Summary
여기, 우리를 mRNA 수준 S. cerevisiae 세포의 hypoxic 응답 시간 모니터링 RNA-seq를 사용 하 여 프로토콜을 제시. 이 메서드는 어떤 세포 응답 중 유전자 발현 분석을 적용할 수 있습니다.
Abstract
유전자 발현에 복잡 한 변화는 일반적으로 상당 부분의 세포 응답 중재. 유전자는 많은 자극, 신호 경로 또는 보조 효과 중의 특정 타이밍에 의해 규제로 각 진 독특한 속도 식을 변경할 수 있습니다. 전체 유전자를 캡처하기 위해 식 응답 효 모 S. cerevisiae, RNA-seq 분석에서에서 hypoxia 저 산소 증에 노출 된 후 특정 시간에 모든 유전자의 mRNA 레벨을 모니터링 하는 데 사용 되었다. Hypoxia 성장 셀 ~ 100% N2 가스에 의해 설립 되었다. 중요 한 것은, 다른 hypoxic 연구와 달리 ergosterol 및 불포화 지방산 했다에 추가 되지 미디어 이러한 대사 유전자 발현에 영향을 때문에. 시간 포인트는 0-4 h 저 산소 증 후의 범위에서 그 기간 캡처 유전자 발현에 있는 중요 한 변화 때문에 선정 됐다. 각 시간 지점에서 중간 로그 hypoxic 세포 했다 신속 하 게 필터링 하 고 냉동, O2 와 수 반하는 변화 유전자 발현에 대 한 노출을 제한. 총 RNA 세포에서 추출 하 고 mRNA를 cDNA 다음 변환 되었습니다에 대 한 풍부 하 게 사용 했다. 이 cDNA에서 멀티플렉스 라이브러리 생성 하 고 8 개 이상의 샘플 다음-세대 시퀀서의 한 차선에 순서가 되었다. 품질 기본 트리밍, 매핑 및 결정 하는 유전자 당 읽기 수를 포함 하 후 시퀀싱 파이프라인은 기술 된다. R 통계 환경 내에서 DESeq2 hypoxic 시간 포인트 중 하나에 크게 변경 하는 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다. 3 생물 복제의 분석 공개 높은 재현성, 다른 활동의 유전자와 많은 수의 예상 O2-유전자 통제. 이러한 방법은 시간이 지남에 다양 한 생물의 세포 저 산소 증에 대처 하는 방법을 연구 하는 데 사용 하 고 다른 세포 응답 중 유전자 발현 연구에 맞게 수 있습니다.
Introduction
많은 유기 체는 유전자 식 1,2,3을 변경 하 여 저 산소 증, 또는 낮은 O2에 응답. 이 응답 세포 변화 산화 상태 4뿐만 아니라 호 기성 호흡에 대 한 몇 가지 생 합성 반응에 대 한 중요 기판의 부족을 극복할 수 있습니다. S. cerevisiae 에서 수행 하는 여러 microarray 연구 보여 수백 개의 유전자의 mRNA 수준 응답 hypoxia 5,6,7,,89 으로 변경 , 10 , 11 , 12. 최근, RNA-seq hypoxia 13중 시간이 지남에 따라 진 식 변화 하 사용 되었다. 여기, 실험 내용을 제시 하 고 논의.
다양 한 방법으로, 각각 생산 하는 O2의 다른 수준에 산소를 얻을 수 있습니다. 여기, hypoxia 지속적으로 흐르는 의해 설립 초 고 순도 N2 플라스 크로 낮추고 [O2] 해산 즉시 재현할 수 활동 10. 그것은 가능한 일부 O2 분자 현재 신진 대사 및 유전자 표현에 기여 하는 하지만이 환경은 혐 기성에 가까운 매우 간주 됩니다. O2의 부재, 효 모 세포 biosynthesize heme, ergosterol 및 불포화 지방산 4,,1214수 없습니다. 따라서, 이전 연구 산소 5,,1015없이 효 모 성장 하는 때이 대사 산물을 포함 했다. 그러나, 많은 hypoxic 응답이 대사이 산물의 고갈에 의해 중재 되 고 hypoxic 유전자 식 응답 12,16반전 따라서 그들을 보충. 자연 산소를 모방 하기 위해이 대사 되지 미디어에 추가 되었습니다. 셀이 필수적인 metabolites의 존재 없이 산소에 노출 됐다 짧은 시간에 세포 죽음 (데이터 표시 되지 않음)도 장기간된 스트레스 응답 13에 눈에 띄게 증가 했다.
응답은 또한 긴장과 그 유전자 형에 의존 합니다. 특히 중요 한 hypoxic 응답 2의 알려진된 레 귤 레이 터의 대립 이다. S288C 변형 배경은 매우이 긴장으로 수행 다른 게놈 연구에 결과 비교 될 수 있다 그래야 원한다. 그러나, S288C 부분적인 손실의 기능 대립 유전자는 HAP1 유전자 17, hypoxic 응답에 대 한 중요 한 transcriptional 규칙을 포함합니다. 이 대립 유전자 S288C에 수리는 wildtype를 사용 하 여 복사는 Σ1278b에서 변형 배경 11.
