Summary
Hier presenteren we een protocol met behulp van RNA-seq mRNA niveaus volgen na verloop van tijd tijdens de hypoxische reactie van S. cerevisiae cellen. Deze methode kan worden aangepast aan het analyseren van genexpressie tijdens elke cellulaire reactie.
Abstract
Complexe veranderingen in genexpressie bemiddelen doorgaans een groot deel van een cellulaire respons. Elk gen kan expressie met unieke kinetiek veranderen als het gen wordt geregeld door de bijzondere timing van één van de vele prikkels, signalering trajecten of secundaire effecten. Om te vangen van het hele gen werd expressie reactie op hypoxie in de gist S. cerevisiae, RNA-seq analyse gebruikt voor het controleren van de mRNA niveaus van alle genen op specifieke tijdstippen na blootstelling aan hypoxie. Hypoxie werd opgericht door de groeiende cellen in ~ 100% N2 gas. Nog belangrijker is, in tegenstelling tot andere hypoxische studies, zijn ergosterol en onverzadigde vetzuren niet toegevoegd aan de media omdat deze metabolieten genexpressie beïnvloeden. Tijdstippen werden gekozen in de range van 0 - 4 uur na hypoxie omdat die periode de grote wijzigingen in genexpressie vangt. Op elk tijdstip, halverwege log hypoxische cellen werden snel gefilterd en bevroren, beperking van de blootstelling aan O2 en daarmee gepaard gaande wijzigingen in genexpressie. Totaal RNA werd gewonnen uit cellen en gebruikt om te verrijken voor mRNA, die vervolgens werd omgebouwd tot cDNA. Dit cDNA, multiplex bibliotheken zijn gemaakt en acht of meer monsters werden sequenced in één rijstrook van een volgende generatie sequencer. Een pijpleiding na sequencing wordt beschreven, waaronder kwaliteit basis trimmen, lezen toewijzen en het bepalen van het aantal leesbewerkingen per gen. DESeq2 binnen de statistische R-omgeving werd gebruikt om genen die aanzienlijk in één van de hypoxische tijdstippen veranderen te identificeren. Analyse van drie biologische replicatieonderzoeken geopenbaard hoge reproduceerbaarheid, genen van uiteenlopende kinetiek en een groot aantal verwacht O2-genen gereguleerd. Deze methoden kunnen worden gebruikt om te bestuderen hoe de cellen van verschillende organismen reageren op hypoxie na verloop van tijd en aangepast om te bestuderen van genexpressie tijdens andere cellulaire reacties.
Introduction
Veel organismen reageren op hypoxie of lage O2, door gene expression 1,2,3te wijzigen. Dit antwoord helpt cellen omgaan met het ontbreken van een substraat kritisch voor aërobe ademhaling en voor verschillende biosynthetic reacties, maar ook met een veranderende redox staat 4. Verschillende microarray studies uitgevoerd in S. cerevisiae tonen aan dat de mRNA niveaus van honderden genen in reactie op hypoxie 5,6,7,8,9 wijzigen , 10 , 11 , 12. onlangs, RNA-seq gewend was gen expressie wijzigingen na verloop van tijd tijdens hypoxie 13karakteriseren. Hier, de experimentele gegevens worden gepresenteerd en besproken.
Hypoxie kan worden bereikt op verschillende manieren, elk produceren een ander niveau van O2. Hier, hypoxie werd opgericht door voortdurend stroomt ultra-hoge-zuiverheid N2 in kolven, die [O2 verlaagt] ontbonden onmiddellijk met reproduceerbare kinetiek 10. Het is mogelijk dat er sommige O2 moleculen aanwezig die aan metabolisme en gen-expressie bijdragen maar deze omgeving is zeer vlakbij anaërobe beschouwd. Bij gebrek aan O2, kunnen gistcellen niet biosynthesize Heem, ergosterol en onverzadigde vetzuren 4,12,14. Dus, vorige studies hebben opgenomen deze metabolieten bij het kweken van gist zonder zuurstof 5,10,15. Echter, vele hypoxische reacties zijn gemedieerd door uitputting van deze metabolieten en dus het aanvullen van hen keert de hypoxische gen expressie reacties 12,16. Om na te bootsen natuurlijke hypoxie, werden deze metabolieten niet toegevoegd aan de media. In de korte tijd dat cellen werden blootgesteld aan hypoxie zonder de aanwezigheid van deze essentiële metabolieten, was er geen merkbare toename van de dood van de cel (gegevens niet worden weergegeven), noch een langdurige stress reactie 13.
Het antwoord is ook afhankelijk van de spanning en de genotype. Bijzonder belangrijk zijn de allelen van het bekende regulatoren van hypoxische reacties 2. De achtergrond van de stam S288C is zeer gewenst, zodat de resultaten kunnen worden vergeleken met de andere genomic studies uitgevoerd met deze stam. S288C bevat echter een gedeeltelijke verlies-van-functie allel van de HAP1 gen 17, een transcriptionele regelgever die kritisch zijn voor de hypoxische reactie. Dit allel werd hersteld in S288C met behulp van een wildtype kopie van de Σ1278b stam achtergrond 11.
Genexpressie is sterk afhankelijk van de cellulaire omgeving. Dus, bij het uitvoeren van genoom-brede mRNA analyse, het is belangrijk om te handhaven van een constante omgeving terwijl variërend van een andere parameter zoals tijd, stimulans of genotype. Overweeg zeer reproduceerbaar om resultaten te bereiken, deze drie praktijken voor de studie en alle van haar biologische of technische wordt gerepliceerd. Eerst, de dezelfde experimenter(s) moet de studie uitvoeren, aangezien de technische praktijken onderzoekers kunnen verschillen. Ten tweede, dezelfde batch van ingrediënten moet worden gebruikt in de groei-media zoals elke partij heeft een iets andere samenstelling die genexpressie kan beïnvloeden. Ten derde, te minimaliseren celcyclus gevolgen, elk tijdstip moet bestaan uit asynchrone cellen in de mid log fase van groei (1-2 x 107 cellen/mL).
