Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج S. cerevisiae

Published: August 10, 2017 doi: 10.3791/56226
Automatic Translation
1, 2, 2, 2
1Department of Molecular Biology, Rowan School of Osteopathic Medicine, 2Department of Biological Sciences, Rowan University

Summary

نقدم هنا، بروتوكول باستخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لرصد مستويات مرناً على مر الزمن من خلال استجابة الخلايا S. cerevisiae التاكسج. هذا الأسلوب يمكن تكييفها لتحليل التعبير الجيني أثناء أي الاستجابة الخلوية.

Abstract

التغييرات المعقدة في التعبير الجيني التوسط عادة جزءا كبيرا من الاستجابة الخلوية. قد تتغير كل الجينات التعبير مع حركية فريدة الجينات يخضع لتوقيت معين واحد من العديد من المحفزات، مما يشير إلى الممرات أو الآثار الثانوية. من أجل التقاط الجين كامل استخدمت التعبير استجابة لنقص في الخميرة S. cerevisiae، تحليل الحمض النووي الريبي seq لرصد مستويات مرناً لجميع الجينات في أوقات معينة بعد التعرض لنقص. أنشأت نقص نمو الخلايا في الغاز2 ~ 100% N. الأهم من ذلك، خلافا لغيرها من الدراسات التاكسج، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة لا أضيفت إلى وسائل الإعلام لأن تؤثر هذه المستقلبات في التعبير الجيني. وقد اختيرت النقاط الزمنية في نطاق 0-4 ح بعد نقص نظراً لأن تلك الفترة يلتقط التغييرات الرئيسية في التعبير الجيني. في كل مرة نقطة، سجل منتصف التاكسج الزنزانات بسرعة تصفيتها، وتجميد، والحد من التعرض للتغيرات س2 وملازم في التعبير الجيني. مجموع الحمض النووي الريبي المستخرج من الخلايا واستخدامه لإثراء مرناً، ثم حولتها إلى كدنا. من هذا كدنا، تم إنشاء مكتبات متعددة وكانت متسلسلة عينات ثمانية أو أكثر في حارة واحدة من المنظم الجيل القادم. يرد وصف خط أنابيب بعد انتهاء تسلسل، التي تشمل نوعية قاعدة التشذيب، قراءة الخرائط وتحديد عدد القراءات كل الجينات. واستخدمت DESeq2 داخل بيئة التطوير الإحصائي لتحديد الجينات التي تتغير بشكل كبير في أي من النقاط الزمنية التاكسج. وكشف تحليل لثلاثة replicates البيولوجي إمكانية تكرار نتائج عالية، وجينات حركية مختلفة وعدد كبير من المتوقع س2-تنظيم الجينات. هذه الأساليب يمكن استخدامها لدراسة كيفية استجابة خلايا الكائنات الحية المختلفة لنقص على مر الزمن وتكييفها لدراسة التعبير الجيني أثناء الاستجابات الخلوية الأخرى.

Introduction

العديد من الكائنات الحية يستجيب لنقص أو انخفاض س2، بتغيير الجينات التعبير 1،،من23. هذا الرد يساعد على التعامل مع عدم وجود ركيزة حاسمة للتنفس الهوائي وردود الفعل السكروز عدة، ولكن أيضا مع حالة الأكسدة متغيرة 4خلايا. تظهر عدة دراسات ميكرواري أداؤها في S. cerevisiae أن مستويات مرناً لمئات جينات تتغير استجابة لنقص 5،،من67،،من89 , 10 , 11 , 12-في الآونة الأخيرة، تم استخدام تسلسل الحمض النووي الريبي لوصف التغييرات التعبير الجيني مع مرور الوقت من خلال نقص 13. هنا، يتم عرض تفاصيل التجريبية ومناقشتها.

نقص يمكن أن يتحقق بطرق مختلفة، كل منها مستوى مختلف من س2إنتاج. هنا، أنشأت تتدفق باستمرار نقص فائقة عالية النقاء ن2 في قوارير، مما يقلل من [س2] حله فورا مع حركية استنساخه 10. فمن الممكن أن هناك بعض س2 جزيئات الحالية التي تساهم في التعبير الأيض والجينات ولكن هذه البيئة يعتبر جداً قريبة من اللاهوائية. نظراً لغياب س2، لا خلايا الخميرة الهيم biosynthesize، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة 4،،من1214. وهكذا، شملت الدراسات السابقة هذه المستقلبات عندما تنمو الخميرة دون أكسجين 5،،من1015. بيد الكثير من الردود التاكسج هي توسط استنفاد هذه المستقلبات وتجديد لهم ومن ثم عكس التعبير الجيني التاكسج الردود 12،16. أجل تقليد نقص الطبيعية، لم يتم إضافة هذه المستقلبات لوسائل الإعلام. في وقت قصير أن الخلايا قد تعرضت لنقص دون وجود نواتج الأيض الأساسية هذه، كان هناك لا زيادة ملحوظة في موت الخلية (البيانات لا تظهر) ولا استجابة إجهاد طويلة 13.

الاستجابة أيضا يعتمد على السلالة وعن النمط الوراثي. أهمية خاصة الآليلات المنظمين المعروفة من الردود التاكسج 2. الخلفية سلالة S288C المطلوب هو درجة عالية حيث أن نتائج يمكن مقارنتها بغيرها من الدراسات الجينومية تنفيذها مع هذه السلالة. ومع ذلك، يتضمن S288C اليل فقدان لوظيفة جزئية من HAP1 الجينات 17، منظم النسخي حرجة للاستجابة التاكسج. تم إصلاح هذا اليل في S288C wildtype باستخدام نسخة من Σ1278b سلالة الخلفية 11.

التعبير الجيني تعتمد اعتماداً كبيرا على البيئة الخلوية. وهكذا، عند إجراء تحليل مرناً على نطاق الجينوم، المهم الحفاظ على بيئة ثابتة بينما متفاوتة معلمة أخرى مثل الوقت أو الحافز أو الوراثي. لتحقيق نتائج عالية استنساخه، النظر في هذه الممارسات الثلاث للدراسة وجميعها لها replicates البيولوجية أو التقنية. أولاً، experimenter(s) نفسه ينبغي الاضطلاع بهذه الدراسة، حيث قد تختلف الممارسات التقنية عبر المجربون. ثانيا، ينبغي استخدام نفس الدفعة من المكونات في وسائط النمو ككل دفعة بتشكيل مختلف قليلاً يمكن أن يؤثر على التعبير الجيني. ثالثا، للتقليل من آثار دورة الخلية، كل نقطة مرة ينبغي أن يتألف من خلايا غير متزامن في سجل منتصف مرحلة النمو (1-2 × 107 خلايا/مل).