유전자 발현은 세포 환경에 매우 의존 합니다. 따라서, 게놈 넓은 mRNA 분석을 수행할 때 시간, 자극, 유전자 형 등 다른 매개 변수를 변화 하는 동안 일정 한 환경을 유지 하는 것이 중요 하다. 높은 재현성 결과 얻기 위해 연구에 대 한이 세 가지 사례와 모든 생물 학적 또는 기술적인 복제를 고려 하십시오. 첫째, 동일한 experimenter(s) 기술 사례 경험에 걸쳐 다를 수 있습니다 이후 연구를 수행 한다. 둘째, 각 일괄 처리는 유전자 발현에 영향을 줄 수 있는 약간 다른 구성 성분의 동일한 배치 성장 매체에 사용 되어야 한다. 셋째, 세포 주기 효과 최소화 하기 위해 각 시간 포인트는 성장 (1-7 셀/10ml x 2)의 중간 로그 단계에서 비동기 셀로 이루어져야 합니다.
Hypoxia에 유전자 식 응답과 같은 복잡 한 응답을 특성화 때 시간 코스의 다양 한 이벤트 활동을 결정 하는 데 유리 하다. 그 응답의 큰 변화를 사로잡을 것입니다 특정 시간 포인트를 선택 합니다. 본이 연구에서는 과거 실험 공개 유전자 발현이 기간 13동안에 광범위 하 게 변화 하기 때문에 0와 4 h 사이 시간 포인트 관찰 되었다.
측정 하려면 글로벌 유전자 발현, RNA-seq 사용된 18,19이었다. 이 방법은 각 유전자의 사본의 관계 되는 풍부를 결정 하기 위해 차세대 시퀀싱을 사용 합니다. DNA microarray 분석에 비해, RNA-seq 높은 감도 (탐지 덜 풍부한 성적 증명서), 큰 동적 범위 (큰 배 변화를 측정) 및 (정확 하 게 유전자 발현 시간이 지남에 따라)에 우수한 재현성을 전시 한다. 일반적으로, 가장 세포질 RNA 리보솜 RNA 특정 RNA 종 20에 대 한 풍부 하 게 개발 되었습니다 너무 많은 방법 이다. 여기, 폴 리-T 구슬 정화 폴 리 A 포함 된 mRNA 사본, 하지만 다양 한 상업적으로 사용 되었다-사용 가능한 rRNA 고갈 키트 mRNA 풍부에도 효과적일 수 있습니다.
여기, S. cerevisiae 유전자 식 응답 저 산소 증으로 특징 이었다. 세포 저 산소 증에 노출 되었고 다음 8 시간 지점에서 샘플링 (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180, 240 분). 재현성을 확인 하 고 통계적으로 변경된 증명서를 확인 하 세 생물 복제 수행 했다. RNA는 기계적 장애 및 열 정화, 추출 하 고 RNA-seq 분석에 대 한 처리. -시퀀싱 파이프라인을 설명 하 고 프로그래밍 스크립트 수 있는 제공 됩니다 분석의 정확한 복제 수행. 특히, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, 24R 통계 환경 그리고 DESeq2 패키지 25 사용 되었다 RNA-seq 데이터를 처리 하 고 기간 동안 크게 변경 607 유전자를 식별 하 저 산소 증입니다. 주성분 분석 (PCA)와 복제의 유전자 발현 기술의 재현성을 표시. 클러스터링 및 heatmaps 유전자 존재론 (가십시오) 분석 많은 세포질 과정, 호 기성 호흡 처럼 풍성 하 게 산소 통제 유전자의 세트에서 보였다 동안 광범위 한 식 속도 론을, 계시 했다.
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Protocol
1. 저 산소 증 유도
- 1 일 이상 hypoxia 시간 코스 하기 전에: 인큐베이터를 준비, 필터링 시스템, 진공, 가스 탱크, 플라스 크, stoppers, 유리 튜브와 튜브, 자료 테이블에서.
- 셀의 빠른 처리에 가까운 근접에서 N2 탱크, 인큐베이터, 진공 및 필터링 시스템을 놓습니다.
- 유리 병에 압력가 마로 소독 구성 요소를 혼합 하 여 살 균 액체 YPD 미디어 (1% 효 모 추출, 2% 펩, 2% 포도 당)을 준비 합니다.
- 인큐베이터에서 플라스 크의 레이아웃을 계획 합니다.
참고: N2 탱크에서 처음 플라스 크는 물 트랩, 두 번째 플라스 크 마지막 시간 포인트가 될 것입니다, 그리고 세 번째 플라스 크 됩니다 두 번째 마지막 시간 포인트 등 최종 물 트랩은 마지막 술병까지. 그림 1 는 플라스 크 사이 순서 및 연결을 보여 줍니다. - 하루 시간 과정 전에 5 mL 액체 YPD 멸 균 시험관 내에서 문화에 효 모 식민지를 예방. 특히, 메 마른 주걱 스틱을 사용 하 여 접시에서 전체 식민지를 선택 합니다. 액체 YPD에 막대기를 배치 하 고 셀의 대부분에에서는 때까지 지팡이 흔들어.
- 30 ° C에서 하룻밤 (~ 16 h) 튜브를 회전 합니다.
참고: 후 16 h wildtype 셀 채도 (~ 108 셀/mL x 2), 매우 흐린 문화 표시를 달성할 것입니다. 다른 긴장 포화를 도달 하는 데 시간이 오래 걸릴 수 있습니다 그리고 단계 1.9.4 같이 분 광 광도 계로 셀 농도 측정 하 여 시험 한다. - 시간 코스의 날, 부 화의 16 h 포화 문화를 희석 후 5 mL를 피펫으로 4 mL를 사용 하 여 1시 50분 하룻밤 문화 메 마른 500 mL 플라스 크 내의 액체 YPD 196 mL로. 30 ° c.에서 4 h ~ 200 rpm에서 떨고와 성장
참고: 4 h 후 wildtype 문화 ~ 1-2 x 107 셀/mL의 중간 로그 농도 도달 한다. - 4 h 인큐베이션 기간 동안 라벨 (대 한 산소와 물 트랩) 플라스 크 및 50 mL 수집 튜브. 위의 단계 1.7에서에서 인큐베이터 hypoxia 시간 과정에 대 한 사용 하지 않으면, 다른 인큐베이터 켜고 설정 30 ° c
-
바로 전에 세포 저 산소 증에 쓰는:
- 2 물 트랩 될 것입니다 살 균 250 mL 플라스 크에 물 50 mL를 추가 합니다.