Wanneer karakterisering van een complexe reactie als de gen expressie reactie op hypoxie, is een tijd cursus gunstig voor het bepalen van de kinetiek van diverse evenementen. Specifieke tijdstippen moeten worden gekozen dat zal vangen de grote veranderingen van het antwoord. In deze studie werden tijdstippen tussen 0 en 4 h waargenomen, omdat afgelopen experimenten bleek grootschalige wijzigingen in genexpressie tijdens deze periode 13.
Voor het meten van globale genexpressie, was RNA-seq gebruikte 18,19. Deze methode maakt gebruik van volgende-generatie sequencing om te bepalen van de relatieve overvloed van elke genes transcript. Ten opzichte van DNA microarray analyse, vertoont RNA-seq hogere gevoeligheid (om te detecteren minder overvloedige afschriften), een groter dynamisch bereik (voor het meten van grotere veranderingen van de vouw) en superieure reproduceerbaarheid (te nauwkeurig volgen genexpressie na verloop van tijd). Meestal is de meest cellulaire RNA ribosomaal RNA die zoveel methoden zijn ontwikkeld om te verrijken voor specifieke RNA soorten 20. Hier, kunnen poly-T kralen werden gebruikt voor het zuiveren van poly-A-bevattende mRNA afschriften, hoewel de verschillende commercieel - beschikbare rRNA uitputting kits ook effectief in het mRNA verrijking.
Hier, werd de S. cerevisiae gen expressie reactie op hypoxie gekenmerkt. Cellen werden blootgesteld aan hypoxie en vervolgens bemonsterd op acht tijdstippen (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 en 240 min). Te bevestigen van de reproduceerbaarheid en statistisch gewijzigde afschriften, werden drie biologische replicatieonderzoeken uitgevoerd. RNA was gewonnen door verstoring van de mechanische en zuivering van de kolom en vervolgens verwerkt voor RNA-seq analyse. De pijpleiding na sequencing wordt beschreven en programmering scripts worden verstrekt waarmee exacte replicatie van de analyses uitgevoerd. Specifiek, werden Trimmomatic 21, TopHat2 22HTseq 23, de R statistische milieu 24en de DESeq2 pakket 25 gebruikt om de RNA-seq-gegevens te verwerken en te identificeren 607 genen die aanzienlijk tijdens veranderen Hypoxie. Belangrijkste componenten analyse (PCA) en de expressie van genen voor de duplo's aangegeven de reproduceerbaarheid van de techniek. Clustering en heatmaps bleek brede expressie kinetiek, terwijl gen ontologie (GO) analyse toonde aan dat vele cellulaire processen, zoals aërobe ademhaling, in de reeks van zuurstof-gereglementeerde genen zijn verrijkt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. het induceren van hypoxie
- Een dag of meer voor het tijdsverloop van hypoxie: bereiden de incubator, cel filteren systeem, vacuüm gastank, kolven, stoppers, glazen buizen en slangen, zoals in de Tabel van de materialen.
- Plaats de N2 tank, couveuse, vacuüm en filtering systeem in de nabijheid, om een snelle verwerking van cellen.
- Bereid steriele vloeibare YPD media (1% gist-Extract, 2% pepton, 2% glucose) door het mengen van de componenten in een glazen fles en autoclaaf.
- Plan de lay-out van de kolven in de incubator.
Opmerking: Vanaf de N2 tank, de eerste kolf zullen een water-val zal, de tweede kolf het laatste punt van de tijd, de derde kolf zullen de tijd van de tweede-na-laatste punt en zo verder tot de laatste fles een definitieve water val is. Figuur 1 toont de volgorde en de verbindingen tussen de kolven. - De dag vóór het tijdsverloop, enten een kolonie van de gist in een cultuur van 5 mL vloeistof YPD binnen een steriele reageerbuis. Specifiek, pick-up een volledige kolonie van een plaat met behulp van een steriele applicator stok. Plaats van de stick in de vloeibare YPD en schud de stok totdat allermeest naar de cellen in suspensie zitten.
- Draai de buizen bij 30 ° C's nachts (~ 16 h).
Opmerking: Na 16u, wildtype cellen zullen bereiken verzadiging (~ 2 x 108 cellen/mL), aangegeven door een zwaar bewolkt cultuur. Andere spanningen kunnen langer duren om de verzadiging te bereiken en moeten worden getest door het meten van de concentratie van de cel met een spectrofotometer, zoals aangegeven in stap 1.9.4. - Op de dag van het tijdsverloop, na 16 h van incubatie, Verdun de verzadigde cultuur overnachting 1:50 met behulp van een 5 mL-pipet te plaatsen van de 4 mL cultuur in 196 mL vloeibare YPD binnen een steriele 500 mL-kolf. Groeien met schudden bij ~ 200 omwentelingen per minuut gedurende 4 uur bij 30 ° C.
Opmerking: Na 4 uur, een cultuur van wildtype zal bereiken een half log-concentratie ~ 1-2 x 107 cellen/ml. - Tijdens de 4 uur incubatie, label de kolven (voor hypoxie en water vallen) en de 50 mL collectie buizen. Als de incubator in stap 1.7 hierboven niet voor het tijdsverloop van hypoxie gebruikt wordt, zet de andere incubator en selecteer tot 30 ° C.
-
Net voor het onderwerpen van cellen aan hypoxie:
- Voeg ~ 50 mL water tot twee van de steriele 250 mL kolven die als het water vallen dienen zal.
- Vul 1/3 van een ijs emmer met vloeibare stikstof en dompelen een piepschuim rek voor 50 mL centrifuge buizen.
- Instellen van het filtersysteem voor het verzamelen van cellen. Het toevoegen van een steriel filter-disc in de eenheid van de onderkant van het filtratiesysteem met steriel pincet, voorzichtig te raken alleen de randen van de filter-schijf. Plaats de filter top apparaat op de filter onder eenheid en veilig met de klemmen voorzien van het systeem. Ervoor zorgen dat de onder- en bovenkant eenheden zijn uitgelijnd, zodat er een goede afdichting en geen lekkage.
- De concentratie van de cel meten met een spectrofotometer. Verdun cellen, zodat ze kunnen worden gemeten in het lineaire bereik van de spectrofotometer valt – OD600 tussen ~0.2 - 0.6, afhankelijk van de spectrofotometer valt.
