Summary
Aqui, apresentamos um protocolo utilizando RNA-seq para monitorar os níveis do mRNA ao longo do tempo durante a hipoxia resposta das células de S. cerevisiae . Esse método pode ser adaptado para analisar a expressão gênica durante qualquer resposta celular.
Abstract
Complexas mudanças na expressão gênica tipicamente mediam uma grande parcela de uma resposta celular. Cada gene pode alterar a expressão com cinética original como o gene é regulamentado pelo sincronismo particular de um dos muitos estímulos, sinalização de percursos ou efeitos secundários. A fim de capturar o gene todo resposta de expressão à hipoxia em levedura S. cerevisiae, análise de RNA-seq foi usada para monitorizar os níveis de mRNA de genes todos em horários específicos, após a exposição à hipoxia. Hipóxia foi estabelecida pelo crescimento de células de gás de2 ~ 100% N. Importante, ao contrário de outros estudos hipóxicos, ergosterol e ácidos graxos insaturados não foram adicionados para a mídia porque estes metabólitos afetam a expressão genética. Pontos de tempo foram escolhidos na faixa de 0 - 4 h após hipoxia porque esse período captura as grandes mudanças na expressão gênica. Em cada ponto de tempo, mid log hipóxicos células foram rapidamente filtrada e congelado, limitar a exposição ao2 e concomitante as mudanças na expressão gênica. O RNA total foi extraído de células e usado para enriquecer para mRNA, que depois foi convertido em cDNA. A partir deste cDNA, multiplex bibliotecas foram criadas e oito ou mais amostras foram sequenciadas em uma pista de um sequenciador de última geração. Um pipeline pós-sequenciamento é descrito, que inclui o aparamento de base de qualidade, ler o mapeamento e determinar o número de leituras por gene. DESeq2 dentro do ambiente de estatística R foi usado para identificar genes que alteram significativamente em qualquer um dos pontos de tempo hipóxica. A análise de três réplicas biológicas revelou grande reprodutibilidade, genes da cinética diferente e um grande número de esperado O2-regulado genes. Esses métodos podem ser usados para estudar como as células de vários organismos respondem à hipoxia ao longo do tempo e adaptados para estudar a expressão gênica durante outras respostas celulares.
Introduction
Muitos organismos respondem a hipoxia, ou O baixo2, alterando a expressão de gene a 1,2,3. Esta resposta ajuda a lidar com a falta de um substrato fundamental para a respiração aeróbia e para diversas reações biossintéticas, mas também com uma mudança de estado redox 4células. Vários estudos de microarray, realizados em S. cerevisiae mostram que os níveis de RNAm de centenas de genes mudam em resposta a hipóxia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq era usado para caracterizar as mudanças de expressão do gene ao longo do tempo durante a hipóxia 13. Aqui, os detalhes experimentais são apresentados e discutidos.
Hipóxia pode ser conseguida de várias maneiras, cada uma produzindo um nível diferente de O2. Aqui, hipóxia foi estabelecida por continuamente fluindo ultra-alta-pureza N2 balões, que reduz a [O2] imediatamente dissolvido com cinética reprodutíveis 10. É possível que há algumas2 moléculas O presentes que contribuem para a expressão de gene e metabolismo, mas este ambiente é considerado muito perto anaeróbica. Na ausência de O2, as células de levedura não heme biossintetize, ergosterol e ácidos graxos insaturados 4,12,14. Assim, estudos anteriores incluíram estes metabólitos quando crescer o fermento sem oxigênio 5,10,15. No entanto, muitas respostas hipóxicos são mediadas por esgotamento destes metabolitos e assim reabastecer os inverte o gene hipóxica expressão respostas 12,16. Para imitar a hipóxia natural, estes metabólitos não foram adicionados aos meios de comunicação. No pouco tempo que as células foram expostas a hipóxia sem a presença desses metabólitos essenciais, não havia nenhum aumento perceptível na morte celular (dados não mostrados) nem uma resposta de estresse prolongado 13.
A resposta também é dependente da cepa e o seu genótipo. Especialmente importantes são os alelos dos reguladores conhecidos do hipóxica respostas 2. O fundo de tensão S288C é altamente desejado para que os resultados podem ser comparados a outros estudos genômicos realizados com esta estirpe. No entanto, o S288C contém um alelo de perda-de-função parcial do HAP1 gene 17, um regulador transcricional crítico para a resposta a hipoxia. Este alelo foi reparado em S288C utilizando uma sua cópia do Σ1278b Coe fundo 11.