- 1입력 /3 얼음의 액체 질소와 양동이 50 mL 원심 분리기 튜브를 폴리스 티 렌 거품 랙 잠수함.
- 세포를 수집 하기 위한 필터 시스템을 설정 합니다. 필터 디스크의 가장자리를 터치만 주의 하면서 멸 균 핀셋을 사용 하 여 여과 시스템의 아래쪽 단위에 살 균 필터 디스크를 추가 합니다. 필터 상위 단위 필터 아래쪽 단위에 놓고는 클램프와 함께 보안 시스템으로 제공 합니다. 단단한 물개 및 누설을 아래와 위쪽 단위 정렬 됩니다 있는지 확인 합니다.
- 분 광 광도와 세포 농도 측정 합니다. 분 광 광도 계-~0.2-는 분 광 광도 계에 따라 0.6 사이 세600 의 선형 범위에서 측정 될 수 있도록 세포를 희석.
참고: 하나의 OD600 단위 세포 형태학 및 분 광 광도 계에 따라 107 셀/mL, x 3는. 해당 ~0.33-0.66의 OD600 하 ~ 1-2 x 107 셀/mL의 농도 예정 이다. -
시간 0 예제를 신속 하 게 얻을.
- 진공 튜브와 1000 mL 플라스 크 트랩을 통해 강한 (~ 10 mbar) 진공 필터 시스템을 연결 합니다. 진공을 켭니다. 가기에 문화 (보통 ~ 20 mL)을 부 어 하 고 필터를 통해 끌어올 액체에 대 한 기다릴 (~ 10 s, 진공의 강도 따라).
- 조심 스럽게 깨끗 한 핀셋으로 필터 디스크를 제거 하 고 50ml 원심 분리기 관으로 장소. 즉시에 액체 질소에 빠져들 랙에 원심 분리기 튜브를 놓습니다. 중요 한 것은, 수행 하지 미리 진정 튜브 튜브 폭발로 필터를 삽입 하기 전에.
- 후 > 30 s, 장소 나중 RNA 추출-80 ° C 냉동 고에 관. 각 여과 후 청소 하 고 필터 시스템을 재조립 하십시오. 10 물을 당겨서 시스템 린스 필터 디스크 없이 s. 마지막으로, 닦 고 마른 종이 타월로 시스템.
- 각 플라스 크에 hypoxia의 표시 시간 시점에서 중간 로그 농도 (~ 1-2 x 107 셀/mL)를 도달 하는 다양 한 시간 포인트에 대 한 다른 플라스 크에 4 h 문화를 희석.
주: 표 1 야생-타입 S288C HAP1+ 단일 스트레인에 대 한 사용 된 희석을 보여준다. 각 스트레인이 문화 hypoxic 조건 테스트는 희석을 적절 하 게 조정 하는 것이 좋습니다. - 세포와 미디어는 플라스 크에 추가 됩니다, 일단 취재 술병 마 개 삽입 하는 두 개의 유리 튜브를 포함 하 여 알루미늄 호 일을 교체 합니다.
- 이전 결정 하는 레이아웃에 인큐베이터에는 플라스 크를 놓습니다.
- 그림 1에서 보듯이 안전 하 게 튜브를 연결 합니다.
- 모든 stoppers 플라스 크 구멍으로 단단히 밀어는 확인 하십시오.
- 0 번에 레 귤 레이 터 밸브를 엽니다. 다음 3 L/min 흐름 미터 설정.
참고: 버블링 관찰 됩니다 두 물 플라스 크에 적절 한 가스 흐름을 나타내는. 만약이 모든 마 개는 빡 빡 하 고 튜브가 제대로 연결 된 경우, 확인 하지 않습니다. - 인큐베이터 닫고 ~ 200 rpm 진동 속도 설정 합니다. 타이머를 시작 합니다.
- 각 시간 지점 앞 단계 1.9.3에서에서 위의 설명 대로 필터 시스템을 설정 합니다.
-
(예를 들어, 5 분, 10 분, 등) 각 시간 지점에서 신속 하 게 다음과 같이 셀을 처리 하는 두 사람이 있다:
- 첫 번째 사람: 소유자에서 적절 한 플라스 크를 제거 하 고 (와 함께 유리 튜브 연결) 마 개를 꺼내.
참고:이 나머지 문화 플라스 크의 N2 의 흐름을 깨뜨리지 않을 것 이다 하지만 일시적으로 마지막 물 트랩을 흐름을 끊을 것 이다. - 두 번째 사람: 피펫으로 문화의 1 mL는 베트에 분배 하 고. 이제는 라인의 끝에 마지막 물 트랩 (1 개의 관 및 한 마 개는 과정에서 제거) 문화 플라스 크에서 튜브를 다시 연결 합니다. 1.9.4 단계에서 위에서 설명한 다음, 베트에서 세포 농도 측정 합니다.
- 첫 번째 사람: 진공 여과 시스템으로 문화의 나머지 부분을 부 어 하 고 필터링 및 동결 단계 1.9.5에서에서 위에서 설명한 대로 수행.