عندما وصف استجابة معقدة مثل الاستجابة التعبير الجيني لنقص، دورة وقت مفيد لتحديد حركية الأحداث المختلفة. وينبغي اختيار النقاط الزمنية المحددة التي سيتم التقاط التغييرات الرئيسية للاستجابة. في هذه الدراسة، لوحظت النقاط الزمنية بين 0 وح 4، لأن التجارب الماضية كشفت عن تغييرات واسعة النطاق في التعبير الجيني خلال هذه الفترة 13.

وكان تسلسل الحمض النووي الريبي لقياس التعبير الجيني العالمي، المستخدمة 18،19. يستخدم هذا الأسلوب تسلسل الجيل القادم لتحديد الوفرة النسبية للنسخة الجينات كل. مقارنة لتحليل الحمض النووي ميكرواري، يسلك تسلسل الحمض النووي الريبي حساسية أعلى (للكشف عن النصوص أقل وفرة)، أكبر مجموعة ديناميكية (لقياس أكبر إضعاف التغييرات) وإمكانية تكرار نتائج متفوقة (أن تتبع بدقة التعبير الجيني على مر الزمن). عادة ما يكون هو الحمض النووي الريبي الخلوية الأكثر الرنا الريباسي قد وضعت أساليب كثيرة لإثراء للحمض النووي الريبي محددة الأنواع 20. هنا، واستخدمت خرز بولي-T لتنقية بولي-A التي تحتوي على نصوص مرناً، على الرغم من مختلف تجارياً-مجموعات استنفاد الرنا الريباسي متاح يمكن أيضا أن تكون فعالة في إثراء مرناً.

هنا، اتسم رد التعبير الجيني S. cerevisiae لنقص. كانت تتعرض لنقص الخلايا وثم أخذ عينات في ثماني نقاط زمنية (0، 5، 10، 30، 60، 120، 180 و 240 دقيقة). للتأكد من إمكانية تكرار نتائج وتحديد النصوص المتغيرة إحصائيا، أجريت ثلاث replicates البيولوجية. الجيش الملكي النيبالي المستخرجة بواسطة تعطيل الميكانيكية وتنقية العمود، وثم تجهيزها لتحليل الحمض النووي الريبي seq. يتم وصف خط الأنابيب بعد انتهاء التسلسل وترد البرمجة النصية التي تسمح لإجراء النسخ المتماثل المحدد من التحليلات. تريموماتيك 21TopHat2 22، هتسيق 23، البيئة الإحصائية ص 24و حزمة DESeq2 25 وعلى وجه التحديد، استخدمت لمعالجة البيانات تسلسل الحمض النووي الريبي وتحديد الجينات 607 التي تغير بشكل ملحوظ خلال نقص. تحليل العنصر الرئيسي (PCA) والتعبير الجيني replicates أشارت إلى إمكانية تكرار نتائج هذا الأسلوب. كشف المجموعات و heatmaps حركية التعبير واسعة النطاق، بينما أظهر التحليل الجيني علم الوجود (GO) أن العديد من العمليات الخلوية، مثل التنفس الهوائي، وهي أثرت في مجموعة الجينات التي تنظم الأكسجين.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-حمل نقص