Expressão gênica é altamente dependente do ambiente celular. Assim, ao realizar a análise do mRNA de todo o genoma, é importante manter um ambiente de constante ao mesmo tempo variando de outro parâmetro como tempo, estímulo ou genótipo. Para alcançar resultados altamente reprodutíveis, considere estas três práticas para o estudo e todas suas réplicas biológicas ou técnicas. Em primeiro lugar, a mesma experimenter(s) deve realizar o estudo, desde que as práticas técnicas podem variar entre experimentadores. Em segundo lugar, o mesmo lote dos ingredientes deve ser usado nos meios de comunicação de crescimento como cada lote tem uma composição ligeiramente diferente que pode afetar a expressão do gene. Em terceiro lugar, para minimizar os efeitos do ciclo celular, cada ponto de tempo deve consistir de células assíncronas na fase log de média de crescimento (1-2 x 107 células/mL).
Quando caracterizando uma resposta complexa como a expressão de gene resposta à hipoxia, um curso de tempo é vantajoso para determinar a cinética de diversos eventos. Pontos de tempo específico devem ser escolhidos que irá capturar as principais alterações da resposta. Neste estudo, foram observados pontos de tempo entre 0 e 4 h, porque experiências passadas revelaram generalizadas alterações na expressão gênica durante este período 13.
Para medir a expressão gênica global, RNA-seq foi usado 18,19. Este método usa o sequenciamento de última geração para determinar a abundância relativa de transcrição do gene cada. Em comparação com análise de microarray de DNA, RNA-seq apresenta maior sensibilidade (para detectar menos abundantes transcrições), uma maior gama dinâmica (para medir alterações maiores de dobra) e reprodutibilidade superior (para seguir com precisão a expressão gênica ao longo do tempo). Normalmente, o RNA celular mais é RNA ribossomal, que muitos métodos têm sido desenvolvidos para enriquecer específicas do RNA espécie 20. Aqui, grânulos de poli-T foram utilizados para purificar A poli-contendo transcrições de mRNA, embora os diversos comercialmente - disponíveis kits de depleção de rRNA podem também ser eficazes no enriquecimento do mRNA.
Caracterizou-se aqui, a resposta de expressão do gene de S. cerevisiae à hipoxia. As células foram expostas à hipoxia e então amostradas em oito pontos de tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Para confirmar a reprodutibilidade e identificar estatisticamente alteradas transcrições, realizaram-se três repetições biológicas. RNA foi extraído por ruptura mecânica e purificação da coluna e processado para análise de RNA-seq. Pós-sequenciamento pipeline é descrito e scripts de programação são fornecidos que permitem a replicação exata das análises realizadas. Especificamente, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, o ambiente estatístico R 24e o pacote de DESeq2 25 foram usados para processar os dados de RNA-seq e identificar 607 genes que mudam significativamente durante hipóxia. Análise de componentes principais (PCA) e expressão gênica das repetições indicaram a reprodutibilidade da técnica. Clustering e heatmaps revelou cinética de expressão abrangente, enquanto a análise do gene ontology (GO) mostrou que muitos processos celulares, como a respiração aeróbia, são enriquecidos no conjunto de genes regulados de oxigênio.
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Protocol
1. indução de hipóxia
- Um dia ou mais antes do curso do tempo de hipoxia: preparar a incubadora, célula de filtragem sistema, vácuo, tanque de gasolina, balões, rolhas, tubos de vidro e tubos, como a Tabela de materiais.
- Coloque o tanque de2 N, incubadora, sistema de vácuo e filtragem nas proximidades, para permitir o processamento rápido das células.
- Prepare a mídia YPD líquida estéril (1% de extracto de levedura, peptona de 2%, 2% de glicose) misturando os componentes em um frasco de vidro e autoclave.
- Planeje o layout dos balões na incubadora.
Nota: O tanque de2 N, o primeiro balão será uma armadilha de água, o segundo frasco será o último ponto de tempo, o terceiro frasco será o tempo do segundo para o último ponto e assim por diante até o último frasco que é uma armadilha de água final. A Figura 1 mostra a ordem e as conexões entre os frascos. - O dia antes do curso do tempo, inocule uma colônia de levedura em uma cultura de 5 mL de YPD líquido dentro de um tubo de ensaio estéril. Especificamente, pega uma colônia cheia de uma placa utilizando uma ansa esterilizada. Coloque o stick no líquido YPD e apertar o pau até que a maioria das células em suspensão.
- Gire os tubos a 30 ° C durante a noite (~ 16 h).
Nota: Após 16 h, sua células vão atingir saturação (~ 2 x 108 células/mL), indicada por uma cultura muito nublada. Outras cepas podem levar mais tempo para atingir a saturação e devem ser testadas por medir a concentração de células com um espectrofotômetro, conforme indicado no passo 1.9.4. - No dia do curso de tempo, depois de 16 h de incubação, diluir a cultura saturada 01:50, usando uma pipeta de 5 mL para colocar 4 mL de pernoite cultura em 196 mL de YPD líquido dentro de um frasco estéril 500 mL. Crescer com agitação a ~ 200 rpm por 4 h a 30 ° C.
Nota: Após 4 h, a sua cultura vai chegar a uma concentração de registro médio de ~ 1-2 x 107 células/mL. - Durante a incubação de 4 h, Rotule os frascos (para armadilhas de hipóxia e água) e os 50 mL tubos de colheita. Se a incubadora na etapa 1.7 acima não é usada para o curso de tempo de hipóxia, ligue a outra incubadora e definir a 30 ° C.
-
Antes de submeter as células a hipóxia:
- Adicione ~ 50 mL de água para dois dos frascos 250ml estéril que servirão as armadilhas de água.
- Encha 1/3 de um gelo balde com nitrogênio líquido e mergulhe um rack de espuma de poliestireno para segurar tubos de centrífuga de 50 mL.
- Configure o sistema de filtro para a coleta de células. Adicione um disco de filtro estéril para a unidade inferior do sistema de filtração, usando uma pinça estéril, tendo o cuidado de só tocar as bordas do disco filtro. Coloque a unidade de filtro superior na unidade inferior do filtro e prenda com os grampos fornecidos com o sistema. Certifique-se de que as unidades inferior e superior são alinhadas para que haja um selo apertado e nenhum escapamento.
- Medir a concentração de células com um espectrofotômetro. Dilua as células para que eles podem ser medidos na escala linear do espectrofotómetro – OD600 entre ~0.2 - 0.6, dependendo do espectrofotómetro.
Nota: Uma unidade de600 OD é ~ 3 x 107 células/mL, dependendo da morfologia celular e Espectrofotômetro. Espera-se uma concentração de 1 ~ 2 x 107 células/mL, correspondente a OD600 de ~0.33 - 0,66. -
Rapidamente obter a amostra de tempo 0.
- Ligue o sistema de filtro à vácuo forte (~ 10 mbar) através de tubos de vácuo e uma armadilha do frasco de 1.000 mL. Ligue o aspirador. Despeje a unidade superior da cultura (normalmente ~ 20 mL) e esperar para o líquido ser puxado através do filtro (~ 10 s, dependendo da força do vácuo).
- Com cuidado, retire o disco do filtro com uma pinça limpa e coloque em um tubo de centrífuga de 50 mL. Imediatamente, coloque o tubo de centrifugação dentro do rack mergulhado em nitrogênio líquido. Importante, não pre-chill os tubos antes de inserir o filtro vão explodir os tubos.
- Depois > 30 s, lugar o tubo em um freezer-80 ° C para posterior extração do RNA. Após cada filtração, limpar e remontar o sistema de filtro. Enxaguar o sistema, puxando a água de 10 s sem um disco de filtro. Finalmente, seque o sistema com uma toalha de papel.
- Dilua a cultura de 4h em frascos diferentes para os vários pontos de tempo, para que cada balão atinge concentração log médio (~ 1-2 x 107 células/mL) no ponto indicado tempo de hipóxia.
Nota: A tabela 1 mostra as diluições que foram usadas para a tensão de haploides selvagem-tipo S288C HAP1+ . É aconselhável testar cada estirpe nestas condições de cultura hipóxica e ajustar de acordo com as diluições. - Uma vez que as células e mídia é adicionada para frascos, substitua a folha de alumínio cobrindo o balão abrindo com uma rolha contendo dois tubos de vidro inseridos.
- Coloca os frascos na incubadora no layout determinado anteriormente.
- Conecte firmemente o tubo conforme mostrado na Figura 1.
- Verifica que todas as rolhas são firmemente empurradas para as aberturas de balão.
- No tempo 0, abra a válvula do regulador. Em seguida, defina o medidor de fluxo de 3 L/min.
Nota: Bubbling será observado em ambos os balões de água, indicando o fluxo adequado de gás. Se isso não for o caso, verifique se todas as rolhas são apertadas e tubulação está bem colocada. - Fechar a incubadora e definir a velocidade de agitação para ~ 200 rpm. Inicie um timer.
- Cada ponto de tempo, antes de configurar o sistema de filtro como descrevo acima na etapa 1.9.3.
-
Em cada ponto de tempo (por exemplo, 5 min, 10 min, etc.), tem duas pessoas processar rapidamente as células da seguinte forma:
- Primeira pessoa: Remova o frasco apropriado do suporte e retire o bujão (com tubos de vidro ligados).
Nota: Isto não vai quebrar o fluxo de N2 a qualquer dos restantes frascos cultura mas quebrará temporariamente o fluxo para a última armadilha de água. - Segunda pessoa: Pipetar 1 mL da cultura e dispense em uma cubeta. Reconecte o tubo do frasco de cultura que é agora no fim da linha para a última armadilha de água (um tubo e uma rolha vai ser eliminada durante o processo.). Em seguida, medir a concentração de células na cubeta, conforme descrito acima na etapa 1.9.4.
- Primeira pessoa: Despeje o restante da cultura o sistema de filtragem de vácuo e em seguida, executar a filtragem e congelamento conforme descrito acima na etapa 1.9.5.
- Primeira pessoa: Remova o frasco apropriado do suporte e retire o bujão (com tubos de vidro ligados).
- Quando acabar com todos os pontos de tempo, desligue o gás de2 N. Primeiro fechar o regulador e esperar que a pressão liberar e depois desligar o medidor de fluxo. Finalmente, desmontar o sistema e limpar todos os materiais com água e em seguida etanol 70%.
2. extração do RNA
- Prepare o tampão RLT para purificação de RNA coluna, conforme descrito na Tabela de materiais.
- Preparar uma solução de trabalho de DNase, adicionando 10 µ l da solução estoque de DNase a 70 µ l de tampão RDD por amostra (ver Tabela de materiais).
- Retirar os tubos de 50 mL contendo filtros e células do freezer-80 ° C e colocar no gelo a derreter (~ 15 min). Execute as seguintes etapas com tubos no gelo.
- Rotular mL 2 tubos de tampa de rosca e coloque-os em gelo, um tubo para cada amostra. Adicione ~0.6 mL de grânulos ácido lavado a cada tubo, usando um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL para colher e medir os grânulos.
- Adicione 0,6 mL de tampão RLT frio para os tubos de 50 mL.
- Pipetar acima e para baixo para remover células de filtro e suspender em solução. Evite deixar o filtro permanecem na solução, como o filtro irá absorver a solução. Remover toda solução absorvido o filtro usando a ponta da pipeta para apertar o filtro contra a parede do tubo.
- Transferi todo o líquido do tubo de 50 mL para os tubos de tampa de rosca contendo grânulos.
- Coloque os tubos de tampa de rosca em um homogeneizador de moinho do grânulo e concorrer a um min.
Imediatamente, coloque os tubos no gelo durante três minutos. Novamente, coloque os tubos para o homogeneizador e concorrer a um min. - Retire os tubos do homogenizador e lugar no gelo por 5 min. As contas vão resolver para o fundo do tubo.
- Execute o restante das etapas à temperatura ambiente.
- Com uma pipeta, transferir somente o lisado (~ 350 µ l), evitando os grânulos, para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
- Microcentrifuga por 2 min em velocidade máxima e a transferência então o sobrenadante para um novo tubo de microcentrifuga de 1,5 mL.
- Adicione 1 volume de etanol a 70% (feito de etanol de grau biologia molecular prova 200). Misture bem por pipetagem.
- Transferir a solução e qualquer precipitado para uma coluna de RNA que foi colocada dentro de um tubo de coleta de 2 mL.
- Centrifugar por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento (o líquido no tubo).
- Adicione 350 µ l de tampão RW1 à coluna. Centrifugar por 15 s em ≥12, 000g x e descarte o escoamento.
- Adicione 80 µ l DNase mistura de incubação para a membrana de coluna (não ficar nos lados do tubo) e deixe para descansar por 15 min.
- Adicione 350 µ l de tampão RW1 a coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte o escoamento.
- Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 15 s em ≥12, 000 x g e descarte de passagem.
- Adicione 500 µ l de tampão RPE à coluna. Microcentrifuga por 2 min em ≥12, 000 x g.
- Cuidadosamente remova a coluna e colocar em um novo tubo de coleta de 2 mL. Microcentrifuge a toda a velocidade para 1 min (para secar completamente a membrana).
- Descartar o tubo de coleta e colocar a coluna em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Adicione 30 µ l de água livre de RNase para a membrana da coluna.
- Eluir o RNA da coluna por microcentrifuging por 1 min em ≥12, 000 x g. Quando carregar as colunas para a microcentrifuga, certifique-se que as tampas do tubo da coleção estão enfrentando na direção centrífuga gira, para evitar que as tampas de romper.
- Adicione outro 30 μL de água livre de RNase para a membrana da coluna, mantendo a coluna no mesmo tubo microcentrifuga.
- Microcentrifuga por 1 min em ≥12, 000 x g, para que o volume final de eluato é 60 µ l.
- Armazene cada tubo de 1,5 mL contendo 60 µ l de RNA em congelador a-80 ° C.
3. determinar a qualidade e a concentração de RNA
- Medir a concentração de RNA e DNA em cada amostra de RNA, usando um dados, (b) DNA e RNA-específico fluorescente corantes e tubos de ensaio (c), conforme listado na Tabela de materiais. Siga as instruções dos dados e os corantes.
- Alternativamente, medir a concentração de ácido nucleico com um espectrofotômetro UV a 260 nm.
Nota: Uma leitura de260 A do 1.0 é equivalente a ~ 40 µ g/mL, single-stranded do RNA. - Testar a qualidade do RNA executando o RNA em um analisador de ácido nucleico comercial (veja a Tabela de materiais) ou em um padrão de formaldeído/agarose gel 26.
4. RNA-seq análise
- Partir do estoque de RNA total, compõem 21 µ l de 100 ng / µ l do RNA em água livre de RNase. Use 1 µ l deste 21 µ l para testar a concentração de RNA como acima. Enviar o restantes 20 µ l (2 µ g) RNA total para um centro de sequenciamento externo para enriquecimento do mRNA, preparação de biblioteca vertente específica (com oito ou mais códigos de barras para multiplexação) e sequenciamento (veja a Tabela de materiais). Alternativamente, localmente realizar o enriquecimento de mRNA e preparação de biblioteca e então apresentar a biblioteca para sequenciamento.
- Pool de oito ou mais amostras multiplexadas e sequência em uma pista de um sequenciador de última geração.
- Baixe o arquivo FASTQ que contém todas as leituras de sequência e lê o índice correspondente. Também, baixe o arquivo de texto contendo os códigos de barras multiplex.
Nota: O índice lê pode estar presente em um arquivo separado de FASTQ. Coloque todos esses arquivos em um diretório. - Coloque o script fornecido aqui, "fastq_pipeline.sh", no mesmo diretório. Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador.
Nota: este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, a qualidade de roteiro apara o lê, o lê é mapeado para o genoma e gera um arquivo delimitado por tabulação que contém o número de leituras por gene para cada amostra. - Deposite os arquivos FASTQ e dados de contagem de leitura crua na expressão do Gene Omnibus do NCBI antes publicação 27. Siga as instruções para "Submeter dados de sequência de alto rendimento para GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
- Importar os dados de contagem de leitura para o ambiente de estatística R e realizar análise estatística, utilizando o script de R fornecido aqui, "time_course_script. R". Edite este script conforme apropriado para a experiência e os diretórios do computador.
Nota: Este script contém anotações extensas explicando os passos. Em breve, este script importa os dados de leitura, normaliza o lê, identifica genes que mudam significativamente durante o curso do tempo, realiza análise PCA e gráficos a expressão dos genes selecionados.
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Representative Results
O curso de tempo de hipóxia e RNA-seq análise foram realizadas independentemente de três vezes. Para examinar a reprodutibilidade de as três repetições, dados da expressão do gene para todos os genes foi analisados usando análise de componente Principal (PCA). A Figura 2 mostra como as amostras mudam durante os dois primeiros componentes principais, que juntos representam 58,9% da variabilidade. Esta análise indicou que cada curso do tempo exibe alterações similares (como descrito de forma semelhante de cada curva). Além disso, as duas últimas repetições foram mais semelhantes entre si do que para replicar o primeiro. Isto é consistente com o fato de que as duas últimas repetições foram realizadas pela mesma pessoa usando os mesmos lotes de componentes de mídia, enquanto o primeiro replicar foi realizada por uma pessoa diferente e lotes. Esta constatação destaca o fato de que a coerência de técnica e de produtos químicos é um fator importante na obtenção de alta reprodutibilidade. Por último, análise PCA é útil para avaliar se os pontos de tempo escolhido capturar as grandes mudanças que ocorrem no decurso do tempo. Enfocando uma curva replicar, existem distâncias maiores entre as amostras anteriores, indicando grandes mudanças na expressão gênica e menores distâncias entre as amostras posteriores, indicando mudanças menores e, possivelmente, o fim do interruptor de aeróbica para expressão do gene hipóxica.
Em seguida, o pacote de DESeq2 em R25 foi usado para identificar genes mostrando uma mudança significativa em relação ao tempo 0 (p-valores em complementar a tabela 1). Destes genes significativa, 607 mudado mais de 4-fold (alterações de dobra em complementar a tabela 1). Os padrões de expressão destes genes foram agrupados, para que os genes regulados da mesma forma foram agrupados e exibidos em um heatmap (Figura 3). Esta figura mostra que as mudanças de expressão sejam altamente reprodutíveis em repetições. Além disso, genes exibem cinética variável com aumentos e diminuições na expressão. Muitos genes exibem um aumento de pico ou diminuem em 30 min, provavelmente devido a um stress transiente de resposta 13.
A Figura 4 mostra a expressão de dois ativador e dois genes upregulated anteriormente encontrados para ser O2-regulamentado. Os genes mudam expressão reproducibly, com curvas semelhantes entre as réplicas biológicas. O gene com a menor variabilidade entre repetições é DAN1, com sobreposição de curvas. O gene com o máximo de variabilidade é CYC1, talvez porque a expressão deste gene é naturalmente variável. Esta figura ilustra também que grande dobra (até 1,024-fold) foram detectadas alterações.
Para identificar os processos celulares enriquecidos no conjunto de 607 O2-genes regulados, GO termo enriquecimento foi executada (complementar a tabela 2). Como esperado, muitos O2-regulamentados genes desempenham um papel na respiração celular, outros aspectos do metabolismo e em processos ribosomal 13.
| Exemplo # | Tempo em hipóxia | cultura de mL + mL YPD | ||
| 2 | 5 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 3 | 10 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 4 | 30 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 5 | 60 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 6 | 120 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 7 | 180 min | 5 mL + 15 mL | ||
| 8 | 240 min | 4 mL + 16 mL | ||
Tabela 1. Diluições de célula realizadas no tempo 0.
Essas diluições foram determinadas experimentalmente para resultar numa concentração mid log (1-2 × 107 células/mL) após o tempo indicado no N. o2.
Complementar tabela 1. Expressão e dados estatísticos para todos os Genes.
Esta tabela contém o nome sistemático, os valores de p ajustados para sete testes de DESeq2 (ou seja, 5 min vs 0 min, 10 min vs 0 min, etc.), o mínimo ajustado p-valor e a máxima log2 dobra-mudança. Clique aqui para baixar este arquivo.
Complementar tabela 2. IR prazo resultados de enriquecimento.
Esta tabela mostra GO processos, sua representação no conjunto de 607 O2-regulado genes e sua representação no genoma. Em seguida, o teste de qui-quadrado foi usado para identificar termos GO que eram significativamente mais - ou sub-representadas no conjunto de 607 genes. Vá enriquecimento análise foi realizada usando o mapeador de GO Slim no SGD 28. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura 1. Hipoxia set-up para tomar pontos de tempo sem interromper o fluxo de gás para os pontos de tempo mais tarde.
É importante que todas as conexões de mantenham seguras, como descrito no protocolo. Anote o local do curto (9 cm) e tubos de vidro longo (17 cm). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Análise de componentes principais (PCA) mostra a relação entre as três repetições biológicas.
Cada curva tem a min 0 a 240 min amostras em ordem. Utilizou-se a expressão de gene log2 normalizado para todos os genes no APC. PC1 é responsável por 34,7% da variância total e PC2 contas para 24,2%. A linha preta é o primeiro replicar, a linha vermelha é a segunda e a linha azul é o terceiro. Observe que as setas estão sendo usadas para assinalar o 240 min-ponto do tempo em amostras diferentes. Análise de componentes principais (PCA) foi realizado em R usando a função prcomp (Q-modo ou decomposição em valores singulares) na matriz da log2-transformados que contenham genes nas colunas e pontos de tempo em linhas 29. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. Heatmap mostrando a expressão da 607 Genes identificados como O2-regulamentado.
Estes genes foram significativos em pelo menos um dos testes DESeq2 e mudaram a expressão por mais de 4-fold. Log2(expressão relativa) é mostrado. Vermelho = expressão aumentada. Verde = diminuição da expressão. Intensidade de cor é proporcional ao grau de mudança. Antes de criar o heatmap no TreeView 30, expressão gênica foi agrupados com k k-meios = 10 no Cluster 3.0 31. A chave abaixo o heatmap mostra a escala. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Níveis de mRNA relativo de quatro Genes ao longo do tempo em três repetições.
A linha preta é o primeiro replicar, a linha vermelha é a segunda e a linha azul é o terceiro. Nomes de gene comum/sistemática são CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150Ce NCE103/YNL036W. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Arquivo suplementar 1. fastq_pipeline.sh
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Arquivo suplementar 2. time_course_script. R
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Discussion
Neste estudo, os níveis de RNAm para todos os genes foi medido durante hipóxia em levedura S. cerevisiae. O objetivo foi analisar as mudanças de expressão de gene como global devido ao crescimento em um ambiente controlado de perto-anóxica. Várias medidas foram tomadas para garantir que o método descrito aqui foi cuidadosamente controlada e reprodutível. Primeiro, as células foram expostas a um ambiente hipóxico precisamente definido: 99,999% N2 em mídia rica (YPD). Outros estudos de hipóxia tem fechado o frasco ou o tubo de ar 32, usado o cloreto de cobalto hipóxia-mimética 33ou empregado induzindo hipóxia anaeróbica câmaras ou sacos de 34. Cada um desses métodos pode resultar em níveis variados de hipóxia ou outras alterações ambientais não intencionais. Seria útil estudar a expressão de gene, sistematicamente, variando a mistura de gases (por exemplo, 90% N2 e 10% O2), como fermento na natureza são propensos a experimentar menos graves condições de hipóxicos. Em segundo lugar, ergosterol e ácidos graxos insaturados (por exemplo, Tween 80) não foram adicionados para os meios de cultura, já que elas influenciam a expressão gênica, como discutido na introdução. Em terceiro lugar minimizar as mudanças de expressão de gene causadas por diferentes fases de crescimento, empiricamente determinada diluições foram realizadas para que quando uma cultura chegou a um ponto do tempo, foi na fase de crescimento (~ 1-2 x 107 células/mL) de log de mid. Quarta, rápida filtragem e congelamento (~ 15 s) de células que foram removidas da hipóxia é crítico, como alterações de expressão do gene podem ocorrer em < 5 min de exposição para O2, como ocorre quando as células são coletadas por centrifugação (dados não mostrados). O tempo que as células são expostas para O2 poderia ser reduzido executando o crescimento e a colheita de células em um capuz anóxica ou câmara. Em quinto lugar, uma tensão apropriada foi escolhida para este estudo; para ser consistente com outros estudos genômicos, utilizou-se o fundo comum da estirpe laboratório de S288C. No entanto, as estirpes de S288C contém um alelo mutante hap1 e assim foi reparado 11. Isto permitiu o estudo dos genes como CYC1 que respondem aos níveis de2 O através de de fator de transcrição a Hap1 11.
Pontos de tempo foram escolhidos porque eles exibiram alterações de expressão do gene grande em experiências anteriores de hipóxia. Os resultados mostrados aqui podem informar futuros experimentos. Por exemplo, seria útil usar uma resolução mais alta de pontos de tempo durante intervalos que mostram grandes alterações (por exemplo, hipóxia de 0 a 30 min) para capturar mais finamente a cinética de diversa. Além disso, pontos de tempo mais tarde, para além do período de tempo analisada aqui (ou seja, 4 h de hipóxia) podem revelar ainda mais mudanças de expressão.
RNA-seq foi usado para medir os níveis do mRNA porque sua reprodutibilidade e ampla faixa dinâmica permitam a medição da prega grandes alterações 18,35. RNA foi extraído por ruptura mecânica das células usando grânulos vigorosamente abalados e purificado em uma coluna. Outros métodos de purificação de RNA podem ser usados, tais como fenol quente 36. Idealmente, a concentração de RNA será na faixa de 200 ng / µ l - 1000 ng / µ l desde que a concentração de RNA será diluída a 100 ng / µ l para a preparação de biblioteca e transcrição reversa. A concentração de RNA deve ser medida com um dados e tintura de RNA específicas; um espectrofotômetro UV é limitado porque mede a concentração total de ácidos nucleicos, consistindo de RNA e DNA. A qualidade do RNA é determinada por eletroforese em gel; RNA ribossómico bandas devem ser bem definidas sobre o gel e manchas indica degradação de RNA. Aqui, transcrições de mRNA foram enriquecidas, mas existem diversos métodos para isolar diferentes de tipos de RNA 20 que também pode ser importante na resposta.
Para economizar recursos, entre 8 e 12 amostras foram multiplexadas e sequenciadas juntos em uma pista, resultando em uma média de pelo menos 693 leituras por gene para cada amostra, suficiente para reproducibly determinar o número de leituras por gene. Na verdade, mais de 12 amostras podem ser multiplexadas em uma pista, provavelmente resultando em amostragem adequada da maioria dos genes. Para calcular que a média lê por gene, o número total de leituras que mapeado para genes (no arquivo de saída de HTSeq) foi dividido pelo número de genes fornecidos para HTSeq (no presente estudo, 7140). Ao estimar o número máximo de amostras que podem ser multiplexados em uma pista, considere os genes de interesse que exibem a expressão menor (isto é, menor normalizado conta), utilizando dados deste e outros estudos de RNA-seq. Se as contagens de leitura normalizadas para um gene variem significativamente Replica, em seguida, o número de leituras pode ser muito baixo, sugerindo que menos amostras devem ser multiplexadas por raia de sequenciamento.
Sequenciamento de próxima geração irá gerar arquivos FASTQ, que contém as leituras e outras informações. Se a multiplexação foi executada, podem ser gerados um arquivo de código de barras e um arquivo adicional de FASTQ. Estes arquivos podem ser baixados para análise local, como no presente protocolo. Como alternativa, existem várias sequência de próxima geração on-line de ferramentas de análise para aqueles não familiarizados com as funções de linha de comando ou R. A este respeito, recomendamos Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 e GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). No presente protocolo, dois scripts que foram escritos pelos autores são utilizados para análise de processamento e expressão de FASTQ. Os scripts são bem anotados e podem ser editados para diferentes projetos experimentais e as configurações de computador. Também, os dois scripts e a tabela de "Materiais" fornecem sites para baixar as ferramentas utilizadas nesses scripts. O primeiro roteiro, "fastq_pipeline.sh", é um shell script para ser executado na linha de comando em um terminal UNIX/Linux. Este script multiplexes de arquivo original de FASTQ, que contém todas as leituras obtidas a partir de uma pista de sequenciador, gerando um arquivo FASTQ para cada amostra presente na lane. Em seguida, as leituras em cada arquivo FASTQ são de qualidade, aparada usando Trimmomatic com padrão configurações 21. O lê aparado então é mapeado para o genoma de referência de S288C de S. cerevisiae (SGD R64-1-1_20110203) usando TopHat2 com padrão configurações 22. Finalmente, o script usa HTSeq para determinar o número de leituras que mapeiam para cada característica anotada 19.
O segundo script, "time_course_script. R", também foi escrito pelos autores e é executado dentro do ambiente estatístico R 24. O script inicialmente importados são os dados de contagem leitura gerados pelo HTSeq. Cada amostra é assumida como um ponto de tempo e, portanto, é organizada em relação os outros pontos do tempo. As contagens de leitura cruas são então importadas para o pacote de R, DESeq2 25, a fim de identificar genes diferencialmente expressos em qualquer um dos pontos de tempo em relação ao primeiro (i.e., aeróbica, tempo 0). Devido à sua flexibilidade, o DESeq2 pode ser usado para executar outros testes estatísticos, tais como se a expressão muda em função do tempo 13. Alternativamente, outras ferramentas, empregando a estatística paramétrica e não-paramétricos para RNA-seq ler dados de contagem podem ser usado 20. O script então normaliza as contagens de leitura de controle para o grau de sequenciamento de cada amostra, e log2 transforma as contagens. Estas leituras processadas são usadas para executar análise PCA, para determinar a mudança de dobra máxima para cada gene e para criar os gráficos de expressão na Figura 4.
Uma questão importante é qual a melhor forma de empregar as estatísticas para identificar genes que respondem significativamente à hipoxia. Pelo menos três repetições biológicas do curso de tempo são necessárias para calcular a variabilidade natural de cada gene e, portanto, determinar os genes que respondem à hipóxia mais significativo do que o esperado por acaso. Alternativamente, é possível identificar-se com êxito genes que respondem ao longo do tempo, sem repetições biológicas 13,25,38,39. A principal desvantagem para esses métodos é que eles não levam em conta a variabilidade biológica de cada gene. No entanto, se o RNA-seq repetições não são executadas, mudanças de expressão de genes individuais puderam ser verificadas através da realização de que RT-qPCR com múltiplos biológico Replica 13.
Há duas vantagens principais para a avaliação dos vários pontos de tempo de resposta. Primeiro, como discutido anteriormente (especialmente na Figura 2), um curso de tempo identifica os intervalos exibindo alterações de grande expressão, informando-se pontos de tempo adicionais são necessários para melhorar a resolução da cinética ou para observar eventos posteriores da resposta. Em segundo lugar, um curso de tempo permite a diferenciação de cinética de expressão de cada gene. Isso ajuda com identificação únicas vias de sinalização que atuam em momentos específicos durante a resposta e dá uma visão sobre o momento de início e término de sinalização. Especificamente, o agrupamento de genes por padrão de expressão que foi executada aqui resultou em conjuntos de genes co-são regulados. Os promotores de um conjunto de genes podem partilhar um sítio de ligação de fator de transcrição, sugerindo que o fator de transcrição se torna ativo quando os genes mudam de expressão.
Ao estudar uma resposta celular, a variabilidade observada é idealmente devido o estímulo (por exemplo, hipóxia) e não a outras variáveis experimentais. No entanto, como visto na Figura 2, o pesquisador individual e/ou os lotes dos componentes de mídia fazem grandes contribuições para a variabilidade na expressão gênica. Assim, esses parâmetros devem ser considerados para alcançar alta reprodutibilidade e variabilidade experimental minimal. Tão pouco tempo quanto possível deve separar cada replicar, porque as variáveis experimentais são mais propensos a mudar com o passar do tempo.
Em conclusão, este método pode ser usado para monitorar com precisão todo o genoma de alterações nos níveis de RNAm (ou outros eventos tais como modificações do histone ou níveis de proteína) durante um curso de tempo de hipóxia. O método pode ser adaptado para outros organismos, especialmente espécies microbianas que podem ser cultivadas em cultura líquida. Tais análises de tempo-curso de todo o genoma irão complementar estudos da morfologia celular, atividade de proteínas e metabolismo. Juntos, esses dados conduzirá a uma compreensão mais rica de uma resposta celular.
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Agradecemos o Instituto Lewis-Sigler Integrativa facilidade do núcleo do sequenciamento de genómica da Universidade de Princeton para aconselhamento técnico e para a preparação de biblioteca de RNA e sequenciamento. Este trabalho foi financiado por doações da Universidade Rowan e NIH NIGMS R15GM113187 para M.J.H.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1,000 mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500 mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250 mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4 °C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C. | ||
| 2 mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2 mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
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