- 첫 번째 사람: 소유자에서 적절 한 플라스 크를 제거 하 고 (와 함께 유리 튜브 연결) 마 개를 꺼내.
- 모든 시간 포인트 완료 되 면, N2 가스를 해제 합니다. 먼저는 레 귤 레이 터 및 출시, 압력에 대 한 대기 닫고 흐름 미터를 해제 합니다. 마지막으로 시스템을 분해 하 고 깨끗 한 물 그리고 70% 에탄올으로 모든 재료.
2. RNA 추출
- 자료 테이블에 설명 된 대로 RNA 열 정화에 대 한 실내 버퍼를 준비 합니다.
- 샘플 당 버퍼 RDD의 70 µ L을 DNase 재고 솔루션의 10 µ L을 추가 하 여 작업 솔루션 DNase의 준비 ( 자료 표참조).
- 필터 및 셀-80 ° C 냉동 고에서 포함 된 50 mL 튜브를 제거 하 고 얼음이 해빙 (~ 15 분)에. 얼음에 튜브와 함께 다음 단계를 수행 합니다.
- 라벨 2 mL 스크류 캡 튜브 고 얼음, 각 샘플에 대 한 하나의 튜브에 그들을 놓습니다. 푸 고 구슬 측정을 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 각 튜브를 산 세척 구슬의 ~0.6 mL를 추가 합니다.
- 50 mL 튜브에 차가운 실내 버퍼의 0.6 mL를 추가 합니다.
- 피펫으로 필터에서 셀을 제거 하 고 솔루션에 일시 중지를 아래로. 시키는 필터 필터 솔루션을 담가 합니다 솔루션에 남아 하지 마십시오. 모든 솔루션 제거는 튜브의 벽에 대 한 필터를 집어넣은 피펫으로 팁을 사용 하 여 필터에 흡수.
- 구슬 포함 된 스크류 캡 튜브 50 mL 튜브에서 액체의 모든 전송.
- 비드 밀 균질 화기에 스크류 캡 튜브를 놓고 1 분 동안 실행 합니다.
바로 3 분 동안 얼음에 튜브를 놓습니다. 다시, 튜브는 균질 화기에 놓고 1 분 동안 실행 합니다. - 균질 화기와 5 분 동안 얼음에 장소에서 튜브를 제거 합니다. 구슬 튜브의 하단에 정착 됩니다.
- 실 온에서 단계의 나머지 부분을 수행 합니다.
- 피펫으로, 전송만 lysate (~ 350 µ L), 구슬, 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 피하.
- 최대 속도와 다음 전송은 상쾌한 새로운 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 2 분 동안 Microcentrifuge.
- 70% 에탄올 (200 증거 분자 생물학-학년 에탄올에서 만든)의 1 볼륨을 추가 합니다. Pipetting으로 잘 섞는다.
- 솔루션 및 전송 2 mL 컬렉션 튜브 내부 배치는 RNA 열을 촉진.
- (튜브에 액체) 15 ≥12에서 s, 000 x g 및 흐름을 통해 삭제 분리기
- 열에 버퍼 RW1의 350 µ L를 추가 합니다. 15 ≥12에서 s, 000 x g와 흐름을 통해 삭제에 대 한 원심 분리기.
- 80 µ L을 추가 DNase 나 열 막에 인큐베이션 믹스 (하지 마세요 튜브의 양쪽) 15 분 동안 앉아 있게 하 고.
- 열 버퍼 RW1의 350 µ L를 추가 합니다. 15 ≥12에서 s, 000 x g 와 흐름을 통해 삭제에 대 한 Microcentrifuge.
- 열에 버퍼 RPE의 500 µ L를 추가 합니다. Microcentrifuge 15 ≥12에서 s, 000 x g 및 삭제에 대 한 흐름-통해.
- 열에 버퍼 RPE의 500 µ L를 추가 합니다. ≥12, 000 x g2 분에 대 한 Microcentrifuge.
- 조심 스럽게 열을 제거 하 고 새로운 2 mL 수집 관으로 장소. (완전히 건조 막)에 1 분에 대 한 최고 속도로 Microcentrifuge.
- 컬렉션 튜브를 버리고 고 열 1.5 mL microcentrifuge 관 합니다. 열 막에 RNase 무료 물 30 µ L를 추가 합니다.
- ≥12, 000 x g에서 1 분 동안 microcentrifuging에 의해 열 로부터 RNA을 elute. microcentrifuge에 열을 로드할 때 컬렉션 튜브의 뚜껑 떨어져 뚜껑을 방지 하기 위해 원심 분리기는 회전 방향에 직면 하 고 있는지 확인 합니다.
- 동일한 microcentrifuge 튜브는 열을 유지 하면서 열 막에 RNase 무료 물의 또 다른 30 µ L를 추가 합니다.
- Microcentrifuge ≥12, 000 x g, 1 분에 대 한 최종 eluate 볼륨은 60 µ L.
- -80 ° C 냉동 고에 있는 RNA의 60 µ L을 포함 하는 각 1.5 mL 튜브를 저장 합니다.
3. RNA 농도 품질을 결정
- 자료 테이블에 나열 된 대로 (가) fluorometer, (b) DNA 및 RNA 관련 형광 염료 및 (c) 분석 결과 튜브를 사용 하 여 각 RNA 샘플에서 RNA와 DNA의 농도 측정 합니다. fluorometer와 염료의 지시를 따릅니다.
- 또는, 260에서 UV 분 광 광도 계와 핵 산 농도 측정 nm.