  1. يوم واحد أو أكثر قبل الدورة نقص الوقت: إعداد الحاضنات، والخلية تصفية نظام الفراغ وخزان الغاز، قوارير، سدادات، الأنابيب الزجاجية، والأنابيب، كما هو الحال في جدول المواد.
  2. مكان N2 دبابة وحاضنة، والفراغ وتصفية النظام على مقربة، لتمكين المعالجة السريعة للخلايا.
  3. تحضير الوسائط YPD سائل معقم (1% "استخراج الخميرة"، ببتون 2%، 2% جلوكوز) بخلط المكونات في زجاجة والتعقيم.
  4. خطة تخطيط قوارير في الحاضنة.
    ملاحظة: من خزان2 N، ستكون قارورة أول فخ مياه، قارورة الثانية ستكون النقطة المرة الأخيرة، قارورة الثالثة سوف تكون النقطة المرة الثانية والأخيرة وهلم جرا حتى قارورة الأخير الذي فخ مياه نهائية. ويبين الشكل 1 بالترتيب واتصالات بين قوارير.
  5. في اليوم السابق أثناء الوقت، تطعيم مستعمرة خميرة إلى ثقافة 5 مل سائل YPD داخل أنبوب اختبار عقيمة. على وجه التحديد، تلتقط مستعمرة كاملة من لوحة باستخدام عصا قضيب عقيمة. ضع العصا في YPD السائلة ويهز العصا حتى معظم الخلايا في التعليق.
  6. تدوير أنابيب عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها (ح ~ 16).
    ملاحظة: بعد ح 16، ستحقق الخلايا wildtype تشبع (~ 2 × 108 خلايا/مل)، وأشارت إلى قيام ثقافة غائم جداً. قد يستغرق وقتاً أطول للوصول إلى التشبع السلالات الأخرى وينبغي اختبار قياس تركيز الخلية مع جهاز المطياف الضوئي، كما هو مبين في الخطوة 1.9.4.
  7. اليوم بالطبع الوقت، بعد ح 16 من الحضانة، تضعف ثقافة مشبعة 01:50 باستخدام بيبيت 5 مل إلى 4 مل من مكان بين عشية وضحاها الثقافة إلى 196 مل من السائل YPD داخل قارورة معقمة 500 مل. تنمو مع الهز ~ 200 لفة في الدقيقة ح 4 في 30 درجة مئوية.
    ملاحظة: بعد ح 4، سيصل إلى ثقافة wildtype تركيز سجل منتصف ~ 1-2 × 107 خلايا/مل.
  8. أثناء الاحتضان ح 4، تسمية قوارير (لنقص المياه والفخاخ) و 50 مل أنابيب جمع. إذا لم يتم استخدام الحاضنة في الخطوة 1، 7 أعلاه لنقص الوقت بالطبع، تشغيل حاضنة أخرى وتعيين إلى 30 درجة مئوية.
  9. قبل تعريض الخلايا لنقص:
    1. إضافة ~ 50 مل من الماء إلى اثنين من قوارير 250 مل العقيمة التي ستكون بمثابة الفخاخ المياه.
    2. تعبئة 1/3 من الثلج دلو مع النتروجين السائل وتغرق رف رغوة البوليسترين بعقد أنابيب الطرد المركزي 50 مل.
    3. إعداد عامل تصفية نظام جمع الخلايا. إضافة قرص تصفية عقيمة على وحدة السفلي منظومة الترشيح باستخدام ملاقط معقمة، مع الحرص على إلا تلمس حواف القرص عامل التصفية. وضع تصفية أعلى وحدة على وحدة أسفل تصفية وقدمت آمنة مع المشابك مع النظام. تأكد من محاذاة وحدات السفلي والعلوي حيث لا يوجد أي تسرب وختم ضيق.
    4. قياس تركيز الخلية مع جهاز المطياف الضوئي. تمييع الخلايا حيث أن ما يمكن أن يقاس في نطاق الخطية من جهاز المطياف الضوئي – OD600 بين ~0.2-0.6، اعتماداً جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: التطوير التنظيمي من600 وحدة هو ~ 3 × 107 خلايا مليلتر، اعتماداً على مورفولوجيا الخلايا وجهاز المطياف الضوئي. ومن المتوقع بتركيز ~ 1-2 × 107 خلايا/مل، المقابلة ل التطوير التنظيمي600 من ~0.33-0.66.
    5. الحصول بسرعة على نموذج الوقت 0.
      1. قم بتوصيل نظام تصفية فراغ قوي (~ 10 [مبر]) عبر أنابيب الشفط وفخ قارورة مل 1,000. بدوره على الفراغ. من أجل الثقافة (عادة ~ 20 مل) إلى أعلى وحدة والانتظار للسائل ليتم سحبها من خلال عامل التصفية (~ 10 ق، تبعاً لقوة الفراغ).
      2. بعناية إزالة القرص عامل التصفية مع ملاقط نظيفة ووضع في أنبوب 50 مل أجهزة الطرد مركزي. فورا وضع أنبوب الطرد المركزي في الرف مغمورة في سائل النيتروجين. الأهم من ذلك، لا قبل البرد الأنابيب قبل إدراج عامل التصفية كما سوف تنفجر الأنابيب.
      3. بعد > 30 ثانية، مكان الأنبوبة في ثلاجة-80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي لاحقاً. بعد كل الترشيح، وتنظيف وإعادة تجميع النظام عامل تصفية. شطف النظام عن طريق سحب المياه من خلال 10 ق دون قرص عامل تصفية. وأخيراً، يمسح الجافة النظام مع منشفة ورقية.
    6. تمييع ثقافة ح 4 في قوارير مختلفة لمختلف النقاط الزمنية، حيث أن كل قارورة يصل إلى تركيز سجل منتصف (~ 1-2 × 107 خلايا/مل) في النقطة الزمنية المشار إليها من نقص.
      ملاحظة: يبين الجدول 1 تخفيف التي استخدمت للضغط فرداني البرية من نوع S288C HAP1+ . من المستحسن اختبار كل سلالة في هذه الظروف الثقافة التاكسج وضبط تخفيف تبعاً لذلك.
    7. حالما تتم إضافة الخلايا ووسائل الإعلام إلى قوارير، استبدال رقائق الألومنيوم تغطي قارورة فتح مع سداده الذي يحتوي على اثنين من أنابيب زجاجية إدراجها.
    8. مكان في قوارير في الحاضنة في تخطيط قرر في وقت سابق.
    9. الاتصال بشكل أمن الأنبوب كما هو مبين في الشكل 1.
    10. التحقق من أن جميع السدادات يتم الضغط محكم في فتحات قارورة.
  10. في الساعة 0، فتح صمام منظم. قم بتعيين مقياس تدفق إلى 3 لتر في الدقيقة.
    ملاحظة: محتدما سيتبع في قوارير الماء على حد سواء، مما يشير إلى تدفق الغاز المناسب. إذا كان هذا ليس هو الحال، تحقق من أن جميع السدادات ضيقة وأنابيب موصولة بشكل صحيح.
  11. إغلاق الحاضنة وتعيين سرعة الهز إلى ~ 200 لفة في الدقيقة. بدء تشغيل جهاز ضبط وقت.
  12. قبل كل نقطة الوقت، إعداد نظام التصفية كما وصف أعلاه في الخطوة 1.9.3.
  13. في كل مرة نقطة (مثلاً، 5 دقائق، 10 دقيقة، إلخ)، وقد شخصين بسرعة عملية الخلايا كما يلي:
    1. الشخص الأول: إزالة قارورة المناسبة من صاحب وإخراج السدادة (مع أنابيب الزجاج المرفقة).
      ملاحظة: هذا لن كسر تدفق ن2 لأي من قوارير الثقافة المتبقية ولكن مؤقتاً كسر التدفق إلى فخ المياه الأخير.
    2. الشخص الثاني: بيبيت 1 مل ثقافة والاستغناء عن في ومبومو. إعادة توصيل الأنابيب من قارورة الثقافة التي الآن في نهاية السطر الأخير مصيدة المياه (أنبوب واحد وإرادة واحدة سداده إزالتها في العملية).. ثم قياس تركيز الخلية في ومبومو، كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.9.4.
    3. أول شخص: صب ما تبقى الثقافة في نظام الترشيح فراغ، ثم قم بإجراء التصفية والتجميد كما هو موضح أعلاه في الخطوة 1.9.5.
  14. عند الانتهاء من جميع النقاط الزمنية، إيقاف الغاز2 ن. قم أولاً بإغلاق الجهة المنظمة والانتظار للضغط من أجل إطلاق سراح ثم إيقاف تدفق متر. وأخيراً، تفكيك النظام وتنظيف جميع المواد مع الماء ومن ثم الإيثانول 70%.