Opmerking: Eén OD600 eenheid is ~ 3 x 107 cellen/mL, afhankelijk van cel morfologie en spectrofotometer. Een concentratie van ~ 1-2 x 107 cellen/mL wordt verwacht, overeenkomt met OD600 van ~0.33 - 0,66. -
Snel verkrijgen het tijd 0-monster.
- Het filtersysteem verbinden met een sterke (~ 10 mbar) vacuüm via vacuüm buizen en een val van de maatkolf van 1000 mL. Schakel in het vacuüm. Giet de cultuur (meestal ~ 20 mL) in het bovenste toestel en wacht tot de vloeistof te worden getrokken door het filter (~ 10 s, afhankelijk van de sterkte van het vacuüm).
- Zorgvuldig Verwijder de filter-schijf met een schone pincet en leg in een centrifugebuis 50 mL. Onmiddellijk plaats de centrifugebuis in het rack ondergedompeld in vloeibare stikstof. Nog belangrijker is, niet vooraf chill de buizen voordat het filter wordt ingevoegd als de buizen zal ontploffen.
- Na > 30 s, plaats de buis in een vriezer-80 ° C voor later RNA extractie. Na elke filtratie, schoon en monteer het filtersysteem. Spoelen van het systeem door te trekken water via voor 10 s zonder een filter schijf. Ten slotte veeg droog het systeem met een papieren handdoek.
- Verdun de 4 h cultuur in verschillende kolven voor de verschillende tijdstippen, zodat elke kolf halverwege log concentratie (~ 1-2 x 107 cellen/mL) op het aangegeven tijdstip van hypoxie bereikt.
Opmerking: Tabel 1 toont verdunningen die werden gebruikt voor de wild-type S288C HAP1+ haploïde stam. Het is aanbevolen om test elke stam in deze hypoxische kweekomstandigheden en de verdunningen dienovereenkomstig aan te passen. - Zodra cellen en media worden toegevoegd aan het kolven, vervangen de aluminiumfolie die betrekking hebben op de kolf openen met een stop met twee glazen buizen ingevoegd.
- Plaats de kolven in de incubator in de lay-out eerder bepaald.
- Veilig sluit de slang zoals afgebeeld in Figuur 1.
- Controleer dat alle de stoppers zich strak geduwd in de kolf openingen.
- Open de klep van de regelgever op moment 0. Vervolgens stelt u de debietmeter aan 3 L/min.
Opmerking: Borrelen zal worden waargenomen in beide kolven van water, met vermelding van de juiste gasstroom. Als dit niet het geval, Controleer of alle stoppers strak zijn en leidingen goed is aangesloten. - Sluit de incubator en zet de schudden snelheid naar ~ 200 rpm. Een timer te starten.
- Instellen voor elk punt van de tijd, het filtersysteem zoals hierboven beschreven in stap 1.9.3.
-
Op elk tijdstip (bijvoorbeeld5 min, 10 min, etc.), hebben twee mensen snel verwerken de cellen als volgt:
- First person: Verwijder de juiste kolf uit de houder en nemen uit de kurk (met glazen buis aangesloten).
Opmerking: Dit zal niet breken de stroom van N2 op elk van de resterende cultuur kolven maar tijdelijk de stroom aan de laatste water val zal breken. - Tweede persoon: Pipet 1 mL van de cultuur en afzien in een cuvet. Sluit de slang uit de cultuur-kolf die is nu aan het einde van de lijn naar de laatste water val (één buis en een stop zal worden verwijderd in het proces.). Vervolgens meten cel concentratie in de meetcel, zoals hierboven beschreven in stap 1.9.4.
- First person: giet het restant van de cultuur in de Vacuüm filtratie-systeem, en voer filtreren en blokkeren zoals hierboven beschreven in stap 1.9.5.
- First person: Verwijder de juiste kolf uit de houder en nemen uit de kurk (met glazen buis aangesloten).
- Wanneer u klaar bent met alle punten van de tijd, uitschakelen het N2 gas. Sluit eerst de regelgever en wachten op de druk om vrij te geven, en schakel de flowmeter. Ten slotte het systeem demonteren en reinigen van alle materialen met water en vervolgens 70% ethanol.
2. RNA extractie
- RLT buffer voor te bereiden voor de zuivering van de kolom van RNA, zoals beschreven in de Tabel van de materialen.
- Bereid een werkende oplossing van DNase door 10 µL van de stockoplossing DNase aan 70 µL van buffer RDD per monster toe te voegen (Zie Materialen tabel).
- Verwijder de 50 mL tubes met filters en cellen uit de diepvries-80 ° C en plaats op ijs te ontdooien (~ 15 min). Voer de volgende stappen met buizen op ijs.
- Label 2 mL schroefdop buizen en plaats ze op het ijs, een buis voor elk monster. Voeg ~0.6 mL zuur gewassen kralen aan elke buis, met behulp van een 1,5 mL microcentrifuge buis te schep en meten van de kralen.
- 0,6 mL koude RLT buffer toevoegen aan de 50 mL tubes.
- Pipetteer op en neer naar cellen verwijderen uit het filter en schorten in oplossing. Vermijd te laten van het filter blijven in de oplossing, zoals het filter van de oplossing opzuigen zal. Verwijder alle oplossing opgenomen in het filter met behulp van het uiteinde van de pipet te knijpen het filter tegen de wand van de buis.
- Overbrengen in alle van de vloeistof uit de tube 50 mL de schroefdop buizen met kralen.
- Plaats de schroefdop buizen in een kraal molen homogenizer en voor één min lopen.
Onmiddellijk plaats de buizen op ijs gedurende drie minuten. Nogmaals, plaats de buizen in de homogenizer en voor één min lopen. - Verwijder de buizen uit de homogenizer en de plaats op het ijs gedurende 5 minuten. De kralen zal regelen naar de onderkant van de buizen.
- Voer de rest van de stappen bij kamertemperatuur.
- Breng met een pipet, alleen de lysate (~ 350 µL), het vermijden van de kralen, tot een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge koker.
- Microcentrifuge voor 2 min op max snelheid en vervolgens transfer het supernatant naar een nieuwe 1,5 mL microcentrifuge buis.
- Voeg 1 deel 70% ethanol (gemaakt van 200 bewijs moleculaire biologie-grade ethanol). Meng goed door pipetteren.