참고: 1.0 A260 읽기는 ~ 40 µ g/mL 단일 가닥 RNA. - 상업적인 핵 산 분석기에 RNA를 실행 하 여 RNA 품질 테스트 ( 자료 표참조)에 표준 포름알데히드/agarose 젤 26또는.
4. RNA-seq 분석
- 총 RNA 주식에서 100 ng / µ L RNase 무료 물에서 RNA의 21 µ L을 확인 합니다. 이 21 µ L의 1 µ L를 사용 하 여 위와 같이 RNA 농도 테스트. 나머지 20 µ L (2 µ g) 총 RNA mRNA 농축에 대 한 외부 시퀀싱 센터, (와 함께 8 개 이상의 바코드 다중화) 가닥 특정 라이브러리 준비 제출 및 시퀀싱 ( 자료 표참조). 또는 로컬 mRNA 농축 및 라이브러리 준비를 수행 하 고 시퀀싱에 대 한 라이브러리를 제출.
- 풀 8 개 이상의 멀티플렉스 샘플 및 다음-세대 시퀀서의 한 차선에 시퀀스.
- 시퀀스 읽기의 모든 포함 된 FASTQ 파일을 다운로드 하 고 해당 인덱스를 읽습니다. 또한, 다중 바코드를 포함 하는 텍스트 파일을 다운로드.
참고: 인덱스 읽기 별도 FASTQ 파일에 존재할 수 있습니다. 하나의 디렉토리에 모든이 파일을 놓습니다. - 여기, "fastq_pipeline.sh", 같은 디렉터리에 제공 하는 셸 스크립트를 놓습니다. 실험 및 컴퓨터 디렉터리에 대 한 적절이 스크립트를 편집 합니다.
참고:이 스크립트는 광범위 한 주석 설명 하는 단계를 포함 합니다. 간단히, 스크립트 품질 읽기 트림, 게놈, 읽기 지도 고 각 샘플에 대 한 유전자 당 읽기 수를 포함 하는 탭 구분 파일을 생성 합니다. - FASTQ 파일 및 원시 읽기 수 데이터 게시 27전에 NCBI의 유전자 식 옴니 버스에 입금. "GEO 제출 높은 처리량 시퀀스 데이터"에 대 한 지침을 따르십시오: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
- R 통계 환경으로 읽기 수 데이터를 가져오고 "time_course_script 여기, 제공 하는 R 스크립트를 사용 하 여 통계 분석을 수행. R "입니다. 실험 및 컴퓨터 디렉터리에 대 한 적절이 스크립트를 편집 합니다.
참고:이 스크립트는 광범위 한 주석 설명 하는 단계를 포함 합니다. 간단히,이 스크립트 읽기 데이터를 가져옵니다, 그리고 읽기도 시간 과정 동안 크게 변경, PCA 분석을 수행 하 고 그래프 선택 된 유전자의 표정을 유전자를 식별 합니다.
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Representative Results
Hypoxia 시간 과정 및 RNA-seq 분석 세 번 독립적으로 수행 했다. 3 복제의 재현성 검사, 유전자 표현 데이터 모든 유전자에 대 한 주요 구성 요소 분석 (PCA)를 사용 하 여 분석 했다. 그림 2 는 샘플 함께의 58.9%를 대표 하는 첫 번째 두 개의 주요 구성 요소를 통해 변경 하는 방법을 보여 줍니다. 이 분석 표시 각 시간 과정 (와 같이 각 곡선의 비슷한 모양) 이와 유사한 변화를 전시. 또한, 마지막 두 복제 첫 번째 복제 하기 보다 서로 게 더 유사 했다. 이것은 마지막 2 개의 복제 첫 번째 복제는 다른 사람 및 일괄 처리에 의해 수행 하는 동안 미디어 구성 요소, 동일한 일괄 처리를 사용 하 여 동일한 사람에 의해 수행 된 사실과 일치. 이 사실 기술과 화학 제품의 높은 재현성을 얻기에 있는 중요 한 요소를 강조 표시 합니다. 마지막으로, PCA 분석 평가 선택한 시간 포인트 캡처 시간 과정 동안 발생 하는 주요 변화 여부에 유용 합니다. 이전 샘플, 유전자 발현, 그리고 작은 변화와 가능성을 에어로빅에서 스위치의 끝을 나타내는 나중 샘플 사이 작은 거리에 큰 변화를 나타내는 사이 더 큰 거리에는 한 복제 곡선에 초점을 맞추고, hypoxic 진 식입니다.
다음으로, R25 에 DESeq2 패키지 시간 0 ( 보충 표 1에서 p-값)에 비해 큰 변화를 보여주는 유전자를 식별 하기 위해 사용 되었다. 이러한 중요 한 유전자, 607 4-fold 이상 변경 ( 보충 표 1에서 배 변화)의. 이 유전자의 표현 패턴 클러스터 했다, 마찬가지로 통제 유전자 했다 함께 그룹화 하 고 히트 맵 (그림 3)에 표시 됩니다. 이 그림 복제에 걸쳐 식 변화는 매우 재현할 수 있습니다. 또한, 유전자 가변 속도 증가 및 감소 식 전시. 많은 유전자에서 30 분, 일시적인 스트레스 응답 13때문일 거 나 피크 증가 전시 합니다.
그림 4 묘사 두 downregulated 및 이전 O2발견 하는 두 개의 upregulated 유전자의 표현-규제. 유전자는 생물 복제 사이 유사한 곡선 reproducibly, 식을 변경합니다. 유전자 복제 사이의 최소 가변성 곡선 겹치는 DAN1, 이다. 가장 변화 된 유전자는 CYC1, 아마도이 유전자의 표정은 자연스럽 게 변수 때문입니다. 이 그림은 또한 큰 배 변화 (최대 1,024-fold) 검색 된 보여 줍니다.