2. استخراج الحمض النووي الريبي

  1. إعداد المخزن المؤقت RLT لتنقية الحمض النووي الريبي العمود، كما هو موضح في الجدول المواد.
  2. يعد إيجاد حل عملي من الدناز بإضافة 10 ميليلتر من الحل الدناز الأسهم إلى 70 ميليلتر من المخزن المؤقت هي كل عينة (انظر الجدول المواد).
  3. إزالة أنابيب 50 مل يحتوي على خلايا من الثلاجة-80 درجة مئوية وعوامل التصفية ووضع على الجليد الذوبان (~ 15 دقيقة). نفذ الخطوات التالية مع أنابيب على الجليد.
  4. قم بتسمية 2 مل أنابيب ملولبة ووضعها على الجليد، وأنبوب واحد لكل عينة. إضافة مل ~0.6 من حمض تغسل حبات لكل أنبوبة، باستخدام أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل لحلج القطن وقياس الخرز.
  5. إضافة 0.6 مل من البرد RLT العازلة للأنابيب 50 مل.
  6. بيبيت صعودا وهبوطاً لإزالة خلايا من تصفية وتعليق إلى الحل. تجنب ترك عامل التصفية تظل في الحل كعامل التصفية سوف أشعة الحل. إزالة كل حل استيعابهم في عامل التصفية باستخدام تلميح بيبيت للضغط على عامل التصفية ضد جدار الأنبوبة.
  7. نقل كل من السائل من أنبوب 50 مل إلى أنابيب ملولبة المحتوية على خرز.
  8. وضع أنابيب ملولبة في الخالطون طاحونة حبة وتشغيلها لمدة دقيقة واحدة.
    فورا بوضع الأنابيب على الجليد لمدة ثلاث دقائق. مرة أخرى، وضع الأنابيب في الخالطون وتشغيل لمدة دقيقة واحدة.
  9. إزالة الأنابيب من الخالطون ومكان على الجليد لمدة 5 دقائق. وسوف تستقر الخرز إلى الجزء السفلي من الأنابيب.
  10. تنفيذ ما تبقى الخطوات في درجة حرارة الغرفة.
  11. مع بيبيت، نقل فقط ليستي (~ 350 ميليلتر)، تجنب الخرز، لأنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
  12. ميكروسينتريفوجي لمدة 2 دقيقة في أقصى سرعة ونقل ثم المادة طافية على أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل جديدة.
  13. إضافة إلى حجم 1 من الإيثانول 70% (مصنوعة من 200 دليل على البيولوجيا الجزيئية-الصف الإيثانول). مزيج جيد من قبل بيبيتينج.
  14. نقل الحل وأي اندفاع إلى عمود الحمض النووي الريبي التي وضعت داخل أنبوب جمع 2 مل.
  15. الطرد المركزي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال (السائل في الأنبوب).
  16. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RW1 للعمود. أجهزة الطرد المركزي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
  17. إضافة ميليلتر 80 الدناز أنا مزيج الحضانة للغشاء العمود (لا تحصل على جانبي الأنبوب) والسماح للجلوس لمدة 15 دقيقة.
  18. إضافة 350 ميليلتر من المخزن المؤقت RW1 للعمود. ميكروسينتريفوجي 15 s في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
  19. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت RPE إلى العمود. ميكروسينتريفوجي 15 ثانية في إيه وان تو، 000 x ز وتجاهل التدفق من خلال.
  20. إضافة 500 ميليلتر من المخزن المؤقت RPE إلى العمود. ميكروسينتريفوجي لمدة 2 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز.
  21. إزالة العمود ووضع في أنبوب جمع 2 مل جديدة بعناية. ميكروسينتريفوجي بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة (لتجف تماما الغشاء).
  22. تجاهل أنبوب جمع ووضع العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل. إضافة 30 ميليلتر من المياه خالية من رناسي للغشاء العمود.
  23. الوت الجيش الملكي النيبالي من العمود قبل ميكروسينتريفوجينج لمدة 1 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز. عند تحميل الأعمدة إلى ميكروسينتريفوجي، تأكد من الأغطية لأنبوب جمع تواجه في اتجاه يدور أجهزة الطرد المركزي، لمنع قطع الأغطية.
  24. إضافة ميليلتر 30 أخرى من المياه خالية من رناسي للغشاء العمود، مع إبقاء العمود في أنبوب ميكروسينتريفوجي نفسه.
  25. ميكروسينتريفوجي لمدة 1 دقيقة في إيه وان تو، 000 x ز، حيث يكون حجم النذرة النهائي 60 ميليلتر.
  26. تخزين كل أنبوبة 1.5 مل تحتوي على 60 ميليلتر من الجيش الملكي النيبالي في الثلاجة-80 درجة مئوية.

3-تحديد تركيز الحمض النووي الريبي والجودة

  1. قياس تركيز الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي في كل عينة من الحمض النووي الريبي، باستخدام فلوروميتير (أ)، (ب) الحمض النووي والجيش الملكي النيبالي على حدة الفلورية الأصباغ وأنابيب (ج) المقايسة، كما هو موضح في الجدول المواد. اتبع الإرشادات في فلوروميتير وفي الأصباغ.
  2. وبدلاً من ذلك، قياس تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية مبلغ 260 نيوتن متر.
    ملاحظة: أن قراءة260 ألف من 1.0 يكافئ ~ 40 ميكروغرام/مل واحد-الذين تقطعت بهم السبل الجيش الملكي النيبالي.
  3. اختبار نوعية الجيش الملكي النيبالي بتشغيل الجيش الملكي النيبالي هو محلل حمض النووي تجاري (انظر الجدول المواد) أو على فورمالدهايد قياسية/[اغروس] هلام 26.

