रभाव संकेतन । खमीर एस cerevisiaeमें हाइपोक्सिया के लिए पूरे जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया पर कब्जा करने के लिए, आरएनए-seq विश्लेषण हाइपोक्सिया करने के लिए जोखिम के बाद विशिष्ट समय में सभी जीनों के mRNA स्तरों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया था । हाइपोक्सिया में बढ़ रही कोशिकाओं द्वारा स्थापित किया गया था ~ १००% N2 गैस । महत्वपूर्ण बात, अंय hypoxic अध्ययन के विपरीत, ergosterol और unसंतृप्त फैटी एसिड मीडिया के लिए नहीं जोड़ा गया है क्योंकि इन चयापचयों जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित । समय अंक हाइपोक्सिया के बाद 0-4 ज की सीमा में चुना गया क्योंकि उस अवधि जीन अभिव्यक्ति में बड़े बदलाव को दर्शाता है । हर समय बिंदु पर, मध्य लॉग hypoxic कोशिकाओं को जल्दी से फ़िल्टर और जमे हुए थे, के लिए जोखिम सीमित हे2 और जीन अभिव्यक्ति में सहवर्ती परिवर्तन । कुल आरएनए कोशिकाओं से निकाला गया था और mRNA, जो तब सीडीएनए में परिवर्तित किया गया था के लिए समृद्ध करने के लिए इस्तेमाल किया । इस सीडीएनए से मल्टीप्लेक्स पुस्तकालयों को बनाया गया और एक अगली पीढ़ी के sequencer के एक लेन में आठ या अधिक नमूनों का अनुक्रम किया गया । एक के बाद अनुक्रमण पाइपलाइन का वर्णन किया है, जो गुणवत्ता के आधार trimming, पढ़ने के मानचित्रण और जीन प्रति पढ़ता की संख्या का निर्धारण भी शामिल है । आर सांख्यिकीय वातावरण के भीतर DESeq2 जीन है कि hypoxic समय अंक में से किसी एक में काफी परिवर्तन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । तीन जैविक प्रतिकृति के विश्लेषण से पता चला उच्च reproducibility, भिंन कैनेटीक्स के जीन और उंमीद की एक बड़ी संख्या हे2-विनियमित जीन । इन तरीकों का अध्ययन कैसे विभिंन जीवों की कोशिकाओं को समय पर हाइपोक्सिया जवाब और अंय सेलुलर प्रतिक्रियाओं के दौरान जीन अभिव्यक्ति के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।

Introduction

कई जीवों हाइपोक्सिया, या कम ओ2का जवाब, जीन अभिव्यक्ति 1,2,3बदलकर । इस प्रतिक्रिया में मदद करता है एक एरोबिक श्वसन के लिए महत्वपूर्ण सब्सट्रेट की कमी से निपटने के लिए और कई कृत्रिम प्रतिक्रियाओं के लिए, लेकिन यह भी एक बदलते redox राज्य के साथ 4। कई microarray अध्ययन एस cerevisiae में प्रदर्शन किया है कि जीन के सैकड़ों के mRNA स्तर हाइपोक्सिया के जवाब में बदलने के लिए 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. हाल ही में, आरएनए-seq हाइपोक्सिया 13के दौरान समय के साथ जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन की विशेषता के लिए इस्तेमाल किया गया था । यहां प्रायोगिक विवरण प्रस्तुत किया और चर्चा की ।

हाइपोक्सिया विभिंन तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है, प्रत्येक ओ2का एक अलग स्तर के उत्पादन । यहां, हाइपोक्सिया लगातार प्रवाह अल्ट्रा उच्च शुद्धता2 कुप्पी में, जो कम करती है [हे2] प्रतिलिपि कैनेटीक्स 10के साथ तुरंत भंग द्वारा स्थापित किया गया था । यह संभव है कि वहां कुछ हे2 अणुओं वर्तमान कि चयापचय और जीन अभिव्यक्ति में योगदान कर रहे हैं, लेकिन इस वातावरण anaerobic के बहुत करीब माना जाता है । ओ2के अभाव में, खमीर कोशिकाओं षयवस्तु, ergosterol और unसंतृप्त फैटी एसिड 4,12,14के संश्लेषित नहीं कर सकते । इस प्रकार, पिछले अध्ययनों इन चयापचयों जब ऑक्सीजन 5,10,15के बिना खमीर बढ़ शामिल है । हालांकि, कई hypoxic प्रतिक्रियाओं इन चयापचयों की कमी से मध्यस्थता कर रहे हैं और इस तरह उन्हें भरपाई hypoxic जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रियाओं 12,16रिवर्स. प्राकृतिक हाइपोक्सिया की नकल करने के लिए इन चयापचयों को मीडिया से नहीं जोड़ा गया । कम समय में है कि कोशिकाओं को इन आवश्यक चयापचयों की उपस्थिति के बिना हाइपोक्सिया के संपर्क में थे, वहां सेल मौत में कोई उल्लेखनीय वृद्धि (नहीं दिखाया गया डेटा) और न ही एक लंबे समय तक तनाव की प्रतिक्रिया 13।

प्रतिक्रिया भी तनाव और उसके जीनोटाइप पर निर्भर है । विशेष रूप से महत्वपूर्ण hypoxic प्रतिक्रियाएं 2के ज्ञात नियामकों के alleles हैं । S288C तनाव पृष्ठभूमि अत्यधिक वांछित है ताकि परिणाम अंय जीनोमिक इस तनाव के साथ प्रदर्शन के अध्ययन की तुलना में किया जा सकता है । हालांकि, S288C HAP1 जीन 17, hypoxic प्रतिक्रिया के लिए एक transcriptional नियामक महत्वपूर्ण की एक आंशिक नुकसान-समारोह एलील शामिल हैं । इस एलील की मरंमत S288C में Σ1278b तनाव पृष्ठभूमि 11से एक wildtype प्रतिलिपि का उपयोग कर रहा था ।

जीन अभिव्यक्ति सेलुलर पर्यावरण पर अत्यधिक निर्भर है । इस प्रकार, जब जीनोम चौड़ा mRNA विश्लेषण प्रदर्शन, यह एक निरंतर वातावरण बनाए रखने के समय, उत्तेजना, या जीनोटाइप जैसे एक और पैरामीटर बदलती महत्वपूर्ण है । अत्यधिक प्रतिलिपि परिणाम प्राप्त करने के लिए, अध्ययन के लिए इन तीन पद्धतियों पर विचार करें और उसके सभी जैविक या तकनीकी प्रतिकृति । सबसे पहले, एक ही प्रयोगकर्ता (ओं) को बाहर का अध्ययन करना चाहिए, क्योंकि तकनीकी प्रथाओं प्रयोगकर्ता भर में भिंन हो सकते हैं । दूसरा, सामग्री के एक ही बैच के विकास के मीडिया में इस्तेमाल किया जाना चाहिए के रूप में प्रत्येक बैच एक अलग संरचना है कि जीन अभिव्यक्ति को प्रभावित कर सकते है । तीसरा, सेल चक्र प्रभाव को कम करने के लिए, प्रत्येक समय बिंदु विकास के मध्य लॉग चरण में अतुल्यकालिक कोशिकाओं से मिलकर होना चाहिए (1-2 x10 7 कोशिकाओं/एमएल) ।

जब निस्र्पक हाइपोक्सिया को जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया की तरह एक जटिल प्रतिक्रिया, एक समय पाठ्यक्रम विभिंन घटनाओं के कैनेटीक्स निर्धारित करने के लिए लाभप्रद है । विशिष्ट समय अंक चुना जाना चाहिए कि प्रतिक्रिया के प्रमुख परिवर्तन पर कब्जा होगा । इस अध्ययन में, 0 और 4 एच के बीच समय अंक मनाया गया, क्योंकि पिछले प्रयोगों से इस अवधि के दौरान जीन अभिव्यक्ति में व्यापक बदलाव का पता चला 13.

वैश्विक जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए, आरएनए-seq 18,19इस्तेमाल किया गया था । इस विधि का उपयोग करता है अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रत्येक जीन की प्रतिलिपि के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करने के लिए । डीएनए microarray विश्लेषण की तुलना में, आरएनए-seq उच्च संवेदनशीलता दर्शाती है (कम प्रचुर मात्रा में टेप का पता लगाने के लिए), एक अधिक से अधिक गतिशील रेंज (अधिक गुना परिवर्तन को मापने के लिए) और बेहतर reproducibility (सही समय पर जीन अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए). आम तौर पर, सबसे सेलुलर आरएनए राइबोसोमल आरएनए है तो कई तरीकों को विशिष्ट आरएनए प्रजातियों के लिए समृद्ध करने के लिए विकसित किया गया है 20. यहाँ पॉली-टी मोतियों को पाली-ए-युक्त mRNA टेप को शुद्ध किया जाता था, हालांकि विभिन्न व्यावसायिक रूप से उपलब्ध rRNA की कमी वाली किट भी mRNA संवर्धन में कारगर हो सकती थीं.

यहां, एस cerevisiae जीन अभिव्यक्ति प्रतिक्रिया हाइपोक्सिया के लिए विशेषता थी । कोशिकाओं को हाइपोक्सिया के संपर्क में थे और फिर आठ समय अंक (0, 5, 10, 30, ६०, १२०, १८० और २४० मिनट) पर नमूना । reproducibility पुष्टि करने के लिए और सांख्यिकीय परिवर्तित टेप की पहचान करने के लिए, तीन जैविक प्रतिकृति प्रदर्शन किया गया । आरएनए यांत्रिक व्यवधान और कॉलम शुद्धि द्वारा निकाला गया था, और फिर आरएनए-seq विश्लेषण के लिए कार्रवाई की । पोस्ट-sequencing पाइपलाइन वर्णन किया गया है और प्रोग्रामिंग स्क्रिप्ट प्रदान किए गए विश्लेषण की सटीक प्रतिकृति की अनुमति दें कि । विशेष रूप से, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, आर सांख्यिकीय पर्यावरण 24, और DESeq2 पैकेज 25 आरएनए-seq डेटा की प्रक्रिया और ६०७ जीन है कि परिवर्तन के दौरान काफी बदलने की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया हाइपोक्सिया. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) और प्रतिकृति की जीन अभिव्यक्ति तकनीक के reproducibility संकेत दिया । clustering और heatmaps व्यापक अभिव्यक्ति कैनेटीक्स से पता चला है, जबकि जीन आंटलजी (जाओ) विश्लेषण से पता चला कि कई सेलुलर प्रक्रियाओं, एरोबिक श्वसन की तरह, ऑक्सीजन विनियमित जीन के सेट में समृद्ध कर रहे हैं ।

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Protocol

1. उत्प्रेरण हाइपोक्सिया

  1. एक दिन या अधिक हाइपोक्सिया समय पाठ्यक्रम से पहले: मशीन तैयार, सेल फ़िल्टरिंग प्रणाली, निर्वात, गैस टैंक, कुप्पी, डाट, ग्लास टयूबिंग, और टयूबिंग, के रूप में सामग्री तालिका।
  2. बंद निकटता में एन2 टैंक, मशीन, निर्वात और फ़िल्टरिंग प्रणाली प्लेस, कोशिकाओं के त्वरित प्रसंस्करण सक्षम करने के लिए ।
  3. तैयार बाँझ तरल YPD मीडिया (1% खमीर निकालने, 2% peptone, 2% ग्लूकोज) एक गिलास बोतल और autoclaving में घटकों को मिलाकर ।
  4. योजना मशीन में कुप्पी के लेआउट ।
    नोट: एन2 टैंक से, पहली कुप्पी का पानी का जाल होगा, दूसरी कुप्पी अंतिम समय बिन्दु होगा, तीसरी कुप्पी तक दूसरा-अंतिम समय बिन्दु होगा और इतने पर अंतिम कुप्पी तक जो कि एक अंतिम पानी का जाल है. चित्रा 1 क्रम और बोतल के बीच कनेक्शन से पता चलता है ।
  5. समय पाठ्यक्रम के पहले दिन, लगाना एक बाँझ परीक्षण ट्यूब के भीतर 5 मिलीलीटर तरल YPD की एक संस्कृति में एक खमीर कॉलोनी । विशेष रूप से, एक बाँझ applicator छड़ी का उपयोग कर एक थाली से एक पूर्ण कॉलोनी उठाओ । तरल YPD में छड़ी प्लेस और छड़ी हिला जब तक कोशिकाओं के सबसे निलंबन में हैं ।
  6. 30 डिग्री सेल्सियस रात भर ट्यूबों (~ 16 एच) घुमाएँ ।
    नोट: 16 एच के बाद, wildtype कोशिकाओं संतृप्ति को प्राप्त होगा (~ 2 x 108 कोशिकाओं/एमएल), एक बहुत बादल संस्कृति द्वारा संकेत दिया । अन्य उपभेदों संतृप्ति तक पहुँचने के लिए अब ले सकते हैं और कदम 1.9.4 में संकेत के रूप में एक spectrophotometer के साथ कोशिका एकाग्रता को मापने के द्वारा परीक्षण किया जाना चाहिए.
  7. समय पाठ्यक्रम के दिन, के बाद 16 मशीन के ज, एक 5 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग करके संतृप्त संस्कृति 1:50 पतला एक बाँझ ५०० मिलीलीटर कुप्पी के भीतर १९६ तरल YPD की मिलीलीटर में रातोंरात संस्कृति के 4 मिलीलीटर जगह । 30 डिग्री सेल्सियस पर 4 घंटे के लिए ~ २०० rpm पर मिलाते के साथ हो जाना ।
    नोट: 4 एच के बाद, एक wildtype संस्कृति एक मध्य लॉग एकाग्रता तक पहुंच जाएगा ~ 1-2 x 107 कोशिकाओं/
  8. 4 एच की मशीन के दौरान, (हाइपोक्सिया और पानी के जाल के लिए) और ५० एमएल संग्रह ट्यूबों की बोतल लेबल । यदि १.७ ऊपर कदम में मशीन हाइपोक्सिया समय पाठ्यक्रम के लिए उपयोग नहीं किया जाता है, अंय मशीन पर बारी और 30 डिग्री सेल्सियस के लिए सेट ।
  9. बस हाइपोक्सिया करने के लिए कक्षों subjecting से पहले:
    1. जोड़ें ~ ५० एमएल पानी बाँझ २५० मिलीलीटर कुप्पी जो पानी के जाल के रूप में काम करेगा के दो करने के लिए ।
    2. भरने के 1/3 तरल नाइट्रोजन के साथ एक बर्फ की बाल्टी और एक polystyrene फोम रैक के लिए ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों पकड़ डूब ।
    3. कक्षों को एकत्रित करने के लिए फ़िल्टर सिस्टम सेट करें । केवल फिल्टर डिस्क के किनारों को छूने के लिए सावधान किया जा रहा है, बाँझ चिमटी का उपयोग कर निस्पंदन प्रणाली के नीचे इकाई पर एक बाँझ फिल्टर डिस्क जोड़ें । फिल्टर नीचे इकाई पर फ़िल्टर शीर्ष इकाई प्लेस और प्रणाली के साथ प्रदान की clamps के साथ सुरक्षित । सुनिश्चित करें कि नीचे और ऊपर की इकाइयों इतना गठबंधन किया है कि वहां एक तंग मुहर और कोई रिसाव है ।
    4. एक spectrophotometer के साथ कोशिका एकाग्रता को मापने । कोशिकाओं को पतला ताकि वे spectrophotometer के रेखीय श्रेणी में मापा जा सकता है – आयुध डिपो६०० के बीच ~ ०.२-०.६, spectrophotometer पर निर्भर करता है ।
      नोट: एक आयुध डिपो६०० इकाई ~ 3 x 107 कोशिकाओं/एमएल, कक्ष आकृति विज्ञान और spectrophotometer के आधार पर है । की एकाग्रता ~ 1-2 x 107 कोशिकाओं/एमएल की उंमीद है,६०० के आयुध डिपो के लिए इसी ~ ०.३३-०.६६ ।
    5. जल्दी से समय 0 नमूना प्राप्त करें ।
      1. वैक्यूम टयूबिंग और एक १,००० मिलीलीटर कुप्पी जाल के माध्यम से एक मजबूत (~ 10 mbar) वैक्यूम करने के लिए फिल्टर प्रणाली कनेक्ट । वैक्यूम चालू करें । संस्कृति डालो (आमतौर पर ~ 20 एमएल) शीर्ष इकाई में और तरल के लिए प्रतीक्षा करने के लिए फ़िल्टर के माध्यम से खींच लिया (~ 10 एस, निर्वात की शक्ति पर निर्भर करता है) ।
      2. ध्यान से साफ चिमटी के साथ फिल्टर डिस्क निकालें और एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब में जगह है । तुरंत तरल नाइट्रोजन में जलमग्न रैक में केंद्रापसारक ट्यूब जगह है । महत्वपूर्ण बात यह है कि ट्यूबों विस्फोट होगा के रूप में फिल्टर डालने से पहले पूर्व ठंडा ट्यूबों नहीं है ।
      3. > 30 एस के बाद, एक में ट्यूब प्लेस-८० ° c बाद में आरएनए निष्कर्षण के लिए फ्रीजर । प्रत्येक निस्पंदन के बाद, साफ और फिल्टर प्रणाली को फिर से इकट्ठा । एक फिल्टर डिस्क के बिना 10 एस के लिए के माध्यम से पानी खींच द्वारा प्रणाली कुल्ला । अंत में, एक कागज तौलिया के साथ प्रणाली सूखी पोंछ ।
    6. विभिंन समय अंक के लिए अलग कुप्पी में 4 एच संस्कृति पतला है, ताकि प्रत्येक कुप्पी मध्य लॉग एकाग्रता तक पहुंचता है (~ 1-2 x 107 कोशिकाओं/एमएल) हाइपोक्सिया के संकेत दिया समय बिंदु पर ।
      नोट: 1 टेबल कमजोर पड़ने कि जंगली प्रकार S288C HAP1+ अगुणित तनाव के लिए इस्तेमाल किया गया दिखाता है । यह इन hypoxic संस्कृति की स्थिति में प्रत्येक तनाव का परीक्षण और तदनुसार कमजोर पड़ने समायोजित करने के लिए सिफारिश की है ।
    7. एक बार कोशिकाओं और मीडिया की कुप्पी के लिए जोड़ रहे हैं, एल्यूमीनियम पंनी दो ग्लास ट्यूब डाला युक्त एक डाट के साथ खोलने कुप्पी कवर की जगह ।
    8. पहले निर्धारित लेआउट में मशीन में बोतल प्लेस ।
    9. आरेख 1में दिखाए गए अनुसार टयूबिंग को सुरक्षित रूप से कनेक्ट करें ।
    10. जांच करें कि सभी डाट कसकर कुप्पी खोलने में धकेल दिया जाता है ।
  10. समय 0, नियामक वाल्व खोलो । फिर 3 L/मिनट के लिए प्रवाह मीटर सेट ।
    नोट: bubbling दोनों पानी की कुप्पी में मनाया जाएगा, उचित गैस प्रवाह का संकेत है । यदि यह मामला नहीं है, जांच करें कि सभी डाट तंग कर रहे है और टयूबिंग ठीक से जुड़ा हुआ है ।
  11. मशीन बंद करो और ~ २०० rpm को मिलाते हुए गति सेट । कोई टाइमर प्रारंभ करें ।
  12. प्रत्येक समय बिंदु से पहले, ऊपर चरण 1.9.3 में वर्णन के रूप में फ़िल्टर सिस्टम सेट करें ।
  13. हर समय बिंदु पर (जैसे, 5 मिनट, 10 मिनट, आदि), दो लोगों को जल्दी से इस प्रकार के रूप में कोशिकाओं की प्रक्रिया है:
    1. पहला व्यक्ति: धारक से उपयुक्त कुप्पी निकालें और बाहर ले डाट (ग्लास टयूबिंग संलग्न के साथ) ।
      नोट: यह शेष संस्कृति की कुप्पी में से किसी को एन2 के प्रवाह को तोड़ने नहीं होगा, लेकिन अस्थायी रूप से पिछले पानी के जाल के प्रवाह को तोड़ देगा ।
    2. दूसरा व्यक्ति: संस्कृति के प्लास्टिक 1 मिलीलीटर और एक cuvette में बांटना । संस्कृति कुप्पी कि पिछले पानी के जाल को लाइन के अंत में अब है से टयूबिंग जोड़ने (एक ट्यूब और एक डाट प्रक्रिया में हटा दिया जाएगा.) । फिर, cuvette में कोशिका एकाग्रता को मापने, चरण 1.9.4 में ऊपर वर्णित के रूप में.
    3. पहला व्यक्ति: वैक्यूम निस्पंदन प्रणाली में संस्कृति के शेष डालो, और फिर फ़िल्टरिंग और ठंड के रूप में कदम 1.9.5 में ऊपर वर्णित प्रदर्शन करते हैं ।
  14. जब सभी समय बिंदुओं के साथ समाप्त हो, एन2 गैस बंद कर दें । पहले नियामक को बंद करें और जारी करने के लिए दबाव के लिए प्रतीक्षा करें, और फिर प्रवाह मीटर बंद करें । अंत में, प्रणाली को जुदा और पानी के साथ सभी सामग्रियों और फिर ७०% इथेनॉल साफ ।

2. आरएनए निष्कर्षण

  1. सामग्री तालिकामें वर्णित के रूप में, आरएनए स्तंभ शुद्धिकरण के लिए RLT बफर तैयार करें ।
  2. DNase के 10 µ l को जोड़कर एक काम समाधान तैयार करें ७० µ l के लिए बफर RDD का नमूना प्रति ( सामग्री तालिकादेखें) ।
  3. ५० मिलीलीटर ट्यूब से फिल्टर और कोशिकाओं से युक्त निकालें-८० ° c फ्रीजर और गल को बर्फ पर जगह (~ 15 मिनट) । बर्फ पर ट्यूबों के साथ निंनलिखित चरणों का पालन करें ।
  4. लेबल 2 मिलीलीटर पेंच-कैप ट्यूबों और उंहें बर्फ पर जगह, प्रत्येक नमूने के लिए एक ट्यूब । एक ट्यूब के लिए एसिड धोया मोतियों की ~ ०.६ मिलीलीटर जोड़ें, एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब का उपयोग करने के लिए स्कूप और मोतियों को मापने ।
  5. ५० मिलीलीटर ट्यूबों के लिए ०.६ मिलीलीटर शीत RLT बफर जोड़ें ।
  6. फ़िल्टर से कक्षों को निकालने और समाधान में निलंबित करने के लिए ऊपर और नीचे प्लास्टिक । फिल्टर समाधान सोख लेंगे के रूप में फ़िल्टर हल में रहने दे से बचें. प्लास्टिक टिप का उपयोग करने के लिए ट्यूब की दीवार के खिलाफ फिल्टर निचोड़ द्वारा फिल्टर में अवशोषित सभी समाधान निकालें ।
  7. ५० मिलीलीटर ट्यूब से तरल के सभी स्थानांतरण करने के लिए पेंच कैप युक्त मोती ट्यूब ।
  8. एक मनका मिल homogenizer में पेंच टोपी ट्यूब प्लेस और एक मिनट के लिए चलाते हैं ।
    तुरंत बर्फ पर ट्यूबों तीन मिनट के लिए जगह है । फिर, homogenizer में ट्यूबों जगह और एक मिनट के लिए चलाते हैं ।
  9. homogenizer और 5 मिनट के लिए बर्फ पर जगह से ट्यूबों निकालें । मोतियों की नलियों के नीचे तक बसा होगा.
  10. कमरे के तापमान पर चरणों के शेष प्रदर्शन ।
  11. एक प्लास्टिक के साथ, केवल lysate (~ ३५० µ l) हस्तांतरण, मोतियों से परहेज, एक नया १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए ।
  12. Microcentrifuge अधिकतम गति पर 2 मिनट के लिए और फिर एक नया १.५ एमएल Microcentrifuge ट्यूब करने के लिए supernatant हस्तांतरण ।
  13. ७०% इथेनॉल की 1 मात्रा जोड़ें (२०० सबूत आणविक जीव विज्ञान ग्रेड इथेनॉल से बना) । pipetting द्वारा अच्छी तरह मिलाएं ।
  14. स्थानांतरण समाधान और किसी एक आरएनए कॉलम है कि एक 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब के अंदर रखा गया है करने के लिए किसी भी हाला ।
  15. ≥ १२,००० x g पर 15 एस के लिए केंद्रापसारक और प्रवाह को त्यागें-के माध्यम से (ट्यूब में तरल) ।
  16. स्तंभ के लिए बफ़र RW1 के ३५० µ l जोड़ें । ≥ १२,००० x जी पर 15 एस के लिए केंद्रापसारक और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  17. जोड़ें ८० µ एल DNase मैं स्तंभ झिल्ली को गर्मी मिश्रण (ट्यूब के पक्षों पर नहीं मिलता है) और 15 मिनट के लिए बैठने की अनुमति देते हैं ।
  18. जोड़ें ३५० µ बफ़र RW1 के एल स्तंभ । Microcentrifuge 15 एस के लिए ≥ १२,००० x जी पर और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  19. स्तंभ के लिए बफ़र RPE के ५०० µ l जोड़ें । 15 एस के लिए Microcentrifuge ≥ १२,००० x g पर और प्रवाह के माध्यम से त्यागें ।
  20. स्तंभ के लिए बफ़र RPE के ५०० µ l जोड़ें । ≥ १२,००० एक्स जीमें 2 मिनट के लिए Microcentrifuge
  21. ध्यान से कॉलम और एक नया 2 मिलीलीटर संग्रह ट्यूब में जगह निकालें । 1 मिनट के लिए पूरी गति से Microcentrifuge (पूरी तरह से झिल्ली सूखी) ।
  22. संग्रह ट्यूब छोड़ें और स्तंभ को १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में रखें । RNase के 30 µ एल जोड़ें-मुक्त पानी कॉलम झिल्ली के लिए ।
  23. ≥ १२,००० x gमें 1 मिनट के लिए microcentrifuging द्वारा स्तंभ से आरएनए Elute । जब microcentrifuge में कॉलम लोड हो रहा है, तो सुनिश्चित करें कि संग्रह ट्यूब की पलकों दिशा में सामना करना पड़ रहा है स्पिन, पलकों को रोकने के लिए बंद तोड़ने ।
  24. एक ही microcentrifuge ट्यूब में कॉलम रखते हुए कॉलम झिल्ली को RNase-मुक्त पानी की एक और 30 µ एल जोड़ें ।
  25. ≥ १२,००० एक्स जीमें 1 मिनट के लिए Microcentrifuge, ताकि अंतिम eluate मात्रा ६० µ l
  26. प्रत्येक १.५ मिलीलीटर ट्यूब-८० ° c फ्रीजर में आरएनए के ६० µ l युक्त स्टोर ।

3. आरएनए एकाग्रता और गुणवत्ता का निर्धारण

  1. प्रत्येक आरएनए नमूना में आरएनए और डीएनए की एकाग्रता को मापने, का उपयोग कर (क) एक fluorometer, (ख) डीएनए और आरएनए-विशिष्ट फ्लोरोसेंट रंजक और (सी) परख ट्यूबों, के रूप में सामग्री तालिकामें सूचीबद्ध । fluorometer और रंजक के निर्देशों का पालन करें ।
  2. वैकल्पिक रूप से, एक यूवी spectrophotometer २६० एनएम पर सेट के साथ न्यूक्लिक एसिड एकाग्रता को मापने ।
    नोट: १.० के एक एक२६० पढ़ने ~ ४० µ g/एमएल एकल असहाय आरएनए के बराबर है ।
  3. परीक्षण एक वाणिज्यिक न्यूक्लिक एसिड विश्लेषक पर आरएनए चलाकर आरएनए गुणवत्ता ( सामग्री तालिकादेखें) या एक मानक formaldehyde/agarose जेल 26पर ।

4. आरएनए-seq विश्लेषण

  1. कुल आरएनए स्टॉक से, RNase-मुक्त पानी में १०० एनजी/µ एल आरएनए के 21 µ एल बनाओ । ऊपर के रूप में आरएनए एकाग्रता का परीक्षण करने के लिए इस 21 µ एल के 1 µ एल का उपयोग करें । शेष 20 µ एल (2 µ जी) कुल आरएनए mRNA संवर्धन के लिए एक बाहरी अनुक्रमण केंद्र, किनारा-विशिष्ट पुस्तकालय तैयारी (मल्टीप्लेक्स के लिए आठ या अधिक बारकोड के साथ) और अनुक्रमण ( सामग्री तालिकादेखें) सबमिट करें । वैकल्पिक रूप से, स्थानीय रूप से mRNA संवर्धन और पुस्तकालय की तैयारी करते हैं, और फिर अनुक्रमण के लिए पुस्तकालय प्रस्तुत करते हैं ।
  2. पूल आठ या अधिक मल्टीप्लेक्स नमूनों और अनुक्रम एक अगली पीढ़ी sequencer के एक लेन में ।
  3. सभी अनुक्रम पढ़ता है और संबंधित अनुक्रमणिका पढ़ता है जिसमें FASTQ फ़ाइल डाउनलोड करें । साथ ही, मल्टीप्लेक्स बारकोड युक्त टेक्स्ट फाइल डाउनलोड करें ।
    नोट: अनुक्रमणिका पढ़ता एक अलग FASTQ फ़ाइल में मौजूद हो सकता है । इन फ़ाइलों के सभी एक निर्देशिका में रखें ।
  4. शेल स्क्रिप्ट यहां उपलब्ध कराई, "fastq_pipeline. sh", एक ही निर्देशिका में रखें । इस स्क्रिप्ट को प्रयोग और कंप्यूटर निर्देशिकाओं के लिए उपयुक्त के रूप में संपादित करें ।
    नोट: इस स्क्रिप्ट में चरणों को समझाते हुए विस्तृत एनोटेशन हैं । संक्षेप में, स्क्रिप्ट गुणवत्ता छांटो पढ़ता है, नक्शे के जीनोम के लिए पढ़ता है, और एक टैब-सीमांकित एक नमूना के लिए जीन प्रति पढ़ता की संख्या युक्त फ़ाइल उत्पंन करता है ।
  5. 27प्रकाशन से पहले FASTQ फ़ाइलों और अपुष्ट पठन गणना डेटा को NCBI के जीन एक्सप्रेशन सर्वग्राही में जमा करें । "उच्च प्रवाह अनुक्रम डेटा को भू में सबमिट करने के लिए" निर्देशों का पालन करें: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html ।
  6. r सांख्यिकीय वातावरण में पठन गणना डेटा आयात करें और सांख्यिकीय विश्लेषण करें, यहाँ प्रदान की गई r स्क्रिप्ट का उपयोग करते हुए, "time_course_script. आर ". इस स्क्रिप्ट को प्रयोग और कंप्यूटर निर्देशिकाओं के लिए उपयुक्त के रूप में संपादित करें ।
    नोट: इस स्क्रिप्ट में चरणों को समझाते हुए विस्तृत एनोटेशन हैं । संक्षेप में, इस स्क्रिप्ट को पढ़ने के डेटा आयात, सामांय पढ़ता है, जीन है कि समय पाठ्यक्रम के दौरान काफी परिवर्तन की पहचान, पीसीए विश्लेषण करता है, और रेखांकन चयनित जीन की अभिव्यक्ति ।

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Representative Results

हाइपोक्सिया समय पाठ्यक्रम और आरएनए-seq विश्लेषण स्वतंत्र रूप से तीन बार प्रदर्शन किया गया । reproducibility की जांच करने के लिए तीन प्रतिकृतियां, सभी जीनों के लिए जीन अभिव्यक्ति डेटा प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था । चित्रा 2 से पता चलता है कि नमूनों पहले दो प्रमुख घटक है, जो एक साथ परिवर्तनशीलता का ५८.९% प्रतिनिधित्व पर बदल जाते हैं । इस विश्लेषण से संकेत मिलता है कि हर बार पाठ्यक्रम समान परिवर्तन प्रदर्शित करता है (जैसा कि प्रत्येक वक्र के समान आकार द्वारा दर्शाया गया है). इसके अलावा, पिछले दो प्रतिकृति और पहले दोहराने के लिए से एक दूसरे के समान थे । यह तथ्य यह है कि पिछले दो दोहराने एक ही व्यक्ति के मीडिया घटकों के एक ही बैचों का उपयोग करके प्रदर्शन किया गया के साथ संगत है, जबकि पहले दोहराने एक अलग व्यक्ति और बैचों द्वारा किया गया था । यह खोज तथ्य यह है कि तकनीक और रसायनों की निरंतरता उच्च reproducibility प्राप्त करने में एक महत्वपूर्ण कारक है पर प्रकाश डाला गया । अंत में, पीसीए विश्लेषण कि चुना समय अंक समय पाठ्यक्रम के दौरान होने वाले प्रमुख परिवर्तन पर कब्जा का आकलन करने में उपयोगी है. एक दोहराने वक्र पर ध्यान केंद्रित, वहां पहले नमूनों के बीच बड़ी दूरी रहे हैं, जीन अभिव्यक्ति में बड़े बदलाव का संकेत है, और बाद के नमूनों के बीच छोटी दूरी, छोटे परिवर्तन और संभवतः एरोबिक से स्विच के अंत का संकेत hypoxic जीन एक्सप्रेशन.

अगले, आर25 में DESeq2 पैकेज के लिए समय 0 की तुलना में एक महत्वपूर्ण परिवर्तन दिखा जीन की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया गया था ( अनुपूरक तालिका 1में पी-मूल्यों) । इन महत्वपूर्ण जीन की, ६०७ से अधिक 4 गुना बदल ( अनुपूरक तालिका 1में गुना परिवर्तन) । इन जीनों की अभिव्यक्ति पैटर्न clustered थे, ताकि इसी तरह विनियमित जीन एक साथ समूहीकृत किया गया, और फिर एक heatmap में प्रदर्शित (चित्र 3) । यह आंकड़ा दिखाता है कि अभिव्यक्ति परिवर्तन अत्यधिक प्रतिलिपि भर में प्रतिकृतियां हैं । इसके अलावा, जीन दोनों बढ़ जाती है और अभिव्यक्ति में कमी के साथ चर कैनेटीक्स प्रदर्शन । कई जीन एक पीक वृद्धि या 30 मिनट में कमी, एक क्षणिक तनाव की प्रतिक्रिया के कारण 13की संभावना प्रदर्शन ।

चित्रा 4 दो downregulated और दो विनियमित जीन पहले से ओ2विनियमित पाया की अभिव्यक्ति को दर्शाया गया है । जीन परिवर्तन अभिव्यक्ति reproducibly, जैविक प्रतिकृति के बीच समान घटता के साथ । प्रतिकृति के बीच कम परिवर्तनशीलता के साथ जीन DAN1है, अतिव्यापी curves के साथ । सबसे परिवर्तनशीलता के साथ जीन है CYC1, शायद इसलिए कि इस जीन की अभिव्यक्ति स्वाभाविक रूप से परिवर्तनशील है । यह आंकड़ा भी है कि बड़े गुना परिवर्तन (अप करने के लिए १,०२४-गुना) का पता लगाया गया है कि दिखाता है ।

सेलुलर प्रक्रियाओं ६०७ हे2के सेट में समृद्ध की पहचान करने के लिए-विनियमित जीन, जाओ शब्द संवर्धन प्रदर्शन किया गया था (अनुपूरक तालिका 2). जैसा कि उंमीद थी, कई ओ2विनियमित जीन सेलुलर श्वसन, चयापचय के अंय पहलुओं में एक भूमिका निभाते हैं, और राइबोसोमल में 13प्रक्रियाओं ।

नमूना# हाइपोक्सिया में समय एमएल कल्चर + एमएल YPD
2 5 min 20 मिलीलीटर + 0 मिलीलीटर
3 10 min 20 मिलीलीटर + 0 मिलीलीटर
4 30 min 20 मिलीलीटर + 0 मिलीलीटर
5 ६० मिनट 10 मिलीलीटर + 10 मिलीलीटर
6 १२० मिनट 10 मिलीलीटर + 10 मिलीलीटर
7 १८० मिनट 5 मिलीलीटर + 15 मिलीलीटर
8 २४० मिनट 4 मिलीलीटर + 16 मिलीलीटर

तालिका 1. सेल कमजोर पड़ने के समय 0 पर प्रदर्शन किया ।
इन कमजोर पड़ने वाले प्रयोग के मध्य में परिणाम के लिए निर्धारित किया गया है-लॉग एकाग्रता (1-2 ×10 7 कोशिकाओं/एमएल)N2 में संकेत दिया समय के बाद ।

अनुपूरक तालिका 1. अभिव्यक्ति और सभी जीन के लिए सांख्यिकीय डेटा ।
इस तालिका में व्यवस्थित नाम, समायोजित पी-सात DESeq2 परीक्षण (यानी, 5 मिनट बनाम 0 मिनट, 10 मिनट बनाम 0 मिनट, आदि), ंयूनतम समायोजित पी मूल्य, और log2 अधिकतम गुना-परिवर्तन के लिए मान शामिल हैं । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

अनुपूरक तालिका 2. शब्द संवर्धन परिणाम जाओ ।
इस तालिका जाओ प्रक्रियाओं, ६०७ हे2के सेट में उनके प्रतिनिधित्व से पता चलता है-विनियमित जीन और जीनोम में उनके प्रतिनिधित्व. फिर, ची वर्ग परीक्षण के लिए जाना है कि काफी अधिक थे या के तहत-६०७ जीन के सेट में प्रतिनिधित्व की पहचान के लिए इस्तेमाल किया गया था । जाओ संवर्धन विश्लेषण SGD 28पर जाओ स्लिम मैपर का उपयोग किया गया था । इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए कृपया यहां क्लिक करें.

Figure 1
चित्र 1. हाइपोक्सिया सेट-बाद में समय अंक के लिए गैस प्रवाह को बाधित किए बिना समय अंक लेने के लिए ।
यह महत्वपूर्ण है कि सभी कनेक्शन सुरक्षित रहते हैं, जैसा कि प्रोटोकॉल में वर्णित है । लघु (9 सेमी) और लंबे (17 सेमी) ग्लास ट्यूबों के स्थान पर ध्यान दें । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्र 2. प्रिंसिपल घटक विश्लेषण (पीसीए) तीन जैविक प्रतिकृति के बीच संबंध दिखाता है ।
प्रत्येक वक्र क्रम में 0 मिनट २४० ंयूनतम नमूनों की है । सभी जीनों के लिए log2 सामान्यीकृत जीन अभिव्यक्ति पीसीए में इस्तेमाल किया गया था । PC1 कुल विचरण के ३४.७% के लिए खातों और २४.२% के लिए PC2 खातों । काली रेखा पहले दोहराने की है, लाल रेखा दूसरी है, और नीली रेखा तीसरी है । तीर अलग नमूनों में २४० मिनट समय बिंदु बाहर बिंदु करने के लिए इस्तेमाल किया जा रहा है कि ध्यान दें. प्रमुख घटक विश्लेषण (पीसीए) आर में किया गया था prcomp समारोह का उपयोग करके (क्यू-मोड, या एकवचन मूल्य अपघटन) log2-रूपांतरित मैट्रिक्स कॉलम और समय अंक में पंक्तियों में जीन युक्त में 29। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्र 3. Heatmap ६०७ ओ2के रूप में पहचाने-विनियमित जीन की अभिव्यक्ति दिखा रहा है ।
ये जीन DESeq2 परीक्षणों में से कम एक में महत्वपूर्ण थे और 4 से अधिक गुना द्वारा अभिव्यक्ति बदल दिया है । दिखाया गया है लॉग2(सापेक्ष व्यंजक) । Red = बढ़ती हुई अभिव्यक्ति. Green = घटी हुई अभिव्यक्ति. रंग की तीव्रता परिवर्तन की डिग्री के लिए आनुपातिक है । TreeView 30में heatmap बनाने से पहले, जीन अभिव्यक्ति था कश्मीर का मतलब = 10 क्लस्टर ३.० 31में कश्मीर के साथ संकुल । heatmap नीचे कुंजी पैमाने से पता चलता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्र 4. सापेक्ष mRNA तीन में समय पर चार जीन के स्तर को दोहराने ।
काली रेखा पहले दोहराने की है, लाल रेखा दूसरी है, और नीली रेखा तीसरी है । आम/व्यवस्थित जीन नाम CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150C, और NCE103/YNL036W। कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

पूरक फ़ाइल 1. fastq_pipeline प्र. श.
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पूरक फ़ाइल 2. time_course_script । आर
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Discussion

इस अध्ययन में हाइपोक्सिया के दौरान सभी जीनों के लिए mRNA स्तरों को खमीर के एस cerevisiaeमें मापा गया था । लक्ष्य को कैसे वैश्विक जीन अभिव्यक्ति एक नियंत्रित निकट anoxic वातावरण में वृद्धि के कारण परिवर्तन का विश्लेषण किया गया । यह सुनिश्चित करने के लिए कई कदम उठाए गए कि यहां वर्णित विधि को सावधानीपूर्वक नियंत्रित और प्रतिलिपि किया गया । पहले, कक्षों को ठीक से परिभाषित hypoxic परिवेश में दिखाया गया: ९९.९९९% N2 रिच मीडिया (YPD) में । हाइपोक्सिया के अंय अध्ययनों से बंद कर दिया है कुप्पी या ट्यूब हवा के लिए ३२, हाइपोक्सिया-करनेवाला कोबाल्ट क्लोराइड ३३, या कार्यरत हाइपोक्सिया-उत्प्रेरण anaerobic मंडलों या बैग ३४थे । इन विधियों में से प्रत्येक हाइपोक्सिया या अंय अवांछित पर्यावरणीय परिवर्तनों के स्तर को अलग करने में परिणाम हो सकता है । यह जीन अभिव्यक्ति का अध्ययन करने के लिए उपयोगी होगा, जबकि व्यवस्थित गैस मिश्रण अलग (उदा, ९०% N2 और 10% हे2), के रूप में जंगली में खमीर कम गंभीर hypoxic स्थितियों का अनुभव करने की संभावना है । दूसरा, ergosterol और unसंतृप्त फैटी एसिड (जैसे, ८० के बीच) संस्कृति मीडिया में नहीं जोड़ा गया, क्योंकि वे जीन अभिव्यक्ति प्रभाव के रूप में परिचय में चर्चा की । तीसरा, जीन अभिव्यक्ति विकास के विभिंन चरणों की वजह से परिवर्तन को कम करने के लिए, empirically-निर्धारित कमजोर पड़ने इतना प्रदर्शन किया है कि जब एक संस्कृति एक समय बिंदु तक पहुंच गया था, यह विकास के मध्य लॉग चरण में था (~ 1-2 x10 7 कोशिकाओं/एमएल) । चौथा, हाइपोक्सिया से निकाले गए कक्षों की त्वरित फ़िल्टरिंग और जमने वाली (~ 15 s) महत्वपूर्ण है, क्योंकि जीन व्यंजक परिवर्तन, हे2के लिए एक्सपोज़र के < 5 मिनट में हो सकते हैं, जैसा कि तब होता है जब कक्ष केंद्रापसारक द्वारा एकत्रित किए जाते है (डेटा नहीं दिखाया गया है) । समय है कि कोशिकाओं को ओ2 में उजागर कर रहे है विकास और एक anoxic हूड या चैंबर में कोशिकाओं की कटाई प्रदर्शन से कम किया जा सकता है । पांचवां, इस अध्ययन के लिए एक उपयुक्त तनाव चुना गया; अन्य जीनोमिक अध्ययन के अनुरूप होने के लिए आम S288C लैब तनाव पृष्ठभूमि कार्यरत थी । हालांकि, S288C उपभेदों एक उत्परिवर्ती hap1 एलील शामिल है और इस तरह 11की मरंमत की थी । यह CYC1 जैसे जीन के अध्ययन की अनुमति दी है कि Hap1 प्रतिलेखन फैक्टर 11के माध्यम से ओ2 स्तरों का जवाब ।

समय अंक चुना गया क्योंकि वे पिछले हाइपोक्सिया प्रयोगों में बड़े जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन का प्रदर्शन किया । यहां दिखाए गए परिणाम भावी प्रयोगों को सूचित कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, यह अंतराल के दौरान समय बिंदुओं के उच्च रिज़ॉल्यूशन का उपयोग करने में सहायक होता है जो विविध कैनेटीक्स को अधिक बारीकी से कैप्चर करने के लिए बड़े परिवर्तन (उदा., 0 से 30 मिनट हाइपोक्सिया) दिखाता है । इसके अतिरिक्त, बाद में समय अंक, यहां समय की अवधि परख से परे (यानी, हाइपोक्सिया के 4 एच) आगे अभिव्यक्ति परिवर्तन प्रकट हो सकता है ।

आरएनए-seq mRNA स्तरों को मापने के लिए इस्तेमाल किया गया था क्योंकि इसके reproducibility और व्यापक गतिशील रेंज बड़े गुना परिवर्तन 18,३५के माप की अनुमति है । आरएनए तेजी से हिल मोतियों का उपयोग कर कोशिकाओं के यांत्रिक विघटन और एक कॉलम पर शुद्ध द्वारा निकाला गया था । अन्य आरएनए शुद्धि विधियों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे कि हॉट phenol ३६। आदर्श रूप में, आरएनए एकाग्रता २०० एनजी/µ एल-१००० एनजी/µ एल की सीमा में होगा क्योंकि आरएनए एकाग्रता रिवर्स प्रतिलेखन और पुस्तकालय की तैयारी के लिए १०० एनजी/µ एल करने के लिए पतला हो जाएगा । आरएनए एकाग्रता एक fluorometer और आरएनए-विशिष्ट डाई के साथ मापा जाना चाहिए; एक यूवी spectrophotometer सीमित है क्योंकि यह न्यूक्लिक एसिड की कुल एकाग्रता उपाय, दोनों आरएनए और डीएनए से मिलकर । आरएनए की गुणवत्ता जेल ट्रो द्वारा निर्धारित की जाती है; राइबोसोमल आरएनए बैंड जेल पर अच्छी तरह से परिभाषित किया जाना चाहिए और आरएनए क्षरण इंगित करता है धब्बा. यहां, mRNA टेप समृद्ध किया गया है, लेकिन वहां विभिंन प्रकार की आरएनए अलग करने के लिए विभिंन तरीकों रहे है 20 कि प्रतिक्रिया में भी महत्वपूर्ण हो सकता है ।

संसाधनों को बचाने के लिए, 8 और 12 नमूनों के बीच मल्टीप्लेक्स थे और एक लेन में एक साथ अनुक्रम, एक औसत में जिसके परिणामस्वरूप ६९३ प्रत्येक नमूने के लिए प्रति जीन पढ़ता है, reproducibly करने के लिए पर्याप्त जीन प्रति पढ़ता की संख्या निर्धारित करते हैं । वास्तव में, 12 से अधिक नमूनों को एक लेन में मल्टीप्लेक्स किया जा सकता है, जिसकी संभावना अधिकांश जीनों के पर्याप्त नमूने में उत्पंन होती है । औसत की गणना करने के लिए जीन प्रति पढ़ता है, की कुल संख्या पढ़ता है कि जीन के लिए मैप (HTSeq आउटपुट फ़ाइल में) HTSeq को प्रदान की जीन की संख्या से विभाजित किया गया था (इस अध्ययन में, ७१४०). एक लेन में मल्टीप्लेक्स किए जा सकने वाले नमूनों की अधिकतम संख्या का आकलन करते समय, इस और अन्य आरएनए-seq अध्ययनों से डेटा का उपयोग करते हुए निम्नतम अभिव्यक्ति (अर्थात, निम्नतम सामान्यीकृत गिनती) दर्शाने वाले ब्याज के जीन पर विचार करें. यदि एक जीन के लिए सामान्यीकृत पढ़ने के लिए मायने रखता है उल्लेखनीयतया भर में काफी भिंनता है, तो पढ़ता की संख्या बहुत कम हो सकता है, सुझाव है कि कम नमूनों sequencing लेन प्रति मल्टीप्लेक्स किया जाना चाहिए ।

अगली पीढ़ी के अनुक्रमण FASTQ फ़ाइलें पढ़ता है और अन्य जानकारी युक्त उत्पन्न होगा । यदि मल्टीप्लेक्स का प्रदर्शन किया गया, तो एक बारकोड फ़ाइल और एक अतिरिक्त FASTQ फ़ाइल उत्पंन हो सकती है । इन फ़ाइलों को स्थानीय विश्लेषण के लिए डाउनलोड किया जा सकता है, के रूप में इस प्रोटोकॉल में । वैकल्पिक रूप से, वहां रहे है कई ऑनलाइन अगली पीढ़ी के अनुक्रम विश्लेषण उपकरण आदेश लाइन कार्यों या आर के साथ परिचित नहीं उन लोगों के लिए । इस संबंध में, हम गैलेक्सी (https://usegalaxy.org/) ३७ और GenomeSpace (http://www.genomespace.org/) की सलाह देते हैं । वर्तमान प्रोटोकॉल में, लेखकों द्वारा लिखी गई दो स्क्रिप्ट का उपयोग FASTQ प्रोसेसिंग और एक्सप्रेशन एनालिसिस के लिए किया जाता है । लिपियों अच्छी तरह से व्याख्या कर रहे है और विभिंन प्रयोगात्मक डिजाइन और कंप्यूटर setups के लिए संपादित किया जा सकता है । इसके अलावा, दो लिपियों और "सामग्री" तालिका इन लिपियों में प्रयुक्त उपकरण डाउनलोड करने के लिए वेबसाइटों प्रदान करते हैं । पहली स्क्रिप्ट, "fastq_pipeline. sh", एक खोल स्क्रिप्ट के लिए एक यूनिक्स में कमांड लाइन पर चलाने/ इस स्क्रिप्ट de-मल्टीप्लेक्सों मूल FASTQ फ़ाइल sequencer के एक लेन से प्राप्त की सभी शामिल है, इस प्रकार है कि लेन में मौजूद प्रत्येक नमूने के लिए एक FASTQ फ़ाइल पैदा । अगला, प्रत्येक FASTQ फ़ाइल में पढ़ता गुणवत्ता है डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स 21के साथ Trimmomatic का उपयोग कर छंटनी की । ट्रिम किए गए reads तो डिफ़ॉल्ट सेटिंग्स के साथ _20110203 का उपयोग कर S. cerevisiae S288C संदर्भ जीनोम (SGD R64-1 -1 TopHat2) के लिए मैप की जाती है 22। स्क्रिप्ट अंततः HTSeq का उपयोग करता है की संख्या निर्धारित करने के लिए कि प्रत्येक व्याख्या की सुविधा के लिए नक्शे 19पढ़ता है ।

दूसरी स्क्रिप्ट, "time_course_script । r ", लेखकों द्वारा भी लिखा गया है और r सांख्यिकीय वातावरण 24के भीतर चलाया जाता है । स्क्रिप्ट शुरू में आयात पढ़ें गिनती HTSeq द्वारा उत्पंन डेटा हैं । प्रत्येक नमूने के लिए एक समय बिंदु माना जाता है और इस तरह के अंय समय अंक के सापेक्ष आयोजित किया जाता है । कच्चे पढ़ें गिनती तो आर पैकेज में आयात कर रहे हैं, 25DESeq2, क्रम में जीन है कि अंतर से किसी भी समय पहले (यानी, एरोबिक, समय 0 के सापेक्ष अंक में व्यक्त कर रहे है की पहचान के लिए) । इसके लचीलेपन के कारण, DESeq2 का उपयोग अंय सांख्यिकीय परीक्षणों को करने के लिए किया जा सकता है, जैसे कि व्यंजक समय 13के फ़ंक्शन के रूप में बदलता है । वैकल्पिक रूप से, आरएनए-seq पठन गणना डेटा के लिए पैरामीट्रिक और गैर-पैरामीट्रिक सांख्यिकी को रोजगार देने वाले अन्य उपकरण 20का उपयोग किया जा सकता है । स्क्रिप्ट उसके बाद प्रत्येक नमूने के sequencing की डिग्री के लिए नियंत्रित करने के लिए पठन गणना को सामान्य करता, और log2 गणना बदल देता है । इन संसाधित पढ़ता पीसीए विश्लेषण करने के लिए उपयोग किया जाता है, अधिकतम गुना-प्रत्येक जीन के लिए परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए, और चित्रा 4में अभिव्यक्ति रेखांकन बनाने के लिए.

एक महत्वपूर्ण मुद्दा यह है कि कैसे सबसे अच्छा आंकड़े को रोजगार के लिए जीन है कि हाइपोक्सिया के लिए काफी जवाब की पहचान । समय निश्चित रूप से तीन जैविक प्रतिकृति प्रत्येक जीन की प्राकृतिक परिवर्तनशीलता की गणना करने के लिए आवश्यक है और इस प्रकार जीन है कि हाइपोक्सिया के लिए और अधिक संभावना से उंमीद से अधिक का जवाब निर्धारित करते हैं । वैकल्पिक रूप से, यह सफलतापूर्वक जीन की पहचान करने के लिए संभव है कि समय पर प्रतिक्रिया, जैविक बिना 13,25,३८,३९प्रतिकृति । इन तरीकों के लिए मुख्य दोष यह है कि वे खाते में प्रत्येक जीन की जैविक परिवर्तनशीलता नहीं ले । हालांकि, अगर आरएनए-seq प्रतिकृति प्रदर्शन नहीं कर रहे हैं, व्यक्तिगत जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन RT-qPCR के साथ एकाधिक जैविक प्रतिकृति 13प्रदर्शन से सत्यापित किया जा सकता है ।

एक प्रतिक्रिया के कई समय अंक का आकलन करने के लिए दो प्राथमिक लाभ कर रहे हैं । पहले, के रूप में पहले चर्चा (विशेष रूप से चित्रा 2में), एक समय पाठ्यक्रम बड़े अभिव्यक्ति परिवर्तन का प्रदर्शन अंतराल की पहचान करता है, कि क्या अतिरिक्त समय अंक कैनेटीक्स के समाधान में सुधार या बाद की घटनाओं का पालन करने के लिए आवश्यक है बताए जवाब. दूसरा, एक समय पाठ्यक्रम प्रत्येक जीन की अभिव्यक्ति कैनेटीक्स के भेदभाव की अनुमति देता है । यह अद्वितीय संकेत मार्ग है कि प्रतिक्रिया के दौरान विशिष्ट समय पर कार्य की पहचान के साथ मदद करता है, और दीक्षा और संकेतन की समाप्ति के समय में अंतर्दृष्टि देता है । विशेष रूप से, अभिव्यक्ति पैटर्न है कि यहां प्रदर्शन किया गया था द्वारा जीन की clustering सह विनियमित जीन के सेट के परिणामस्वरूप । एक जीन सेट के प्रवर्तकों एक प्रतिलेखन कारक बंधन साइट का हिस्सा हो सकता है, सुझाव है कि प्रतिलेखन कारक सक्रिय हो जाता है जब जीन परिवर्तन अभिव्यक्ति ।

जब एक सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन, मनाया परिवर्तनशीलता आदर्श उत्तेजना के कारण है (उदा, हाइपोक्सिया) और नहीं अंय प्रयोगात्मक चर के लिए । हालांकि, के रूप में चित्रा 2में देखा, व्यक्तिगत शोधकर्ता और/या मीडिया घटकों के बैचों जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तनशीलता के लिए प्रमुख योगदान करते हैं । इस प्रकार, इन मापदंडों के क्रम में उच्च reproducibility और ंयूनतम प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को प्राप्त करने के लिए विचार किया जाना चाहिए । के रूप में संभव के रूप में कम समय प्रत्येक दोहराने अलग करना चाहिए, क्योंकि प्रयोगात्मक चर अधिक समय गुजरता के रूप में बदलने की संभावना है ।

अंत में, इस विधि को सही mRNA के स्तर में जीनोम व्यापक परिवर्तन की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है (या ऐसे citrullinated संशोधनों या प्रोटीन के स्तर के रूप में अंय घटनाओं) एक हाइपोक्सिया समय पाठ्यक्रम के दौरान । विधि अन्य जीवों, विशेष रूप से माइक्रोबियल प्रजातियों कि तरल संस्कृति में उगाया जा सकता है के लिए अनुकूलित किया जा सकता है । इस तरह के जीनोम चौड़ा समय पाठ्यक्रम विश्लेषण सेल आकृति विज्ञान, प्रोटीन गतिविधि और चयापचय के अध्ययन के पूरक होंगे । एक साथ, इन आंकड़ों एक सेलुलर प्रतिक्रिया के एक अमीर समझ के लिए नेतृत्व करेंगे ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम तकनीकी सलाह के लिए और आरएनए पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण के लिए प्रिंसटन विश्वविद्यालय में एकीकृत जीनोमिक्स अनुक्रमण कोर सुविधा के लिए लुईस-Sigler संस्थान का धंयवाद । यह काम रोवन विश्वविद्यालय और NIH NIGMS R15GM113187 से M.J.H. को अनुदान द्वारा समर्थित था

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enclosed dry incubator Thermo Scientific MaxQ 4000 Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder Millipore XX1002530 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum Edwards E-LAB 2 The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in Tygon 38TT Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm Tygon E-3603 One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs Millipore HAWP02500 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen For freezing cells
acid-washed beads Sigma G8772 Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA column purification
Qiagen RLT buffer Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions Qiagen 79254 The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD Qiagen included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer Biospec Mini-Beadbeater-24 112011 Keep in cold room
Bacto Peptone BD DF0118 for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract BD DF0886 for liquid YPD media
glucose Fisher D16 for liquid YPD media
Qubit assay tubes Thermo Fisher Q32856 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Q32853 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit Thermo Fisher Q32855 for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216 for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system Agilent Bioanalyzer 2100 for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer Illumina HiSeq 2500 for sequencing libraries
automated liquid handling system Wafergen Apollo 324 for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit Wafergen 400047 for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit Wafergen 400039 for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio) https://cran.rstudio.com
R Studio (free version) https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

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References

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

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जेनेटिक्स अंक १२६ anaerobic एरोबिक transcriptome अगली पीढ़ी समय पाठ्यक्रम खमीर
खमीर के दौरान समय के साथ mRNA स्तरों को मापने <em>एस. cerevisiae</em> Hypoxic प्रतिसाद
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Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., … More

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., Evans, N., Hickman, M. J. Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response. J. Vis. Exp. (126), e56226, doi:10.3791/56226 (2017).

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