607 O2의 세트에서 풍성 하 게 세포 프로세스를 식별 하려면-규제 유전자, 농축 되었다 이동 기간 수행 (보충 표 2). 예상 했던 대로, 많은 오2-레 귤 레이트 된 유전자 역할 ribosomal 프로세스 13와 세포 호흡, 대사의 다른 측면에서에서.
| 샘플 # | Hypoxia에서 시간 | mL 문화 + mL YPD | ||
| 2 | 5 분 | 20 mL + 0 | ||
| 3 | 10 분 | 20 mL + 0 | ||
| 4 | 30 분 | 20 mL + 0 | ||
| 5 | 60 분 | 10 mL + 10 | ||
| 6 | 120 분 | 10 mL + 10 | ||
| 7 | 180 분 | 5 mL + 15 mL | ||
| 8 | 240 분 | 4 mL + 16 | ||
표 1입니다. 셀 희석 시간 0에서 수행입니다.
이 희석은 실험적으로 N2에 지정 된 시간 후 중간 로그 농도 (1-2 × 107 셀/mL)을 결정 되었습니다.
보조 테이블 1입니다. 식 하 고 모든 유전자에 대 한 통계 데이터입니다.
이 표에서 체계적인 이름, 7 DESeq2 테스트 (즉, 0 분, 0 분, 등대 10 분 대 5 분)에 대 한 조정 된 p 값, 최소 p 값 및 log2 최대 배 변화 조정. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
보조 테이블 2입니다. 가 서 농축 결과 용어.
이 표에서 이동 프로세스, 607 O2의 세트에 그들의 표현-규제 유전자와 게놈에 있는 그들의 표현. 다음, 카이 사각 시험 했다 상당히 이상-또는-표시 아래의 607 유전자의 세트에 이동 용어를 식별 하기 위해 사용 되었다. 가 농축 분석 SGD 28가 슬림 매퍼를 사용 하 여 수행 되었다. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 1입니다. Hypoxia 나중 시간 포인트에 가스 흐름을 방해 하지 않고 복용 시간 포인트에 대 한 설정 했다.
프로토콜에 설명 된 대로 모든 연결 보안, 유지는 것이 중요 하다. 짧은 (9 cm) 오랫동안 (17 cm) 유리 튜브의 위치 note 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2입니다. 주요 구성 요소 분석 (PCA) 3 개의 생물 복제 사이의 관계를 보여 줍니다.
각 곡선 순서에 240 분 샘플을 0 분 있다. 모든 유전자에 대 한 정규화 log2 유전자 발현은 PCA에 사용 되었다. P c 1 총 분산 및 PC2 계정 24.2%의 34.7%를 차지 한다. 검은 선이 첫 번째 복제, 빨간 줄은 두 번째 이며 블루 라인은 세 번째. 화살표 240 분을 지적 하는 데 사용 되는 시간-포인트 서로 다른 샘플에. 주성분 분석 (PCA) R에 포함 된 열에서 유전자와 행 29시간 포인트 log2 변형 매트릭스에 (Q-모드, 또는 단 수 값 분해) prcomp 함수를 사용 하 여 실시 되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3입니다. O2로 607의 식을 보여주는 Heatmap 유전자 식별-규제.
이 유전자 DESeq2 테스트 중 적어도 하나에 고 식 4-fold 이상 변경. 표시 된 로그2(상대 식) 이다. 레드 증가 식 =. 녹색 = 감소 식. 색상의 농도 변화의 정도에 비례 이다. TreeView 30에 있는 heatmap을 만들기 전에 유전자 발현은 k-평균 k 클러스터 클러스터 3.0 3110 =. 아래는 heatmap 키 규모를 보여 줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4입니다. 4 유전자는 3에 시간이 지남에 상대적 mRNA 수준의 복제 합니다.
검은 선이 첫 번째 복제, 빨간 줄은 두 번째 이며 블루 라인은 세 번째. 공통/체계적인 유전자 이름은 CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150C및 NCE103/YNL036W입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 파일 1. fastq_pipeline.sh
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추가 파일 2. time_course_script입니다. R
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Discussion
이 연구에서는 모든 유전자에 대 한 mRNA 수준 효 모 S. cerevisiae에서 hypoxia 동안 측정 되었다. 목표 근처 무산 소 환경에서 증가로 어떻게 세계적인 유전자 표현 변화를 분석 했다. 몇 가지 단계는 여기서 설명 하는 방법을 신중 하 게 제어 하 고 재현할 수 있었다는 촬영 했다. 첫째, 세포는 정확 하 게 정의 된 hypoxic 환경에 노출 되었다: 리치 미디어 (YPD)에서 99.999% N2 . 저 산소 증의 다른 연구 플라스 크 또는 32공기 관 폐쇄, hypoxia 모방 코발트 염화 33, 사용 또는 hypoxia 유도 혐 기성 챔버 또는 가방 34고용. 이러한 각 메서드는 hypoxia 또는 다른 의도 하지 않은 환경 변화에 대 한 다양 한 수준의 발생할 수 있습니다. 그것은 야생 효 모는 덜 가혹한 hypoxic 조건 경험을 가능성이 체계적으로 (예를 들면, 90% N2 와 10% O2), 가스 혼합물을 변화 하는 동안 유전자 발현을 연구 하는 것이 유용할 겁니다. 둘째, ergosterol와 불포화 지방산 (예, 트윈 80) 했다에 추가 되지 문화 미디어는 소개에서 언급 했 듯이 그들은 유전자 발현에 영향 때문. 셋째, 유전자 표정 변화, 성장의 다른 단계에 의해 발생을 최소화 하기 위해 실험적으로-결정 희석 문화 시간 지점에 도달 하면, 그것은 성장 (107 셀/mL x ~ 1-2)의 중간 로그 단계를 수행 했다. 넷째, 빠른 필터링과 냉동 (~ 15 s) 저 산소 증에서 제거 된 셀이 중요, 유전자 표현 변화에서 발생할 수 있습니다 < O2, 세포는 원심 (데이터 표시 되지 않음)에 의해 수집 될 때 발생 하는 노출의 5 분. 셀은 O2 에 노출 되는 시간 성장을 수행 하 고 무산 소 후드 또는 챔버에 셀의 수확 감소 될 수 있습니다. 다섯째, 적절 한 스트레인이이 연구; 대 한 선정 다른 게놈 연구와 일치 하기 위하여는, 일반적인 S288C 실험실 긴장 배경 고용 되었다. 그러나, S288C 긴장 돌연변이 hap1 대립 유전자를 포함 하 고 따라서 수리 11이었다. 이 Hap1 녹음 방송 요인 11통해 O2 레벨에 응답 하는 CYC1 같은 유전자의 연구 허용.