- Overdracht van de oplossing en een overhaaste naar een RNA-kolom die in een tube van 2 mL collectie heeft gebracht.
- Centrifugeer gedurende 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren de doorstroming (de vloeistof in de buis).
- Voeg 350 µL van buffer RW1 toe aan de kolom. Centrifugeer gedurende 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren de doorstroming.
- Voeg 80 µL DNase ik incubatie mix aan de kolom membraan (krijg niet op de zijden van de buis) en laat het zitten gedurende 15 minuten.
- 350 µL van buffer RW1 aan kolom toevoegen. Microcentrifuge voor 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren de doorstroming.
- Voeg toe 500 µL van buffer RPE aan de kolom. Microcentrifuge voor 15 s bij ≥12, 000 x g en negeren doorstroming.
- Voeg toe 500 µL van buffer RPE aan de kolom. Microcentrifuge voor 2 min op ≥12, 000 x g.
- Zorgvuldig de kolom verwijderen en leg in een nieuwe collectie-tube van 2 mL. Microcentrifuge op volle snelheid voor 1 min (om volledig droog het membraan).
- Negeren van de collectie buis en de plaats van de kolom in een tube van 1,5 mL microcentrifuge. 30 µL van RNase-vrij water aan het membraan van de kolom toevoegen.
- Elueer RNA van de kolom door de microcentrifuging voor 1 min op ≥12, 000 x g. Bij het laden van de kolommen in de microcentrifuge, Controleer of dat de deksels van de collectie buis staan in de richting van de centrifuge draait, om te voorkomen dat de deksels af te breken.
- Voeg een andere 30 µL RNase-gratis water naar de kolom membraan, met behoud van de kolom in de dezelfde microcentrifuge buis.
- Microcentrifuge voor 1 min op ≥12, 000 x g, zodat het uiteindelijke eluaat volume 60 µL is.
- Elke 1,5 mL-buis met 60 µL van RNA in de vriezer-80 ° C worden opgeslagen.
3. bepaling van de concentratie van RNA en kwaliteit
- Het meten van de concentratie van RNA en DNA in elk monster van RNA, met behulp van (a) een Fluorimeter, (b) DNA - en RNA-specifieke fluorescerende kleurstoffen en (c) bepaling buizen, zoals vermeld in de Tabel van de materialen. Volg de instructies van de Fluorimeter en de kleurstoffen.
- Als alternatief, het meten van de concentratie van de nucleïnezuur met een UV spectrofotometer vastgesteld op 260 nm.
Opmerking: Een A-260 -lezing van 1.0 komt overeen met ~ 40 µg/mL single-stranded RNA. - Testen van RNA kwaliteit door het uitvoeren van het RNA op een commerciële nucleic acid analyzer (Zie Materialen tabel) of op een standaard formaldehyde/agarose gel 26.
4. RNA-seq analyse
- Uit de totale voorraad van RNA, make-up 21 µL van 100 ng/µL RNA in RNase-gratis water. Gebruik 1 µL van deze 21 µL om te testen de RNA-concentratie als hierboven. De resterende 20 µL (2 µg) totaal RNA naar een externe sequencing center voor mRNA verrijking, strand-specifieke bibliotheek voorbereiding (met acht of meer barcodes voor multiplexing) indienen en sequencing (Zie Materialen tabel). Als alternatief, lokaal het uitvoeren van mRNA verrijking en bibliotheek voorbereiding, en dien de bibliotheek voor het rangschikken.
- Het zwembad van acht of meer multiplexed monsters en volgorde in één rijstrook van een volgende generatie sequencer.
- Download het FASTQ bestand met alle van de reeks luidt en de bijbehorende index leest. Ook het downloaden van het tekstbestand met de multiplex barcodes.
Opmerking: De index leest kunnen aanwezig zijn in een apart FASTQ-bestand. Al deze bestanden in één map plaatsen. - Plaats het shellscript verstrekt hier, "fastq_pipeline.sh", in de zelfde folder. Dit script als geschikt voor het experiment en de computer mappen bewerken.
Opmerking: dit script bevat uitgebreide aantekeningen de stappen uit te leggen. Kortom, de kwaliteit van het script snijdt u het leest, kaarten van de leest aan het genoom en genereert u een tabgescheiden bestand met het aantal leesbewerkingen per gen voor elk monster. - Stort de FASTQ bestanden en gegevens van de rauwe Lees graaf in de NCBI Gene Expression Omnibus vóór publicatie 27. Volg de instructies voor "Indienen high-throughput sequencedata aan GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
- Importeer de gegevens Lees graaf in het R statistische milieu en het uitvoeren van statistische analyse, met behulp van het script dat wordt R geleverd hier, "time_course_script. R". Dit script als geschikt voor het experiment en de computer mappen bewerken.
Opmerking: Dit script bevat uitgebreide aantekeningen de stappen uit te leggen. Kortom, dit script de gelezen gegevens worden geïmporteerd, normaliseert het luidt, identificeert genen die aanzienlijk veranderen in de tijdsverloop, PCA analyse uitgevoerd en grafieken van de expressie van geselecteerde genen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het tijdsverloop van hypoxie en de RNA-seq analyse werden onafhankelijk driemaal uitgevoerd. Om te onderzoeken de reproduceerbaarheid van de drie wordt gerepliceerd, was gen expressie gegevens voor alle genen geanalyseerd met behulp van de belangrijkste componenten analyse (PCA). Figuur 2 toont hoe de monsters veranderen over de eerste twee belangrijkste onderdelen, die samen 58,9% van de variabiliteit vertegenwoordigen. Deze analyse wordt aangegeven dat elke tijdsverloop soortgelijke wijzigingen vertoont (zoals afgebeeld door de soortgelijk vorm van elke curve). Bovendien, leken de laatste twee wordt gerepliceerd meer op elkaar dan te de eerste repliceren. Dit strookt met het feit dat de laatste twee wordt gerepliceerd werden uitgevoerd door dezelfde persoon met behulp van de dezelfde batches van media-onderdelen, terwijl de eerste repliceren werd uitgevoerd door een andere persoon en -batches. Deze bevinding wijst op het feit dat consistentie van techniek en chemicaliën een belangrijke factor is bij het verkrijgen van hoge reproduceerbaarheid. Tot slot, PCA analyse is nuttig bij de beoordeling of de gekozen tijdstippen vangen de grote veranderingen die zich in de tijdsverloop voordoen. Zich te concentreren op één repliceren curve, zijn er grotere afstanden tussen de eerdere monsters, met vermelding van de grote wijzigingen in genexpressie en kleinere afstanden tussen de latere monsters, met vermelding van kleinere veranderingen en mogelijk het einde van de overgang van de aërobe naar hypoxische genexpressie.