4-الجيش الملكي النيبالي-seq التحليل

  1. من مجموع رصيد الجيش الملكي النيبالي، يشكلون 21 ميليلتر من 100 نانوغرام/ميليلتر الجيش الملكي النيبالي في المياه خالية من رناسي. استخدم 1 ميليلتر من هذا ميليلتر 21 لاختبار تركيز الحمض النووي الريبي المذكورة أعلاه. يقدم المتبقية 20 ميليلتر (2 ميكروغرام) مجموع الجيش الملكي النيبالي مركز تسلسل خارجي لإثراء مرناً، وإعداد مكتبة حبلا على حدة (مع الرموز الشريطية ثمانية أو أكثر للإرسال المتعدد)، والتسلسل (انظر الجدول المواد). وبدلاً من ذلك، محلياً إجراء تخصيب مرناً وإعداد مكتبة، وثم تقدم المكتبة للتسلسل.
  2. تجمع ثمانية أو أكثر من عينات متعدد والتسلسل في حارة واحدة من المنظم الجيل القادم.
  3. تحميل الملف فاستق الذي يحتوي على كل من يقرأ التسلسل ويقرأ الفهرس المطابق. كما أن تحميل الملف النصي الذي يحتوي على الرموز الشريطية تعدد الإرسال.
    ملاحظة: قد تكون موجودة في ملف منفصل فستق يقرأ الفهرس. وضع كل من هذه الملفات في دليل واحد.
  4. ضع شيل المقدمة هنا، "fastq_pipeline.sh"، في نفس الدليل. تحرير البرنامج النصي هذا حسب الاقتضاء للتجربة والدلائل الكمبيوتر.
    ملاحظة: هذا البرنامج النصي يحتوي على شروح مستفيضة شرح الخطوات. وباختصار، نوعية البرنامج النصي الديكورات على ما يلي، والخرائط على ما يلي للجينوم، وينشئ ملف المفصول الذي يحتوي على عدد يقرأ كل الجينات لكل عينة.
  5. إيداع الملفات فستق والبيانات الخام عدد مرات القراءة في "الجامع التعبير الجيني" في نكبي قبل نشر 27. اتبع الإرشادات التي تظهر في "تقديم تسلسل الفائق لبيانات توقعات البيئة العالمية": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
  6. استيراد بيانات عدد مرات القراءة في البيئة الإحصائية في البحث والتطوير وإجراء التحليل الإحصائي، باستخدام البرنامج النصي ص المقدمة هنا، "time_course_script. R ". تحرير البرنامج النصي هذا حسب الاقتضاء للتجربة والدلائل الكمبيوتر.
    ملاحظة: هذا البرنامج النصي يحتوي على شروح مستفيضة شرح الخطوات. باختصار، هذا البرنامج النصي استيراد البيانات القراءة، وطبيعتها على ما يلي، يحدد الجينات التي تغير بشكل ملحوظ خلال الوقت، ويقوم بتحليل محكمة التحكيم الدائمة، والرسوم البيانية الجينات المحددة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نقص وقت الدورة وتحليل الحمض النووي الريبي seq أجريت ثلاث مرات بشكل مستقل. للنظر في إمكانية تكرار نتائج replicates الثلاثة، وقد تم تحليل البيانات التعبير الجيني لجينات كل استخدام تحليل المكونات الرئيسية (PCA). ويبين الشكل 2 كيفية تغيير العينات على المكونات الرئيسية الأولى والثانية، التي تمثل مجتمعة 58.9 في المائة التغير. وأشار هذا التحليل إلى أن يسلك كل دورة الوقت تغيرات مماثلة (كما يصور بشكل مماثل لكل منحنى). وباﻹضافة إلى ذلك، replicates الأخيرين كانت أكثر شبيه ببعضها البعض من تكرار الأولى. وهذا يتسق مع حقيقة أن replicates الأخيرتين كان يؤديها الشخص نفسه باستخدام دفعات نفس مكونات وسائط الإعلام، رغم تكرار الأولى أجرى من قبل شخص آخر ودفعات. ويبرز هذا الاستنتاج أن الاتساق في الأسلوب والمواد الكيميائية يعد عاملاً هاما في الحصول على إمكانية تكرار نتائج عالية. وأخيراً، تحليل محكمة التحكيم الدائمة مفيدة في تقييم ما إذا كانت النقاط الزمنية المختارة التقاط التغيرات الكبرى التي تحدث أثناء وقت. التركيز على منحنى نسخ متماثل واحد، هناك مسافات أكبر بين العينات السابقة، تشير إلى تغييرات كبيرة في التعبير الجيني، وأصغر المسافات بين العينات لاحقاً، مشيراً إلى التغييرات الصغيرة، وربما نهاية التبديل من الهوائي إلى التعبير الجيني التاكسج.

المقبل، استخدمت مجموعة DESeq2 في ص25 لتحديد الجينات تظهر تغيرا كبيرا مقارنة بالوقت 0 (فالقيم في التكميلية الجدول 1). هذه الجينات كبيرة، 607 تغيير أكثر من 4-fold (إضعاف التغييرات في التكميلية الجدول 1). جمعت أنماط التعبير هذه الجينات، حيث أن الجينات تنظم وبالمثل كانت مجمعة معا، وثم يتم عرضها في heatmap (الشكل 3). ويبين هذا الرقم أن التغييرات التعبير استنساخه بدرجة عالية عبر replicates. أيضا، يحمل جينات حركية متغيرة مع كلا من الزيادة والنقصان في التعبير. العديد من الجينات يحمل إلى ذروة زيادة أو إنقاص في 30 دقيقة، احتمالاً بسبب استجابة إجهاد عابر 13.

ويصور الشكل 4 التعبير عن دوونريجولاتيد اثنين واثنين من الجينات أوبريجولاتيد سابقا وتبين أن س2-التنظيم. تغيير الجينات التعبير تكاثر، مع المنحنيات مماثلة بين replicates البيولوجية. هو الجين مع تباين أقل بين replicates DAN1، مع تداخل المنحنيات. الجينات مع أكثر من التقلب هو CYC1، ربما لأن التعبير عن هذا الجين المتغير بطبيعة الحال. كما يوضح هذا الشكل أن حظيرة كبيرة (تصل إلى 1,024-fold) تم الكشف عن التغييرات.

للتعرف على العمليات الخلوية التي أثرت في مجموعة 607 س2-تنظيم الجينات، انتقل مصطلح الإثراء يؤديها (تكميلية الجدول 2). كما هو متوقع، العديد من س2-تنظيم الجينات تلعب دوراً في التنفس الخلوي، جوانب أخرى من عملية التمثيل الغذائي، وفي عمليات ريبوسومال 13.

نموذج # الوقت في نقص الثقافة مل + مل YPD
2 5 دقيقة 20 مل + 0 مل
3 10 دقيقة 20 مل + 0 مل
4 30 دقيقة 20 مل + 0 مل
5 60 دقيقة 10 مل + 10 مل
6 120 دقيقة 10 مل + 10 مل
7 180 دقيقة 5 مل + 15 مل
8 240 دقيقة 4 مل + 16 مل

الجدول 1. تخفيف الخلية يتم في وقت 0.
قد حددت هذه تخفيف تجريبيا ليؤدي إلى تركيز سجل منتصف (1-2 × 107 خلايا/مل) بعد الوقت المشار إليه في ن2.

التكميلية الجدول 1. البيانات الإحصائية لجميع الجينات والتعبير.
يحتوي هذا الجدول على اسم المنهجي، فالقيم المعدلة لسبعة اختبارات DESeq2 (أي، 5 دقيقة مقابل 0 دقيقة، 10 دقيقة مقابل 0 دقيقة، إلخ)، وتعديل الحد الأدنى قيمة p، وتغيير إضعاف الحد الأقصى log2. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