시간 포인트 이전 hypoxia 실험에 큰 유전자 표현 변화를 전시 하는 그들은 때문에 선택 되었다. 여기에 표시 된 결과 미래 실험을 알릴 수 있습니다. 예를 들어 그것 다양 한 활동을 더 세밀 하 게 잡으려고 큰 변화 (예를 들어, 0 ~ 30 분 hypoxia) 표시 간격 동안 시간 포인트의 높은 해상도 사용 하 여 도움이 될 것 이다. 또한, 기간 여기 분석 (즉, 저 산소 증의 4 h) 넘어 나중 시간 점 수도 공개 더 식 변경.
RNA-seq의 재현성 및 넓은 동적 범위 허용 큰 배 변화 18,35의 측정 때문에 mRNA 수준 측정 하 사용 되었다. RNA는 적극적으로 흔들린된 비즈를 사용 하 여 셀의 기계적 장애에 의해 추출 하 고 열에 정화. 다른 RNA 정화 방법 뜨거운 페 놀 36같은 사용 될 수 있습니다. 이상적으로, RNA 농도 200 ng / µ L-1000 ng / µ L 때문에 RNA 농도 반전 녹음 방송 및 라이브러리 준비 100 ng / µ L 희석 될 것 이다의 범위에 있을 것입니다. Fluorometer와 RNA 특정 염료; RNA 농도 측정 한다 UV 분 광 광도 계는 핵 산, RNA와 DNA의 구성의 총 농도 측정 하기 때문에 제한 됩니다. RNA의 품질은 젤 전기 이동 법;에 의해 결정 됩니다. 리보솜 RNA 밴드 젤에 잘 정의 된 고 번짐 RNA 저하를 나타냅니다. 여기, mRNA 사본 풍성 하 게 했다, 그러나 다른 RNA 종류 20 응답에 중요 한 있을 수 있습니다 또한 격리 하기 위한 다양 한 방법이 있다.
8과 12 사이 자원 하기 샘플 다중화 되었고 결과 reproducibly 유전자 당 읽기 수를 결정 하는 충분 한 각 샘플에 대 한 유전자 당 적어도 693 읽기의 평균에 한 차선에 함께 시퀀스. 사실, 이상 12 샘플 가능성이 결과 대부분 유전자의 적절 한 샘플링에 한 차선에 다중화 될 수 있습니다. 유전자 당 읽은 평균을 계산 하기 위해 유전자 (HTSeq 출력 파일)에 매핑된 읽기의 총 수 (이 연구에서 7140) HTSeq를 제공 하는 유전자의 수로 분할 되었다. 한 차선에 다중화 될 수 있는 샘플의 최대 수를 추정할 때 고려 낮은 식 하는 관심의 유전자 (즉, 정규화 최저 계산), 이와 다른 RNA-seq 연구에서 데이터를 사용 하 여. 유전자에 대 한 정규화 된 읽기 수에서 크게 달라질 경우 복제, 다음 읽기 수가 너무 낮은 경우, 적은 샘플 시퀀싱 레인 당 다중화 되어야 한다 제안 수 있습니다.
다음-세대 시퀀싱 읽기 및 다른 정보를 포함 하는 FASTQ 파일을 생성 합니다. 멀티플렉싱, 수행 하는 경우 바코드 파일과 추가 FASTQ 파일 생성 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서 로컬 분석을 위해 이러한 파일을 다운로드할 수 있습니다. 또는, 여러 온라인 다음-gen 시퀀스 분석 도구가 있다 그 명령줄 기능 또는 R.에 익숙하지에 대 한 이와 관련은 (https://usegalaxy.org/) 37 , GenomeSpace (http://www.genomespace.org/) 하는 것이 좋습니다. 현재 프로토콜에서 저자에 의해 작성 된 두 개의 스크립트는 FASTQ 처리 및 식 분석에 사용 됩니다. 스크립트 잘 주석이 있으며 다른 실험적인 디자인 및 컴퓨터 설정에 대 한 편집할 수 있습니다. 또한, "자료" 테이블과 두 개의 스크립트가이 스크립트에서 사용 되는 도구를 다운로드에 대 한 웹사이트를 제공 합니다. 첫 번째 스크립트, "fastq_pipeline.sh", 유닉스/리눅스 터미널에서 커맨드 라인에서 실행 하는 쉘 스크립트 이다. 이 스크립트는 멀티플렉싱 시퀀서, 따라서 그 차선에 각 샘플에 대 한 FASTQ 파일을 생성 한 차선에서 가져온 읽기의 모든 포함 된 원래 FASTQ 파일. 다음, 각 FASTQ 파일에 읽기는 기본 설정 21Trimmomatic를 사용 하 여 손질 하는 품질. 트림 된 읽기 S. cerevisiae S288C 참조 게놈 (SGD R64-1-1_20110203)에 매핑된 다음 기본 설정을 22와 TopHat2를 사용 하 여. 스크립트는 마지막 각 주석된 기능 19에 매핑되는 읽기의 수를 확인 하려면 HTSeq를 사용 합니다.