Vervolgens werd het DESeq2-pakket in R25 gebruikt om het tonen van een belangrijke wijziging ten opzichte van tijd 0 (p-waarden in de aanvullende tabel 1) genen te identificeren. Van deze belangrijke genen, 607 veranderd meer dan 4-fold (vouw veranderingen in de aanvullende tabel 1). De expressiepatronen van deze genen werden gebundeld, zodat ook-gereglementeerde genen werden gegroepeerd, en vervolgens in een heatmap (Figuur 3 weergegeven). Deze afbeelding ziet u dat de expressie veranderingen zeer reproduceerbaar over wordt gerepliceerd zijn. Genen vertonen ook variabele kinetiek met zowel stijgingen als dalingen in expressie. Vele genen vertonen een piek stijging of daling op 30 min, waarschijnlijk te wijten aan een voorbijgaande stress reactie 13.
Figuur 4 toont de uitdrukking van twee werden en twee upregulated genen eerder gevonden O2-gereglementeerde. De genen wijzigen expressie reproducibly, met soortgelijke curven tussen de biologische wordt gerepliceerd. De gene met de minste variabiliteit tussen de duplo's is DAN1, met overlappende curven. De gene met de meeste variabiliteit is CYC1, wellicht omdat de uitdrukking van dit gen is natuurlijk variabel. Dit cijfer illustreert ook dat grote vouw veranderingen (tot 1,024-fold) werden waargenomen.
Identificeren van de cellulaire processen verrijkt met de set van 607 O2-gereglementeerde genen, GO Term verrijking werd uitgevoerd (aanvullende tabel 2). Zoals verwacht, veel O2-gereglementeerde genen een rol spelen in de cellulaire ademhaling, andere aspecten van het metabolisme, en ribosomal processen 13.
| Voorbeeld # | Tijd in hypoxie | mL cultuur + mL YPD | ||
| 2 | 5 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 3 | 10 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 4 | 30 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 5 | 60 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 6 | 120 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 7 | 180 min | 5 mL + 15 mL | ||
| 8 | 240 min | 4 mL + 16 mL | ||
Tabel 1. Cel verdunningen uitgevoerd op moment 0.
Deze verdunningen zijn experimenteel vastgesteld tot halverwege log concentratie (1-2 × 107 cellen/mL) na de aangegeven tijd in N2.
Aanvullende tabel 1. Meningsuiting en statistischegegevens voor alle genen.
Deze tabel bevat de systematische naam, de aangepaste p-waarde voor zeven DESeq2 tests (dat wil zeggen, 5 min vs. 0 min, 10 min vs. 0 min, etc.), het minimum aangepast p-waarde, en de maximale log2 vouw-verandering. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel 2. Ga Term verrijking resultaten.
Deze tabel toont GO processen, hun vertegenwoordiging in de set van 607 O2-genen en hun vertegenwoordiging in het genoom geregeld. Vervolgens was de Chi-kwadraat-test gebruikt ter identificatie van de GO-termen die aanzienlijk over - of ondervertegenwoordigd in de set van 607 genen werden. Ga verrijking analyse werd uitgevoerd met behulp van GO Slim Mapper op SGD 28. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Figuur 1. Hypoxie Set-up voor de tijdstippen nemen zonder het verstoren van de gasstroom op latere tijdstippen.
Het is belangrijk dat alle verbindingen veilig, blijven zoals beschreven in het protocol. Noteer de locatie van de korte (9 cm) en lange (17 cm) glazen buizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2. Hoofdcomponentenanalyse (PCA) toont de relatie tussen de drie biologische wordt gerepliceerd.
Elke kromme heeft de 0 min aan 240 min samples in volgorde. De genexpressie log2 genormaliseerd voor alle genen werd gebruikt in de partnerschaps-en samenwerkingsovereenkomst. PC1 34,7% van de totale variantie en PC2 rekeningen voor 24,2% bedraagt. De zwarte lijn, is de eerste kopie, de rode lijn is de tweede en de blauwe lijn is het derde. Merk op dat de pijlen worden gebruikt om te wijzen op de 240 min tijd-punt in verschillende monsters. Belangrijkste componenten analyse (PCA) werd uitgevoerd in R met behulp van de functie van de prcomp (Q-modus, of enkelvoud waarde ontleding) op de log2-getransformeerd matrix met genen in kolommen en tijdstippen in rijen 29. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3. Heatmap tonen uitdrukking van de 607 genen geïdentificeerd als O2-gereglementeerde.
Deze genen waren significant in ten minste één van de DESeq2 tests en expressie door meer dan 4-fold veranderd. Logboek2(relatieve expressie) wordt getoond. Rood = verhoogde expressie. Groen = verminderde expressie. Intensiteit van de kleur is evenredig aan de mate van verandering. Voordat u de heatmap in TreeView 30, genexpressie was k-means geclusterd met k = 10 in Cluster 3.0 31. De sleutel onder de heatmap toont de schaal. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4. Relatieve mRNA niveaus van vier genen na verloop van tijd in de drie repliceert.
De zwarte lijn, is de eerste kopie, de rode lijn is de tweede en de blauwe lijn is het derde. Common/systematische gene namen zijn CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C DAN1/YJR150Cen NCE103/YNL036W. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Aanvullende bestand 1. fastq_pipeline.sh
Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende bestand 2. time_course_script. R
Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In deze studie werd de mRNA niveaus voor alle genen gemeten tijdens hypoxie in de gist S. cerevisiae. Het doel was om te analyseren hoe mondiale gen expressie veranderingen als gevolg van de groei in een gecontroleerde, in de buurt van zuurstofvrije omgeving. Verschillende stappen gezet om ervoor te zorgen dat de hier beschreven methode zorgvuldig gecontroleerde en reproduceerbaar was. Eerst, cellen werden blootgesteld aan een duidelijk omschreven hypoxische omgeving: 99,999% N2 in rijke media (YPD). Andere studies van hypoxie hebben afgesloten van de kolf of de buis aan de lucht 32, gebruikt de hypoxie-mimetische kobalt chloride 33, werkzaamheden in loondienst hypoxie-inducerende anaërobe chambers of zakken 34. Elk van deze methoden kan leiden tot uiteenlopende niveaus van hypoxie of andere onbedoelde veranderingen in het milieu. Het zou nuttig zijn te onderzoeken van genexpressie terwijl systematisch variërend van het gasmengsel (bijvoorbeeld90% N2 en 10% O2), zoals gist in het wild zijn waarschijnlijk ervaring minder-ernstige hypoxische voorwaarden. Ten tweede, ergosterol en onverzadigde vetzuren (bijvoorbeeld, Tween 80) waren niet toegevoegd aan de voedingsbodems, aangezien ze invloed genexpressie, zoals besproken in de inleiding. Ten derde bepaald om te minimaliseren van gen expressie veranderingen veroorzaakt door de verschillende fasen van groei, empirisch verdunningen werden uitgevoerd, zodat wanneer een cultuur een tijdstip bereikt, het was in de mid log fase van groei (~ 1-2 x 107 cellen/mL). Vierde, snel filteren en bevriezing (~ 15 s) van cellen die zijn verwijderd uit hypoxie is van cruciaal belang, zoals gen expressie veranderingen kunnen optreden < 5 min van blootstelling aan O2, zoals gebeurt wanneer cellen worden verzameld door middel van centrifugeren (gegevens niet worden weergegeven). De keer dat cellen worden blootgesteld aan O2 kan worden verminderd door het uitvoeren van de groei en het oogsten van cellen in een zuurstofvrije kap of een cupje. Ten vijfde werd een passende stam gekozen voor deze studie; om ze consistent zijn met andere genomic studies, was de gemeenschappelijke S288C lab stam achtergrond werkzaam. Echter de S288C stammen bevat een mutant hap1 -allel en was dus gerepareerde 11. Hierdoor is de studie van genen zoals CYC1 die op O2 niveaus via de Hap1 transcriptie factor 11 reageren.
Tijdstippen werden gekozen omdat ze grote gen expressie veranderingen in vorige hypoxie experimenten vertoonden. De resultaten die hier worden weergegeven kunnen meedelen toekomstige experimenten. Bijvoorbeeld, zou het nuttig zijn om een hogere resolutie tijdstippen tijdens intervallen die grote veranderingen (bijvoorbeeld, 0 tot en met 30 min hypoxie) om meer fijn vangen de uiteenlopende kinetiek Toon gebruiken. Bovendien kunnen latere tijdstippen, buiten de periode vehiculumcontrolegroep hier (dat wil zeggen, 4 h van hypoxie) verder expressie veranderingen onthullen.
RNA-seq werd gebruikt voor het meten van de mRNA niveaus aangezien de reproduceerbaarheid en een breed dynamisch bereik meting van grote vouw wijzigingen 18,35 kunt. RNA werd gewonnen door mechanische verstoring van de cellen met behulp van de krachtig geschud kralen en gezuiverd in een kolom. Andere RNA zuivering methoden kunnen worden gebruikt, zoals hete fenol 36. In het ideale geval zullen de RNA-concentratie in de range van 200 ng/µL - 1000 ng/µL aangezien de RNA-concentratie zullen worden verdund tot 100 ng/µL voor omgekeerde transcriptie en voorbereiding van de bibliotheek. De RNA-concentratie moet worden gemeten met een Fluorimeter en RNA-specifieke kleurstof; een UV spectrofotometer is beperkt omdat het meet de totale concentratie van nucleic zuren, bestaande uit zowel RNA en DNA. De kwaliteit van het RNA wordt bepaald door de Elektroforese van het gel; ribosomaal RNA banden moeten welomschreven op de gel en smeren geeft aan de aantasting van het RNA. Hier, mRNA transcripties werden verrijkt, maar er zijn verschillende methoden voor het isoleren van verschillende RNA typen 20 die ook belangrijk zijn in het antwoord kunnen zijn.
Om op te slaan middelen, tussen 8 en 12 monsters waren multiplexed en sequenced samen in één lane, resulterend in een gemiddelde van ten minste 693 leest per gen voor elk monster, volstaat het te bepalen reproducibly het aantal leesbewerkingen per gen. In feite, kunnen meer dan 12 monsters worden multiplexed in één lane, waarschijnlijk resulterend in passende steekproef van de meeste genen. Ter berekening van dat de gemiddelde leest per gen, was het totale aantal leest die aan genen (in het uitvoerbestand HTSeq toegewezen) gedeeld door het aantal genen (in deze studie, 7140) aan HTSeq verstrekt. Bij de berekening van het maximale aantal monsters dat multiplexed kan worden in één rijstrook, overwegen genen van belang die de laagste expressie vertonen (d.w.z., laagste genormaliseerd telt), met behulp van de gegevens uit dit en andere RNA-seq-studies. Als de genormaliseerde Lees graven voor een gen aanzienlijk varieert wordt gerepliceerd, dan het aantal leest wellicht te laag is, suggereert dat er minder monsters moeten worden multiplexed per sequencing rijstrook.
Volgende-generatie sequencing zal genereren FASTQ bestanden met de leest en andere informatie. Als multiplexing werd uitgevoerd, kunnen een barcode-bestand en een extra FASTQ-bestand worden gegenereerd. Deze bestanden kunnen worden gedownload voor lokale analyse, zoals in dit protocol. Anderzijds zijn er verschillende online volgende-gen volgorde analysehulpmiddelen voor degenen die niet vertrouwd met de opdrachtregelfuncties of R. In dit verband raadzaam het Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 en GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). In het huidige protocol, worden twee scripts die zijn geschreven door de auteurs gebruikt voor FASTQ analyse voor verwerking en expressie. De scripts zijn goed beschreven en kunnen worden bewerkt voor verschillende experimentele designs en computer setups. Ook biedt de twee scripts en de "Materialen" tabel websites voor het downloaden van de hulpprogramma's die in deze scripts worden gebruikt. De eerste script, de "fastq_pipeline.sh", is een shell-script moet worden uitgevoerd op de opdrachtregel in een UNIX/Linux terminal. Dit script-multiplexes het oorspronkelijke FASTQ bestand met alle van de luidt één rijstrook van de sequencer, dus het genereren van een FASTQ bestand voor elk monster aanwezig in die baan verkregen. Vervolgens zijn het luidt in elk FASTQ-bestand kwaliteit getrimd Trimmomatic met standaard instellingen 21. De bijgesneden leest worden vervolgens toegewezen aan de S. cerevisiae S288C referentie genoom (SGD R64-1-1_20110203) TopHat2 met standaard instellingen 22. Ten slotte gebruikt het script HTSeq om te bepalen van het aantal leest die worden toegewezen aan elke geannoteerde functie 19.