التكميلية الجدول 2. انتقل مصطلح نتائج تخصيب اليورانيوم.
يظهر هذا الجدول عمليات الذهاب وتمثيلها في مجموعة 607 س2-تنظيم الجينات وتمثيلها في الجينوم. ثم، استخدم اختبار chi-square لتحديد شروط الانتقال التي كانت إلى حد كبير أكثر من-أو ممثلة تمثيلاً ناقصاً في مجموعة جينات 607. اذهب وأجرى التحليل الإثراء باستخدام "مخطط سليم" الذهاب في SGD 28. اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Figure 1
الشكل 1. نقص الإعداد لأخذ النقاط الزمنية دون تعطيل تدفق الغاز إلى نقاط زمنية لاحقة.
من المهم أن كافة الاتصالات تبقى آمنة، كما هو موضح في البروتوكول. ملاحظة موقع القصير (9 سم) وأنابيب زجاجية (17 سم) طويلة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الرقم 2. تحليل العنصر الرئيسي (PCA) يبين العلاقة بين Replicates البيولوجية الثلاثة.
وقد كل منحنى 0 دقيقة للعينات 240 دقيقة في النظام. واستخدم التعبير الجيني log2 تطبيع لجميع الجينات في محكمة التحكيم الدائمة. وتستأثر PC1 34.7 في المائة من مجموع الفرق وحسابات PC2 24.2 في المائة. الخط الأسود هو تكرار أول والخط الأحمر هو الثاني وهو الثالث من الخط الأزرق. لاحظ أن تستخدم الأسهم للإشارة إلى 240 دقيقة الوقت-نقطة في عينات مختلفة. أجرى تحليل العنصر الرئيسي (PCA) في البحث والتطوير باستخدام الدالة بركومب (الوضع-Q، أو تحلل قيمة المفرد) على مصفوفة تحويل log2 المحتوية على الجينات في الأعمدة والنقاط الزمنية في صفوف 29. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3. Heatmap عرض التعبير عن 607 التعرف على الجينات كس2-التنظيم.
هذه الجينات كانت كبيرة في واحدة على الأقل من الاختبارات DESeq2 وتغيير التعبير بأكثر من 4-fold. يظهر هو سجل2(التعبير النسبية). أحمر = زيادة التعبير. أخضر = انخفاض التعبير. كثافة اللون يكون متناسباً مع درجة التغير. قبل إنشاء heatmap في TreeView 30، كان التعبير الجيني كوسائل متفاوتة المسافات مع k = 10 في 3.0 الكتلة 31. المفتاح أدناه heatmap يبين الجدول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4. مستويات مرناً النسبي من الجينات الأربعة على مر الزمن في الثلاثة وإنشاء نسخ متماثلة.
الخط الأسود هو تكرار أول والخط الأحمر هو الثاني وهو الثالث من الخط الأزرق. أسماء الجينات المشتركة/المنتظمة هي CYC1/YJR048W، ERG5/YMR015C، DAN1/YJR150C، و NCE103/YNL036W. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الملف 1 من تكميلية. fastq_pipeline.sh
الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

ملف إضافي 2. time_course_script. R
الرجاء انقر هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

في هذه الدراسة، وتم قياس مستويات مرناً لجميع الجينات أثناء نقص في الخميرة S. cerevisiae. وكان الهدف تحليل التغيرات التعبير الجيني العالمي نتيجة للنمو في بيئة تسيطر عليها قرب وصول. اتخذت عدة خطوات لضمان أن الطريقة الموصوفة هنا التي تسيطر عليها بعناية واستنساخه. أولاً، تعرض الخلايا لبيئة التاكسج محددة بدقة: 99.999% N2 في الوسائط الغنية (YPD). وقد أغلقت قارورة أو أنبوب الهواء 32دراسات أخرى من نقص، يستخدم كلوريد الكوبالت نقص mimetic 33أو يعمل يحفز نقص اللاهوائية الدوائر أو أكياس 34. كل من هذه الأساليب قد يؤدي إلى مستويات مختلفة من نقص أو غيرها من التغييرات البيئية غير مقصودة. فإنه سيكون من المفيد لدراسة التعبير الجيني بينما متفاوتة بشكل منهجي خليط الغاز (مثلاً، 90% ن2 و 10% س2)، كالخميرة في البرية من المرجح أن تواجه ظروف التاكسج أقل حادة. وثانيا، ارجوستيرول، والأحماض الدهنية غير المشبعة (مثلاً، توين 80) لم يتم إضافة إلى وسائط الإعلام، والثقافة نظراً لتأثيرها في التعبير الجيني كما ورد في المقدمة. الثالث، لتقليل التغييرات التعبير الجيني الناجمة عن المراحل المختلفة للنمو، تجريبيا يحددها تخفيف أجريت حتى أنه عندما ثقافة وصلت إلى نقطة الزمنية، كان في سجل منتصف مرحلة النمو (~ 1-2 × 107 خلايا/مل). الرابعة، سريعة تصفية وتجميد (~ 15 s) من الخلايا التي تم إزالتها من نقص أمر بالغ الأهمية، كما يمكن أن تحدث تغييرات التعبير الجيني في < 5 دقيقة من التعرض إلى س2، كما يحدث عندما يتم جمع الخلايا بالطرد المركزي (البيانات لا تظهر). يمكن تخفيض الوقت الذي تتعرض الخلايا إلى س2 بأداء النمو والحصاد من الخلايا في وصول هود أو الدائرة. خامسا، اختير سلالة مناسبة لهذه الدراسة؛ أن تكون متسقة مع غيرها من الدراسات الجينومية، كان يعمل في الخلفية سلالة مختبر S288C المشتركة. ومع ذلك، سلالات S288C يحتوي على اليل المسخ hap1 وهكذا تم إصلاحه 11. وهذا يسمح بدراسة الجينات مثل CYC1 التي تستجيب إلى س2 المستويات عن طريق عامل النسخ Hap1 11.

وقد اختيرت النقاط الزمنية نظراً لأنها أظهرت التغييرات تعبير الجينات الكبيرة في التجارب السابقة من نقص. ويمكن إبلاغ النتائج هو موضح هنا تجارب المستقبل. على سبيل المثال، سيكون من المفيد استخدام دقة أعلى من النقاط الزمنية خلال الفترات الزمنية التي تظهر تغييرات كبيرة (مثلاً، نقص 0 إلى 30 دقيقة) لالتقاط أكثر دقة حركية متنوعة. بالإضافة إلى ذلك، أن النقاط الزمنية فيما بعد، إلى ما بعد الفترة الزمنية جزيئي هنا (أي، ح 4 من نقص) قد تكشف كذلك التغييرات التعبير.

واستخدم تسلسل الحمض النووي الريبي لقياس مستويات مرناً لأن لها إمكانية تكرار نتائج ودينامية واسعة تسمح بقياس من حظيرة كبيرة التغييرات 18،35. الجيش الملكي النيبالي المستخرجة بواسطة تعطيل الميكانيكي للخلايا باستخدام الخرز اهتزت بقوة وتنقيته في عمود. ويمكن استخدام أساليب تنقية الحمض النووي الريبي الأخرى، مثل الفينول الساخن 36. ومن الناحية المثالية، سوف يكون تركيز الحمض النووي الريبي في نطاق 200 نانوغرام/ميليلتر-1000 نانوغرام/ميليلتر حيث سوف تضعف تركيز الحمض النووي الريبي إلى 100 نانوغرام/ميليلتر للنسخ العكسي وإعداد المكتبة. وينبغي قياس تركيز الحمض النووي الريبي مع فلوروميتير وصبغ الحمض النووي الريبي على حدة؛ ويقتصر جهاز المطياف الضوئي الأشعة فوق البنفسجية نظراً لأنه يقيس التركيز الكلي للأحماض النووية، تتألف من كل من الجيش الملكي النيبالي والحمض النووي. تتحدد نوعية الجيش الملكي النيبالي بالتفريد جل؛ العصابات الرنا الريباسي يجب أن تكون واضحة المعالم على الجل وتلطيخ يشير إلى تدهور الجيش الملكي النيبالي. هنا، تم إثراء النصوص مرناً، ولكن هناك طرق متنوعة لعزل مختلفة الحمض النووي الريبي أنواع 20 التي قد تكون أيضا هامة في الاستجابة.