두 번째 스크립트, "time_course_script. R", 또한 저자에 의해 작성 되었습니다 고 24R 통계 환경 내에서 실행 됩니다. 스크립트 처음으로 수입 HTSeq에 의해 생성 된 읽기 수 데이터입니다. 각 샘플 시간 지점으로 간주 하 고 따라서 다른 시간 포인트를 기준으로 구성 됩니다. 읽기 안됨 다음 차동 (즉, 에어로빅, 시간 0) 첫 번째 상대 시간 포인트에서 표현 되는 유전자를 확인 하기 위해 DESeq2 25, R 패키지로 가져옵니다. 그것의 융통성 때문에 DESeq2 식 시간 13의 기능으로 변경 하는 여부를 같은 다른 통계적 테스트를 수행 하기 위해 사용할 수 있습니다. 또는, RNA-seq에 대 한 패라메트릭 및 비패라메트릭 통계를 사용 하는 다른 도구 읽을 수 데이터 사용된 20일 수 있었다. 스크립트는 다음 각 샘플의 시퀀싱의 정도 대 한 제어를 읽기 수를 정규화 하 고 log2 카운트 변환. 이러한 가공된 읽기는 각 유전자에 대 한 최대 배 변화를 결정 하 고 그래프를 만들는 식 그림 4에서 PCA 분석을 수행 하는 데 사용 됩니다.
중요 한 문제는 hypoxia에 크게 반응 하는 유전자를 식별 하는 통계를 사용 하는 최선의 방법. 시간 과정의 적어도 3 개의 생물 복제는 각 유전자의 자연 변화를 계산 하 고 따라서 hypoxia에 우연히 예상 보다 더 크게 응답 유전자를 결정 하는 데 필요한. 또는, 시간이 지남에, 생물 복제 13,25,,3839없이 응답 유전자를 성공적으로 식별 가능 하다. 이러한 메서드는 주요 단점은 그들이 할 고려 하지 각 유전자의 생물 학적 다양성 이다. 그러나, RNA-seq 복제를 수행 하지 않습니다 경우 개별 유전자 식 변경 수 확인 수행 하 여 여러 생물으로 실시간 정량 Pcr 복제 13.
응답의 여러 시간 포인트를 평가 하 두 가지 주요 이점이 있습니다. 첫째, 앞에서 설명한 ( 그림 2)에서 특히, 같이 시간 과정 식별 여부 추가 시간 포인트는 필요한 활동의 해상도 개선 하기 위해 또는 관찰의 최신 이벤트를 알리는 큰 식 변화를 전시 하는 간격에 응답입니다. 둘째, 시간 과정에는 각 유전자의 표현 활동의 차별화 수 있습니다. 이 응답 하는 동안 특정 시간에 동작 하는 독특한 신호 경로 식별 하는 데 도움이 하 고 개시의 타이밍 및 종료 신호에 대 한 통찰력을 제공 합니다. 특히, 여기 수행한 식 패턴에 의해 유전자의 클러스터링 세트 공동 규제 유전자의 결과. 유전자의 발기인 녹음 방송 요인 유전자 식 변경 될 때 활성화 됩니다 제안 전사 인자 바인딩 사이트를 공유할 수 있습니다.
세포질 응답을 공부, 관찰 된 변화는 이상적으로 자극 (예를 들어, 저 산소 증) 때문에 그리고 다른 실험 변수를 하지. 그러나, 그림 2에서 보듯이, 개별 연구원 또는 미디어 구성 요소 일괄 만들 가변성에 주요 기여 유전자 발현에. 따라서, 이러한 매개 변수는 높은 재현성 및 최소한의 실험적인 변화를 달성 하기 위해 고려 되어야 한다. 실험 변수는 시간이 지남에 따라 변경 가능성이 있기 때문에 가능한 적은 시간 각 복제를 구분 해야 합니다.
결론적으로,이 메서드는 정확 하 게 산소 시간 과정 게놈 넓은 변경 mRNA 수준 (또는 히스톤 수정 또는 단백질 수준 등 기타 이벤트)를 모니터링 하 사용할 수 있습니다. 메서드는 다른 유기 체, 액체 문화에서 성장 될 수 있다 특히 미생물 종에 대 한 적용할 수 있습니다. 이러한 게놈 넓은 시간 코스 분석 세포 형태학, 단백질 활동 및 대사 연구를 보완 합니다. 함께, 이러한 데이터는 세포 응답의 풍부한 지식을 이어질 것입니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
우리는 감사 하는 루이스 Sigler 연구소 기술 자문 및 RNA 라이브러리 준비 및 시퀀싱에 프린스턴 대학에서 통합 게놈 시퀀싱 핵심 시설에 대 한. 이 작품은 M.J.H.에 NIH NIGMS R15GM113187로 웬 대학에서 교부 금에 의해 지원 되었다
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1,000 mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500 mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250 mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4 °C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C. | ||
| 2 mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2 mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
References
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