Het tweede script, "time_course_script. R", is ook geschreven door de auteurs en wordt uitgevoerd binnen de R statistische milieu 24. Het script aanvankelijk invoer in zijn de Lees graaf gegevens gegenereerd door HTSeq. Elk monster wordt ervan uitgegaan dat de punt van een tijd en dus ten opzichte van de andere tijdstippen wordt georganiseerd. De ruwe Lees graven worden vervolgens geïmporteerd in de R-pakket, DESeq2 25, teneinde de genen die differentieel op elk van de punten van de tijd ten opzichte van de eerste (dat wil zeggen, aerobics, keer 0) worden uitgedrukt. Vanwege de flexibiliteit, kan DESeq2 worden gebruikt voor het uitvoeren van andere statistische tests, zoals of de expressie als functie van tijd 13 verandert. Als alternatief, andere instrumenten met parametrische en niet-parametrische statistiek voor RNA-seq Lees graaf gegevens zou gebruikte 20. Het script vervolgens normaliseert de Lees graven om te bepalen voor de mate van sequencing van elk monster en log2 transformeert de graven. Deze verwerkte leest worden gebruikt voor het uitvoeren van PCA analyse, om te bepalen van de maximale vouw-wijziging voor elk gen, en maken de expressie grafieken in Figuur 4.
Een belangrijke kwestie is hoe het best kunnen tewerkstellen van statistieken om genen die sterk op hypoxie reageren te identificeren. Ten minste drie replicaat-biologische organismen van het tijdsverloop zijn nodig om te berekenen van de natuurlijke variabiliteit van elk gen en dus bepalen genen die op hypoxie belangrijker reageren dan verwacht bij toeval. Anderzijds is het mogelijk met succes om genen te identificeren die na verloop van tijd, zonder biologische replicatieonderzoeken 13,,25,,38,39 reageren. Het belangrijkste nadeel van deze methoden is dat ze doen niet rekening houden met de biologische variabiliteit van elk gen. Echter als RNA-seq replicatieonderzoeken worden niet uitgevoerd, kon individuele gen expressie veranderingen worden gecontroleerd door het uitvoeren van dat Rt-qPCR met meerdere biologische repliceert 13.
Er zijn twee primaire voordelen te beoordelen op meerdere tijdstippen van een antwoord. Eerst, zoals eerder is besproken (vooral in Figuur 2), een tijd cursus identificeert de intervallen vertonen grote expressie veranderingen, informeren of extra tijd punten zijn vereist ter verbetering van de resolutie van de kinetiek of observeren van latere gebeurtenissen van het reactie. Ten tweede, een tijd cursus kunt de differentiatie van de elk gen expressie kinetiek. Dit helpt bij het identificeren van unieke signaalroutes die op bepaalde tijdstippen tijdens de reactie optreden en geeft inzicht in het tijdstip van aanvang en beëindiging van signalering. In het bijzonder resulteerde de clustering van genen door expressiepatroon die hier werd uitgevoerd in sets van co gereglementeerde genen. De initiatiefnemers van een gen mag delen een transcriptie factor binding site, suggereren dat de transcriptiefactor actief wordt als de genen expressie wijzigen.
Bij de studie van een cellulaire respons, is de waargenomen variabiliteit ideaal als gevolg van de prikkel (bijv., hypoxie) en niet aan andere experimentele variabelen. Echter, zoals te zien in Figuur 2, de individuele onderzoeker en/of de partijen van de media-onderdelen maken belangrijke bijdragen aan de variabiliteit in genexpressie. Dus, deze parameters moeten worden overwogen met het oog op hoge reproduceerbaarheid en minimale experimentele variabiliteit. Zo weinig mogelijk tijd moet scheiden elke repliceren, omdat de experimentele variabelen hebben meer kans om te veranderen naarmate de tijd verstrijkt.
Kortom, kan deze methode worden gebruikt te controleren nauwkeurig genoom-brede wijzigingen in mRNA niveaus (of andere evenementen zoals histone modificaties of eiwitniveaus) tijdens een tijdsverloop van hypoxie. De methode kan worden aangepast voor andere organismen, met name microbiële soorten die kunnen worden geteeld in vloeibare cultuur. Dergelijke genoom-brede tijdsverloop analyses zal aanvullen studies van cel morfologie, eiwit activiteit en metabolisme. Samen, zal deze gegevens leiden tot een rijker begrip van een cellulaire respons.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken het Lewis-Sigler Instituut voor integratieve Genomics Sequencing Core faciliteit aan de Princeton Universiteit voor technisch advies en voor RNA bibliotheek voorbereiding en rangschikken. Dit werk werd gesteund door subsidies van Rowan-universiteit en NIH NIGMS R15GM113187 aan M.J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1,000 mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500 mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250 mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4 °C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C. | ||
| 2 mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2 mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
References
- Semenza, G. L. Oxygen sensing, homeostasis, and disease. New Eng. J Med. 365 (6), 537-547 (2011).
- Butler, G. Hypoxia and gene expression in eukaryotic microbes. Annu. Rev. Micro. 67, 291-312 (2013).
- Ratcliffe, P. J. Oxygen sensing and hypoxia signalling pathways in animals: the implications of physiology for cancer. J. Physiol. 591 (Pt 8), 2027-2042 (2013).
- Rosenfeld, E., Beauvoit, B. Role of the non-respiratory pathways in the utilization of molecular oxygen bySaccharomyces cerevisiae. Yeast. 20 (13), 1115-1144 (2003).
- Ter Linde, J. J., et al. Genome-wide transcriptional analysis of aerobic and anaerobic chemostat cultures of Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol. 181 (24), 7409-7413 (1999).
- Ter Linde, J. J., Steensma, H. Y. A microarray-assisted screen for potential Hap1 and Rox1 target genes in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 19 (10), 825-840 (2002).
- Kwast, K. E., et al. Genomic analyses of anaerobically induced genes in Saccharomyces cerevisiae: functional roles of Rox1 and other factors in mediating the anoxic response. J. Bacteriol. 184 (1), 250-265 (2002).
- Becerra, M., et al. The yeast transcriptome in aerobic and hypoxic conditions: effects of hap1, rox1, rox3 and srb10 deletions. Mol. Microbiol. 43 (3), 545-555 (2002).
- Lai, L. -C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Dynamical remodeling of the transcriptome during short-term anaerobiosis in Saccharomyces cerevisiae: differential response and role of Msn2 and/or Msn4 and other factors in galactose and glucose media. Mol. Cell. Biol. 25 (10), 4075-4091 (2005).
- Lai, L. C., Kosorukoff, A. L., Burke, P. V., Kwast, K. E. Metabolic-State-Dependent Remodeling of the Transcriptome in Response to Anoxia and Subsequent Reoxygenation in Saccharomyces cerevisiae. Euk. Cell. 5 (9), 1468-1489 (2006).
- Hickman, M. J., Winston, F. Heme levels switch the function of Hap1 of Saccharomyces cerevisiae between transcriptional activator and transcriptional repressor. Mol. Cell. Biol. 27 (21), 7414-7424 (2007).
- Hickman, M. J., Spatt, D., Winston, F. The Hog1 mitogen-activated protein kinase mediates a hypoxic response in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 188 (2), 325-338 (2011).
- Bendjilali, N., et al. Time-Course Analysis of Gene Expression During the Saccharomyces cerevisiae Hypoxic Response. G3. 7 (1), 221-231 (2017).
- Chellappa, R., et al. The membrane proteins, Spt23p and Mga2p, play distinct roles in the activation of Saccharomyces cerevisiae OLE1 gene expression. Fatty acid-mediated regulation of Mga2p activity is independent of its proteolytic processing into a soluble transcription activator. J. Biol. Chem. 276 (47), 43548-43556 (2001).
- Abramova, N. E., et al. Regulatory mechanisms controlling expression of the DAN/TIR mannoprotein genes during anaerobic remodeling of the cell wall in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (3), 1169-1177 (2001).
- Hughes, A. L., Todd, B. L., Espenshade, P. J. SREBP Pathway Responds to Sterols and Functions as an Oxygen Sensor in Fission Yeast. Cell. 120 (6), 831-842 (2005).
- Gaisne, M., Bécam, A. M., Verdière, J., Herbert, C. J. A "natural" mutation in Saccharomyces cerevisiae strains derived from S288c affects the complex regulatory gene HAP1 (CYP1). Curr. Gen. 36 (4), 195-200 (1999).
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat. Rev. Gen. 10 (1), 57-63 (2009).
- Anders, S., Huber, W. Differential expression analysis for sequence count data. Genome Biol. 11 (10), R106 (2010).
- Conesa, A., et al. A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol. 17 (1), 13 (2016).
- Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinf. 30 (15), 2114-2120 (2014).
- Kim, D., Pertea, G., Trapnell, C., Pimentel, H., Kelley, R., Salzberg, S. L. TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 14 (4), R36 (2013).
- Anders, S., Pyl, P. T., Huber, W. HTSeq--A Python framework to work with high-throughput sequencing data. Bioinf. 31 (2), 166-169 (2015).
- R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna. Available from: https://www.R-project.org (2015).
- Love, M. I., Huber, W., Anders, S. Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol. 15 (12), 550 (2014).
- Brown, T., Mackey, K., Du, T. Analysis of RNA by Northern and Slot Blot Hybridization. Curr. Prot. Mol. Biol. 74, 4.9.1-4.9.19 (2004).
- Edgar, R., Domrachev, M., Lash, A. E. Gene Expression Omnibus: NCBI gene expression and hybridization array data repository. Nuc. Acids Res. 30 (1), 207-210 (2002).
- Cherry, J. M., et al. Saccharomyces Genome Database: the genomics resource of budding yeast. Nuc. Acids Res. 40, D700-D705 (2012).
- Hothorn, T., Everitt, B. S. A Handbook of Statistical Analyses using R. , 3rd ed, CRC Press: Taylor & Francis Group. Boca Raton, FL. (2014).
- Saldanha, A. J. Java Treeview--extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc. Nat. Acad. Sci. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Davies, B. S. J., Rine, J. A Role for Sterol Levels in Oxygen Sensing in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 174 (1), 191-201 (2006).
- Meena, R. C., Kumar, N., Nath, S., Chakrabarti, A. Homologous Recombination is Activated at Early Time Points Following Exposure to Cobalt Chloride Induced Hypoxic Conditions in Saccharomyces cerevisiae. Ind. J. Microb. 52 (2), 209-214 (2012).
- Snoek, I. S. I., Tai, S. L., Pronk, J. T., Yde Steensma, H., Daran, J. -M. Involvement of Snf7p and Rim101p in the transcriptional regulation of TIR1 and other anaerobically upregulated genes in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Res. 10 (4), 367-384 (2010).
- Ellahi, A., Thurtle, D. M., Rine, J. The Chromatin and Transcriptional Landscape of Native Saccharomyces cerevisiae Telomeres and Subtelomeric Domains. Genetics. 200 (2), 505-521 (2015).
- Collart, M. A., Oliviero, S., et al.
- Blankenberg, D., et al. Manipulation of FASTQ data with Galaxy. Bioinf. 24 (14), 1783-1785 (2010).
- Martini, P., et al. timeClip: pathway analysis for time course data without replicates. BMC Bioinf. 15, Suppl 5. (2014).
- Oh, S., Song, S., Grabowski, G., Zhao, H., Noonan, J. P. Time series expression analyses using RNA-seq: a statistical approach. BioMed Res. Int. 2013, 1-16 (2013).