لحفظ الموارد، بين 8 و 12 متعدد عينات ومتسلسلة معا في حارة واحدة، أسفر عن متوسط ما يلي على الأقل 693 كل الجينات لكل عينة، كافية لتحديد تكاثر عدد القراءات كل الجينات. في الواقع، يمكن أن يكون متعدد عينات أكثر من 12 في حارة واحدة، يرجح أن أسفر عن أخذ العينات كافية لمعظم الجينات. ولحساب المتوسط يقرأ كل الجينات، كان العدد الإجمالي للقراءة التي تم تعيينها إلى الجينات (في ملف الإخراج هتسيق) مقسوماً على عدد الجينات التي قدمت إلى هتسيق (في هذه الدراسة، 7140). وعند تقدير الحد الأقصى لعدد العينات التي يمكن أن يكون متعدد في حارة واحدة، النظر في جينات اهتمام الذي يحمل التعبير أدنى (أيأدنى تطبيع التهم)، باستخدام البيانات المستمدة من هذه وغيرها من الدراسات تسلسل الحمض النووي الريبي. إذا كانت التهم قراءة تطبيع لجين تختلف بشكل ملحوظ عبر يتطابق، ثم عدد القراءات قد تكون منخفضة للغاية، مما يوحي بأن ينبغي متعدد أقل عينات كل حارة التسلسل.

تسلسل الجيل القادم سوف تولد فستق الملفات التي تحتوي على ما يلي، وغيرها من المعلومات. إذا تم إجراء الإرسال المتعدد، قد إنشاء ملف الرمز شريطي وفستق ملف إضافي. ويمكن تحميل هذه الملفات للتحليل المحلي، كما هو الحال في هذا البروتوكول. بدلاً من ذلك، هناك تسلسل الجيل المقبل على الإنترنت عدة أدوات التحليل لتلك لم تكن مألوفة مع وظائف سطر الأوامر أو ر. وفي هذا الصدد، نوصي بنظام غالاكسي (https://usegalaxy.org/) 37 وجينوميسبيس (http://www.genomespace.org/). في هذا البروتوكول، واثنين من البرامج النصية التي قد كتب صاحبا تستخدم لتحليل المعالجة والتعبير فستق. البرامج النصية هي مشروحة جيدا ويمكن تحريره لتصاميم تجريبية مختلفة وإعدادات الكمبيوتر. أيضا، البرامج النصية اثنين والجدول "مواد" توفير مواقع لتحميل الأدوات المستخدمة في هذه البرامج النصية. السيناريو الأول، "fastq_pipeline.sh"، برنامج نصي shell تشغيل في سطر الأوامر في محطة يونيكس/لينكس. هذا البرنامج النصي مولتيبليكسيس إزالة الملف فستق الأصلية التي تحتوي على كل من القراءات التي تم الحصول عليها من حارة واحدة من المنظم، وبالتالي توليد ملف فستق واحد لكل عينة موجودة في هذا الممر. المقبل، ما يلي: في كل ملف فستق نوعية قلص استخدام تريموماتيك مع الإعدادات الافتراضية 21. ثم يتم تعيين يقرأ المشذبة للجينوم مرجع S288C S. cerevisiae (SGD R64-1-1_20110203) باستخدام TopHat2 مع الإعدادات الافتراضية 22. وأخيراً، يستخدم البرنامج النصي هتسيق لتحديد عدد القراءات يتم تعيينها لكل ميزة المشروح 19.

السيناريو الثاني، "time_course_script. لقد كتب أيضا صاحبا R "، ويتم تشغيلها داخل البيئة الإحصائية ص 24. البرنامج النصي في البداية هي الواردات إلى عدد مرات قراءة البيانات التي تم إنشاؤها بواسطة هتسيق. كل عينة يفترض أن تكون نقطة وقت وهكذا ينقسم بالنسبة إلى النقاط مرة أخرى. ثم يتم استيراد التهم قراءة الخام إلى الحزمة R، DESeq2 25، بغية تحديد الجينات التي يتم التعبير عنها متفاوتاً في أي من النقاط الزمنية بالنسبة للأولى (أي، الهوائية، وقت 0). بسبب مرونتها، يمكن استخدام DESeq2 لإجراء الاختبارات الإحصائية الأخرى، مثل ما إذا كان التعبير يتغير كدالة للزمن 13. وبدلاً من ذلك، أدوات أخرى تستخدم إحصاءات بارامتريه وغير حدودي للجيش الملكي النيبالي seq قراءة بيانات العد يمكن أن تستخدم 20. بضبط البرنامج النصي ثم قراءة التهم إلى عنصر تحكم لدرجة التسلسل لكل عينة، ويحول log2 التهم. وتستخدم هذه القراءات المجهزة لإجراء تحليل محكمة التحكيم الدائمة، لتحديد تجليد-تغيير الحد الأقصى لكل الجينات، وإنشاء الرسوم البيانية التعبير في الشكل 4.

ثمة مسألة هامة أفضل طريقة لاستخدام الإحصاءات لتحديد الجينات التي تستجيب إلى حد كبير إلى نقص. Replicates البيولوجي مالا يقل عن ثلاثة بالطبع الوقت ضرورية لحساب التغير الطبيعي لكل الجينات وهكذا تحديد الجينات التي تستجيب لنقص أكثر كثيرا مما كان متوقعا بالصدفة. وبدلاً من ذلك، فمن الممكن لتحديد الجينات التي تستجيب مع مرور الوقت، دون replicates البيولوجي 13،25،،من3839بنجاح. ويعتبر العيب الرئيسي لهذه الأساليب أن أنها لا تأخذ في الاعتبار التغير البيولوجي لكل الجينات. ومع ذلك، إذا لم يتم إجراء تسلسل الحمض النووي الريبي replicates، التغييرات تعبير الجينات الفردية يمكن التحقق من أن أداء RT-قبكر مع البيولوجية متعددة يتطابق 13.

هناك اثنين من الفوائد الأولية لتقييم متعددة النقاط وقت الاستجابة. أولاً، كما ذكر من قبل (لا سيما في الشكل 2)، يحدد دورة وقت الفواصل نستعرض التغييرات الكبيرة التعبير، إعلام عما إذا كانت النقاط الزمنية الإضافية المطلوبة لتحسين قرار حركية أو لمراقبة أحداث لاحقة استجابة. ثانيا، يسمح دورة وقت التفريق بين حركية التعبير كل الجينات. وهذا يساعد في تحديد مسارات إشارات فريدة من نوعها التي تعمل في أوقات محددة أثناء الاستجابة، ويعطي نظرة ثاقبة توقيت بدء وإنهاء الإشارات. على وجه التحديد، أدى تجميع الجينات بنمط التعبير الذي أجرى من هنا مجموعات من الجينات التنظيم المشترك. قد مشاركة المروجين لمجموعة الجينات موقع ربط عامل نسخ، مما يوحي بأن عامل النسخ يصبح نشطاً عند تغيير الجينات التعبير.

عند دراسة استجابة خلوية، أن التغير الملحوظ مثالي بسبب الحافز (مثلاً، نقص) ولا للمتغيرات التجريبية الأخرى. ومع ذلك، كما يظهر في الشكل 2، الباحث الفردية و/أو الدفعات من عناصر الوسائط تسهم إسهاما كبيرا التقلب في التعبير الجيني. وبالتالي، ينبغي النظر في هذه المعلمات من أجل تحقيق إمكانية تكرار نتائج عالية وتقلب التجريبية الحد الأدنى. أقل وقت ممكن يجب فصل كل تكرار، لأن المتغيرات التجريبية أكثر من المرجح أن تتغير بمرور الوقت.

وفي الختام، يمكن استخدام هذا الأسلوب لدقة رصد التعديلات على نطاق الجينوم في مستويات مرناً (أو أحداث أخرى مثل مستويات البروتين أو تعديلات هيستون) خلال دورة وقت نقص. الطريقة التي يمكن تكييفها للكائنات الأخرى، لا سيما الأنواع الميكروبية التي يمكن زراعتها في ثقافة السائل. وستكمل هذه التحليلات الوقت-الدورة التدريبية على نطاق الجينوم الدراسات مورفولوجيا الخلايا ونشاط البروتين والتمثيل الغذائي. معا، سوف تؤدي هذه البيانات إلى فهم أكثر ثراء من الاستجابة الخلوية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر المعهد لويس Sigler "تسلسل الجينوم التكاملية الأساسية مرفق" في جامعة برينستون للمشورة التقنية وإعداد مكتبة الجيش الملكي النيبالي وتسلسلها. كان يؤيد هذا العمل من المنح المقدمة من جامعة روان، والمعاهد الوطنية للصحة نيجمس R15GM113187 إلى M.J.H.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Enclosed dry incubator Thermo Scientific MaxQ 4000 Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures.
Micro-analysis Filter Holder Millipore XX1002530 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask
Strong vacuum Edwards E-LAB 2 The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here.
1,000 mL flask To act as vacuum trap.
~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in Tygon 38TT Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system.
High-pressure N2 gas tank 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller
Autoclaved 500 mL flask Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain.
Autoclaved 250 mL flasks Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps.
Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) Sterilized with 70% ethanol. One for each flask.
Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes.
~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm Tygon E-3603 One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol.
Sterile filter discs Millipore HAWP02500 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point
Sterile dH2O (~100 mL)
1 mL cuvettes For measuring OD600 (i.e., cell concentration)
50 mL sterile centrifuge tubes One for each time point
Clean and sterile tweezers
liquid nitrogen For freezing cells
acid-washed beads Sigma G8772 Keep at 4 °C for lysing cells
Qiagen RNeasy Mini Kit Qiagen 74104 For RNA column purification
Qiagen RLT buffer Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C.
2 mL collection tubes Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RPE Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
Buffer RW1 Qiagen included in the Qiagen Rneasy Mini Kit
DNase I stock and working solutions Qiagen 79254 The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen.
Buffer RDD Qiagen included in the Qiagen DNase Kit
Ice cold 2 mL screw-cap tubes For lysing cells during RNA extraction
bead mill homogenizer Biospec Mini-Beadbeater-24 112011 Keep in cold room
Bacto Peptone BD DF0118 for liquid YPD media
Bacto Yeast Extract BD DF0886 for liquid YPD media
glucose Fisher D16 for liquid YPD media
Qubit assay tubes Thermo Fisher Q32856 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit Thermo Fisher Q32853 for measuring nucleic acid concentration
Quant-iTTM RNA Assay Kit Thermo Fisher Q32855 for measuring nucleic acid concentration
Qubit Fluorometer Thermo Fisher Q33216 for measuring nucleic acid concentration
Commercial electrophoresis system Agilent Bioanalyzer 2100 for measuring nucleic acid quality
Next-generation sequencer Illumina HiSeq 2500 for sequencing libraries
automated liquid handling system Wafergen Apollo 324 for creating sequencing libraries
PrepX PolyA mRNA Isolation Kit Wafergen 400047 for isolating mRNA from total RNA
PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit Wafergen 400039 for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA
Barcode Splitter https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d
Samtools, which includes the gzip command http://www.htslib.org/download/
Trimmomatic http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic
Bowtie2 (installed before TopHat) http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml
TopHat https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml
HTSeq http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html
R (installed before R Studio) https://cran.rstudio.com
R Studio (free version) https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
  2. Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
  3. Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
  4. Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
  5. Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
  6. Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
  7. Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
  8. Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
  9. Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
  10. Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
  11. Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
  12. Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
  13. Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
  14. Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
  15. Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
  16. Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
  17. Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
  18. Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
  19. Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
  20. Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
  21. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  22. Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
  23. Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
  24. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
  25. Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
  26. Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
  27. Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
  28. Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
  29. Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
  30. Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
  31. Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
  32. Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
  33. Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
  34. Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
  35. Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
  36. Collart, M. A., Oliviero, S., et al. Preparation of yeast RNA. Curr. Prot. Mol. Biol. , (2001).
  37. Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
  38. Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
  39. Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).

Tags

علم الوراثة، العدد 126، اللاهوائية، الهوائية، الترنسكربيتوم، الجيل القادم، وقت الدورة التدريبية، الخميرة
قياس مستويات مرناً على مر الزمن من خلال "الاستجابة" الخميرة التاكسج <em>S. cerevisiae</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., … More

Willis, S. D., Hossian, A. K. M. N., Evans, N., Hickman, M. J. Measuring mRNA Levels Over Time During the Yeast S. cerevisiae Hypoxic Response. J. Vis. Exp. (126), e56226, doi:10.3791/56226 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter