Summary
Qui, presentiamo un protocollo utilizzando RNA-seq per monitorare i livelli di mRNA nel tempo durante la risposta hypoxic delle cellule di S. cerevisiae . Questo metodo può essere adattato per l'analisi di espressione genica durante qualsiasi risposta cellulare.
Abstract
Complessi cambiamenti nell'espressione genica mediano in genere una grande porzione di una risposta cellulare. Ogni gene può cambiare espressione con la cinetica unico come il gene è regolato tramite la sincronizzazione particolare di uno dei molti stimoli, segnalazione vie o effetti secondari. Al fine di catturare l'intero gene espressione risposta all'ipossia nel lievito S. cerevisiae, analisi di RNA-seq è stata usata per monitorare i livelli di mRNA di geni tutti in momenti specifici dopo l'esposizione all'ipossia. L'ipossia è stato stabilito coltivando cellule in ~ 100% N2 gas. Cosa importante, a differenza di altri studi hypoxic, ergosterolo e acidi grassi insaturi non sono stati aggiunti ai media perché questi metaboliti influenzano l'espressione genica. Intervalli di tempo sono stati scelti nella gamma di 0 - 4 h dopo ipossia perché quel periodo acquisisce i principali cambiamenti nell'espressione genica. In ogni punto del tempo, le cellule hypoxic Mid-registro erano rapidamente filtrata e congelati, limitando l'esposizione di O2 e concomitanti cambiamenti nell'espressione genica. RNA totale è stato estratto dalle cellule e utilizzato per arricchire per mRNA, che è stato poi convertito in cDNA. Da questo cDNA, multisala librerie sono state create e otto o più campioni sono stati sequenziati in una corsia di un sequencer di prossima generazione. Una pipeline di post-sequenziamento è descritta, che include guarnizione base di qualità, leggere mapping e determinazione del numero di letture al gene. DESeq2 all'interno dell'ambiente statistico R è stato utilizzato per identificare i geni che cambiano significativamente in uno qualsiasi dei punti tempo ipossica. Analisi di tre replicati biologici ha rivelato alta riproducibilità, geni della cinetica differente e un gran numero di previsto O2-regolato geni. Questi metodi possono essere utilizzati per studiare come le cellule di vari organismi rispondono all'ipossia nel tempo e adattati per lo studio di espressione genica durante altre risposte cellulari.
Introduction
Molti organismi rispondono all'ipossia, o basso O2, alterando gene expression 1,2,3. Questa risposta aiuta le cellule a fronte della mancanza di un substrato fondamentale per la respirazione aerobica e per parecchie reazioni biosintetiche, ma anche con un cambiamento di stato redox 4. Parecchi studi di microarray eseguiti in S. cerevisiae mostrano che i livelli di mRNA di centinaia di geni cambiano in risposta all'ipossia 5,6,7,8,9 , 10 , 11 , 12. recentemente, RNA-seq è stata utilizzata per caratterizzare i cambiamenti di espressione genica nel corso del tempo durante l'ipossia 13. Qui, i dettagli sperimentali sono presentati e discussi.
L'ipossia può essere realizzato in vari modi, ciascuno producendo un diverso livello di O2. Qui, l'ipossia è stato stabilito dal continuo fluire ultra-alto-purezza N2 in boccette, che abbassa [O2] dissolto immediatamente con cinetica riproducibile 10. È possibile che ci sono alcune molecole di2 O presenti che contribuiscono al metabolismo e nell'espressione genica ma questo ambiente è considerato molto vicino anaerobica. In assenza di O2, cellule di lievito non possono biosintetizzare eme, ergosterolo e acidi grassi insaturi 4,12,14. Così, gli studi precedenti hanno incluso questi metaboliti quando crescente lievito senza ossigeno 5,10,15. Tuttavia, molte risposte ipossiche sono mediate da svuotamento di questi metaboliti e così loro reintegro inverte il gene hypoxic espressione risposte 12,16. Al fine di imitare naturale ipossia, questi metaboliti non sono stati aggiunti ai media. Nel breve tempo che le cellule sono state esposte all'ipossia senza la presenza di questi metaboliti essenziali, non c'era nessun notevole aumento della morte cellulare (dati non mostrati) né una risposta di stress prolungato 13.
La risposta dipende anche il ceppo e il suo genotipo. Particolarmente importanti sono gli alleli dei regolatori noti di risposte ipossiche 2. Sullo sfondo di ceppo S288C è altamente desiderato in modo che risultati possono essere confrontati agli altri studi genomici eseguite con questo ceppo. Tuttavia, S288C contiene un allele di perdita-de-funzione parziale del HAP1 gene 17, un regolatore trascrizionale critico per la risposta hypoxic. Questo allele è stato riparato in S288C utilizzando un wildtype copia dal Σ1278b ceppo sfondo 11.
Espressione genica è altamente dipendente l'ambiente cellulare. Così, quando si esegue l'analisi del mRNA di genoma, è importante mantenere un ambiente costante pur variando un altro parametro come tempo, stimolo o genotipo. Per ottenere risultati altamente riproducibili, considera queste tre pratiche per lo studio e tutte le sue repliche biologiche o tecnici. In primo luogo, il experimenter(s) stesso dovrebbe svolgere lo studio, poiché pratiche tecniche possono variare tra gli sperimentatori. In secondo luogo, la stessa serie di ingredienti da utilizzarsi nei media crescita quanto ogni partita ha una composizione leggermente differente che possa influenzare l'espressione genica. In terzo luogo, per ridurre al minimo gli effetti del ciclo cellulare, ogni punto di tempo dovrebbe consistere asincrone cellule nella fase di Mid-registro di crescita (1-2 x 107 cellule/mL).
Quando che caratterizzano una risposta complessa come la risposta di espressione genica all'ipossia, un corso di tempo è vantaggioso per determinare la cinetica di vari eventi. Intervalli di tempo specifici dovrebbero essere scelti che catturerà i principali cambiamenti della risposta. In questo studio, sono stati osservati punti di tempo compreso tra 0 e 4 h, perché ultimi esperimenti ha rivelato i cambiamenti diffusi nell'espressione genica durante questo periodo 13.
Per misurare l'espressione genica globale, RNA-seq è stato usato 18,19. Questo metodo utilizza il sequenziamento di nuova generazione per determinare l'abbondanza relativa di trascrizione di ogni gene. Rispetto all'analisi di microarray del DNA, il RNA-seq esibisce maggiore sensibilità (per rilevare le trascrizioni meno abbondanti), una maggiore gamma dinamica (per misurare le variazioni di piega maggiore) e riproducibilità superiore (a seguire con precisione l'espressione genica nel corso del tempo). In genere, più cellulare del RNA è RNA ribosomiale così molti metodi sono stati sviluppati per arricchire per specifici RNA specie 20. Qui, poli-T sfere sono stati utilizzati per purificare poli-A-contenenti trascrizioni del mRNA, però i vari commercialmente - Kit di svuotamento di rRNA disponibili potrebbe anche essere efficace nel arricchimento di mRNA.
Qui, la risposta di espressione del gene di S. cerevisiae all'ipossia è stata caratterizzata. Le cellule erano esposti ad ipossia e poi provate a otto punti di tempo (0, 5, 10, 30, 60, 120, 180 e 240 min). Per confermare la riproducibilità e per identificare le trascrizioni statisticamente modificate, sono stati effettuati tre replicati biologici. RNA è stato estratte da rottura meccanica e purificazione di colonna e poi elaborato per l'analisi di RNA-seq. La pipeline di post-sequenziamento è descritta e sono gli script di programmazione che consentono di eseguire la replica esatta delle analisi. In particolare, Trimmomatic 21, TopHat2 22, HTseq 23, l' ambiente statistico R 24e il DESeq2 pacchetto 25 sono stati utilizzati per elaborare i dati di RNA-seq e per identificare 607 geni che cambiano in modo significativo durante ipossia. Analisi delle componenti principali (PCA) e l'espressione genica dei replicati indicato la riproducibilità della tecnica. Clustering e heatmaps ha rivelato la cinetica di espressione ad ampio raggio, mentre l'analisi del gene ontology (GO) ha mostrato che molti processi cellulari, come respirazione aerobica, sono arricchiti nel set di geni regolati da ossigeno.
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Protocol
1. indurre ipossia
- Un giorno o più prima del corso di tempo di ipossia: preparare l'incubatrice, cellula filtraggio sistema, vuoto, serbatoio di gas, boccette, tappi, tubazione di vetro e tubi, come indicato nella Tabella dei materiali.
- Posizionare il serbatoio2 N, incubatrice, sistema di aspirazione e filtraggio nelle immediate vicinanze, per attivare l'elaborazione rapida delle cellule.
- Preparare terreno YPD liquido sterile (1%, Estratto di lievito, 2% di peptone, 2% glucosio) con i componenti in una bottiglia di vetro e la sterilizzazione in autoclave.
- Planimetria di boccette in incubatrice.
Nota: Dal serbatoio N2 , il primo pallone sarà una trappola d'acqua, la seconda beuta sarà l'ultimo punto di tempo, il terzo pallone sarà il punto di secondo all'ultimo momento e così via fino al ultimo pallone che è una trappola finale dell'acqua. La figura 1 Mostra l'ordine e le connessioni tra le boccette. - Il giorno prima del corso di tempo, inoculare una Colonia del lievito in una cultura di 5 mL di liquido YPD all'interno di una provetta sterile. In particolare, di raccogliere una colonia completa da una piastra con un bastoncino sterile. Inserire la chiavetta nel YPD liquido e agitare il bastone fino a quando la maggior parte delle cellule sono in sospensione.
- Ruotare i tubi a 30 ° C durante la notte (~ 16 h).
Nota: Dopo le 16h, wildtype cellule raggiungerà saturazione (~ 2 x 108 cellule/mL), indicato da una cultura molto nuvolosa. Altri ceppi potrebbero richiedere più tempo per raggiungere la saturazione e dovrebbero essere testati misurando la concentrazione cellulare con uno spettrofotometro, come indicato nel passaggio 1.9.4. - Il giorno del corso di tempo, dopo 16 h di incubazione, diluire la cultura saturata 01:50 utilizzando una pipetta da 5 mL per porre 4 mL di pernottamento cultura in 196 mL di YPD liquido all'interno di un pallone da mL 500 sterile. Crescere con agitazione a ~ 200 giri/min per 4 ore a 30 ° C.
Nota: Dopo 4 h, una cultura di wildtype raggiungerà una concentrazione di Mid-registro di ~ 1-2 x 107 cellule/mL. - Durante l'incubazione di 4 h, etichettare le beute (per ipossia e acqua trappole) e i 50 mL provette per il prelievo. Se l'incubatore nel passaggio 1.7 sopra non viene utilizzato per il corso di tempo di ipossia, accendere l'altro incubatore e impostato su 30 ° C.
-
Appena prima di sottoporre le cellule ad ipossia:
- Aggiungere ~ 50 mL di acqua a due delle beute sterili 250 mL che serviranno come le trappole di acqua.
- Riempire 1/3 di un ghiaccio secchio con azoto liquido e immergere un rack di polistirolo espanso per contenere provette centrifuga da 50 mL.
- Impostare il sistema di filtro per la raccolta di cellule. Aggiungere un filtro sterile disco sull'unità di fondo del sistema di filtrazione con pinzette sterili, facendo attenzione a toccare solo i bordi del disco filtro. Posizionare l'unità superiore filtro sul gruppo filtro inferiore e fissarlo con le fascette fornite con il sistema. Assicurarsi che l'unità superiore e inferiore siano allineati in modo che vi sia una tenuta ottimale e senza perdite.
- Misurare la concentrazione di cellule con uno spettrofotometro. Diluire le cellule in modo che possono essere misurati in campo lineare dello spettrofotometro – OD600 tra ~0.2 - 0.6, a seconda dello spettrofotometro.
Nota: Un'unità di600 OD è ~ 3 x 107 cellule/mL, a seconda della morfologia delle cellule e spettrofotometro. È prevista una concentrazione di ~ 1-2 x 107 cellule/mL, corrispondenti a OD600 di ~0.33 - 0,66. -
Ottenere rapidamente il campione di tempo 0.
- Collegare il sistema di filtro a un vuoto forte (~ 10 mbar) tramite tubo del vuoto e una trappola di boccetta di 1.000 mL. Applicare il vuoto. La cultura (solitamente ~ 20 mL) versare il sopralzo e attendere per liquido di essere tirato attraverso il filtro (~ 10 s, a seconda della forza del vuoto).
- Rimuovere il disco filtro con pinzette pulite delicatamente e posto in una provetta da centrifuga 50 mL. Posizionare immediatamente la provetta nel rack immerso in azoto liquido. D'importanza, non pre-raffreddare i tubi prima di inserire il filtro come i tubi esploderà.
- Dopo > 30 s, posto il tubo in un congelatore-80 ° C per la successiva estrazione del RNA. Dopo ogni filtrazione, pulire e rimontare il sistema filtrante. Sciacquare il sistema tirando acqua attraverso per 10 s senza un disco di filtro. Infine, asciugare il sistema con un tovagliolo di carta.
- Diluire la cultura di 4h in boccette differenti per i vari punti di tempo, affinché ciascuna beuta raggiunge metà log concentrazione (~ 1-2 x 107 cellule/mL) presso il punto di tempo indicato di ipossia.
Nota: La tabella 1 Mostra le diluizioni che sono state utilizzate per il ceppo aploide di selvaggio-tipo S288C HAP1+ . Si consiglia di testare ogni ceppo in queste condizioni ipossiche cultura e regolare di conseguenza le diluizioni. - Una volta che le cellule e i media vengono aggiunti a boccette, sostituire il foglio di alluminio che copre il matraccio di apertura con tappo contenente due tubi di vetro inseriti.
- Posizionare le beute nell'incubatore nel layout determinato in precedenza.
- Collegare saldamente il tubo come illustrato nella Figura 1.
- Verificare che tutti i tappi sono strettamente inseriti nelle aperture del pallone.
- Al tempo 0, aprire la valvola del regolatore. Quindi impostare il misuratore di portata a 3 L/min.
Nota: Bubbling sarà osservato in due flaconi di acqua, che indica il flusso di gas corretto. Se questo non è il caso, verificare che tutti i tappi sono stretti e tubazione sia collegata correttamente. - Chiudere l'incubatrice e impostare la velocità di agitazione a ~ 200 giri/min. Avviare un timer.
- Prima di ogni punto del tempo, è possibile impostare il sistema di filtro come descritto sopra al punto 1.9.3.
-
Ogni punto di tempo (ad es., 5min, 10min, ecc.), sono due persone di elaborare rapidamente le cellule come segue:
- Prima persona: togliere il matraccio appropriato da parte del titolare e togliere il tappo (con tubo di vetro collegato).
Nota: Questo non interromperà il flusso di N2 a uno qualsiasi dei restanti matracci di cultura ma interromperà temporaneamente il flusso all'ultima trappola di acqua. - Seconda persona: dispensare 1 mL di coltura e pipettare in una provetta. Ricollegare il tubo nel matraccio di cultura che è ora alla fine della riga all'ultima trappola di acqua (un tubo e un tappo volontà essere rimossi nel processo.). Quindi, misurare la concentrazione di cellule in provetta, come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.4.
- Prima persona: versare il resto della cultura il sistema di filtrazione sotto vuoto e quindi eseguire il filtro e congelamento come descritto in precedenza nel passaggio 1.9.5.
- Prima persona: togliere il matraccio appropriato da parte del titolare e togliere il tappo (con tubo di vetro collegato).
- Al termine tutti i punti di tempo, spegnere il gas2 N. Prima chiudere il regolatore e attendere che la pressione rilasciare e quindi spegnere il misuratore di portata. Infine, smontare il sistema e pulire tutti i materiali con acqua e poi con etanolo al 70%.
2. estrazione del RNA
- Preparare il tampone di RLT per purificazione di RNA colonna, come descritto nella Tabella dei materiali.
- Preparare una soluzione di lavoro di dnasi aggiungendo 10 µ l di soluzione madre dnasi a 70 µ l di tampone RDD per campione (Vedi Materiali tavolo).
- Rimuovere le provette da 50 mL contenente filtri e cellule dal congelatore-80 ° C e metterli su ghiaccio a scongelare (~ 15 min). Procedere come segue con tubi sul ghiaccio.
- Etichetta 2 mL provette con tappo a vite e metterli sul ghiaccio, una provetta per ogni campione. Aggiungere mL ~0.6 di perline lavata con acido in ogni provetta, utilizzando un tubo per microcentrifuga da 1,5 mL di scoop e misurare le perline.
- Aggiungere 0,6 mL di tampone di RLT refrigerato per le provette da 50 mL.
- Dispensare su e giù per rimuovere le cellule dal filtro e sospendere in soluzione. Evitare di lasciare il filtro rimangono nella soluzione come il filtro sarà assorbire la soluzione. Rimuovere tutte le soluzione assorbita nel filtro utilizzando il puntale per spremere il filtro contro la parete del tubo.
- Trasferire tutto il liquido dal tubo 50 mL nelle provette con tappo a vite contenente microsfere.
- Disporre le provette con tappo a vite in un omogeneizzatore del mulino di perlina e correre per un minuto.
Posizionare immediatamente le provette in ghiaccio per tre minuti. Ancora una volta, inserire i tubi l'omogeneizzatore e correre per un minuto. - Rimuovere i tubi dal omogeneizzatore e posto in ghiaccio per 5 min. Le perline si depositano alla parte inferiore dei tubi.
- Eseguire il resto dei passaggi a temperatura ambiente.
- Con una pipetta, trasferire solo il lisato (~ 350 µ l), evitando le perle, ad un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Microcentrifuga per 2 min a velocità massima e quindi trasferimento il surnatante in un nuovo tubo per microcentrifuga da 1,5 mL.
- Aggiungere 1 volume di etanolo al 70% (fatto da 200 etanolo di biologia molecolare-grado della prova). Mescolare bene il pipettaggio.
- Trasferire la soluzione e dell'eventuale precipitato a una colonna di RNA che è stata inserita all'interno di un tubo di raccolta da 2 mL.
- Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo (il liquido nel tubo).
- Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Centrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.
- Aggiungere 80 µ l dnasi I mix di incubazione per la membrana di colonna (non fare i lati del tubo) e lasciar per riposare per 15 min.
- Aggiungere 350 µ l di tampone RW1 alla colonna. Microcentrifuga per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare il flusso continuo.
- Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Flusso continuo del microcentrifuge per 15 s a ≥ 12, 000 x g e scartare.
- Aggiungere 500 µ l di tampone RPE alla colonna. Microcentrifuga per 2 min a ≥ 12, 000 x g.
- Rimuovere la colonna delicatamente e inserire un nuovo tubo di raccolta da 2 mL. Microcentrifuga a tutta velocità per 1 minuto (per asciugare completamente la membrana).
- Gettare la provetta di raccolta e posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna.
- Eluire il RNA dalla colonna di microcentrifuging per 1 min ≥ 12, 000 x g. Quando si caricano le colonne in microcentrifuga, assicurarsi che i coperchi del tubo di raccolta si trovano ad affrontare in direzione centrifuga giri, per evitare che i coperchi di rottura.
- Aggiungere un altro 30 µ l di acqua RNAsi-libera alla membrana colonna, mantenendo la colonna nello stesso tubo del microcentrifuge.
- Microcentrifuga per 1 min ≥ 12, 000 x g, affinché il volume finale eluato è 60 µ l.
- Memorizzare ogni provetta da 1,5 mL contenente 60 µ l di RNA nel congelatore-80 ° C.
3. determinare la qualità e la concentrazione di RNA
- Misurare la concentrazione di RNA e DNA in ogni campione di RNA, utilizzando (a) un fluorimetro, (b) fluorescente a DNA e RNA specifico coloranti e (c) provette, come elencato nella Tabella dei materiali. Seguire le istruzioni del fluorimetro e i coloranti.
- In alternativa, misurare la concentrazione di acido nucleico con uno spettrofotometro di UV a 260 nm.
Nota: Una260 una lettura di 1.0 è equivalente a ~ 40 µ g/mL single-stranded RNA. - Verificare la qualità di RNA eseguendo il RNA su un analizzatore di acido nucleico commerciale (Vedi Materiali tavolo) o su una valore standard di formaldeide / dell'agarosi gel 26.
4. RNA-seq analisi
- Dallo stock di RNA totale, compongono 21 µ l di 100 ng / µ l RNA in acqua RNAsi-libera. Utilizzare 1 µ l di questo 21 µ l per testare la concentrazione di RNA come sopra. Presentare i rimanenti 20 µ l (2 µ g) RNA totale ad un centro di sequenziamento esterno per arricchimento di mRNA, preparazione libreria strand-specifica (con otto o più codici a barre per multiplexing) e sequenziamento (Vedi Materiali tavolo). In alternativa, eseguire localmente mRNA arricchimento e preparazione di libreria e quindi inviare la libreria per il sequenziamento.
- Piscina otto o più campioni di multiplexati e sequenza in una corsia di un sequencer di prossima generazione.
- Scaricare il file FASTQ che contiene tutte le letture di sequenza e l'indice corrispondente legge. Inoltre, scaricare il file di testo contenente i codici a barre multiplex.
Nota: Le letture di indice possono essere presenti in un file FASTQ separato. Inserire tutti questi file in una directory. - Inserire lo script di shell fornito qui, "fastq_pipeline.sh", nella stessa directory. Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer.
Nota: questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, la qualità di script taglia le letture, mappe le letture al genoma e genera un file delimitato da tabulazioni contenente il numero di letture al gene per ogni campione. - Depositare i file FASTQ e crudo conteggio lettura dati in Omnibus di espressione di Gene di NCBI prima pubblicazione 27. Seguire le istruzioni per "Invio dati di sequenza di high-throughput di GEO": https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/seq.html.
- Importare i dati di lettura conteggio nell'ambiente statistico R ed effettuare analisi statistiche, utilizzando lo script di R fornito qui, "time_course_script. R". Modificare lo script come appropriato per l'esperimento e le directory del computer.
Nota: Questo script contiene vaste annotazioni che spiega i passaggi. In breve, questo script consente di importare i dati letti, normalizza le letture, individua i geni che cambiano in modo significativo nel corso del tempo, esegue analisi PCA e grafici l'espressione di geni selezionati.
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Representative Results
Il decorso di ipossia e RNA-seq analisi sono state eseguite in modo indipendente tre volte. Per esaminare la riproducibilità dei tre replicati, dati di espressione genica per tutti i geni è stati analizzati utilizzando Principal Component Analysis (PCA). La figura 2 Mostra come i campioni cambiano sopra i primi due componenti principali, che insieme rappresentano il 58,9% della variabilità. Questa analisi ha indicato che ogni corso tempo esibisce i cambiamenti simili (come rappresentato dalla forma simile di ogni curva). Inoltre, le ultime due repliche erano più simili fra loro che per la prima replica. Ciò è coerente con il fatto che le ultime due repliche sono state eseguite dalla stessa persona utilizzando lo stessi lotti di componenti multimediali, mentre la prima replica è stata eseguita da una persona diversa e batch. Questo risultato sottolinea il fatto che la coerenza di tecnica e prodotti chimici è un fattore importante per ottenere elevata riproducibilità. Infine, l'analisi PCA è utile nel valutare se i punti di tempo scelto catturano i principali cambiamenti che si verificano durante il corso di tempo. Concentrandosi su una curva di replicare, non ci sono più grandi distanze tra i campioni precedenti, che indica grandi cambiamenti nell'espressione genica e più piccole distanze tra i campioni successivi, che indica più piccoli cambiamenti e, eventualmente, alla fine lo switch da aerobica a espressione genica ipossia.
Successivamente, il pacchetto di DESeq2 in R25 era utilizzato per identificare i geni che mostra un cambiamento significativo rispetto al tempo 0 (valori di p a complementare la tabella 1). Di questi geni significativi, 607 ha cambiato più di 4 volte (piega modifiche supplementari tabella1). I modelli di espressione di questi geni sono stati raggruppati, così che allo stesso modo-ha regolato i geni sono stati raggruppati insieme e quindi visualizzati in una mappa di concentrazione (Figura 3). Questa figura mostra che i cambiamenti di espressione sono altamente riproducibili attraverso repliche. Inoltre, geni esibiscono cinetica variabile con aumenti e diminuzioni nell'espressione. Molti geni mostrano un aumento del picco o diminuiscono a 30 min, probabilmente a causa di una sollecitazione transitoria risposta 13.
Figura 4 descrive l'espressione di due downregulated e due geni sovraregolati precedentemente trovati per essere O2-regolamentato. I geni cambiano espressione riproducibile, con curve simili tra la replica di biologica. Il gene con la minima variabilità tra repliche è DAN1, con sovrapposte le curve. Il gene con più variabilità è CYC1, forse perché espressione di questo gene è naturalmente variabile. Questa figura illustra anche che piega grandi cambiamenti sono stati rilevati (fino a 1,024-fold).
Per identificare i processi cellulari arricchiti nel set di 607 O2-geni regolati, GO termine arricchimento è stata eseguita (complementare tabella 2). Come previsto, molti O2-geni giocano un ruolo nella respirazione cellulare, altri aspetti del metabolismo e in processi ribosomal 13.
| Esempio # | Tempo in ipossia | cultura di mL + mL YPD | ||
| 2 | 5 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 3 | 10 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 4 | 30 min | 20 mL + 0 mL | ||
| 5 | 60 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 6 | 120 min | 10 mL + 10 mL | ||
| 7 | 180 min | 5 mL + 15 mL | ||
| 8 | 240 min | 4 mL + 16 mL | ||
Tabella 1. Cella diluizioni eseguite al tempo 0.
Queste diluizioni sono state determinate sperimentalmente per provocare Mid-registro concentrazione (1-2 × 107 cellule/mL) dopo il tempo indicato, N2.
Complementare nella tabella 1. Espressione e dati statistici per tutti i geni.
Questa tabella contiene il nome sistematico, i p-valori regolati per sette DESeq2 test (cioè, 5 min vs 0 min, 10 min vs 0 min, ecc.), il minimo regolato p-valore e il cambiamento massimo di piega log2. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Complementare nella tabella 2. GO termine risultati di arricchimento.
Questa tavola mostra GO processi, loro rappresentazione nel set di 607 O2-regolato geni e la loro rappresentazione nel genoma. Quindi, il test chi-quadrato è stato utilizzato per identificare va termini che erano significativamente sopra - o sotto-rappresentati nel set di 607 geni. Vai arricchimento analisi è stata eseguita utilizzando GO Slim Mapper SGD 28. Per favore clicca qui per scaricare questo file.
Figura 1. Set-up di ipossia per prendere tempo punti senza interrompere il flusso di Gas a intervalli di tempo successivi.
È importante che tutte le connessioni rimangono sicure, come descritto nel protocollo. Prendere nota del percorso del breve (9 cm) e lungo i tubi di vetro (17 cm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 2. Analisi delle componenti principali (PCA) Mostra la relazione tra i tre replicati biologici.
Ogni curva ha il 0 min a 240 min campioni in ordine. L'espressione genica di log2 normalizzato per tutti i geni è stato utilizzato nel PCA. PC1 è responsabile del 34,7% della varianza totale e dei conti di PC2 per 24,2%. La linea nera è la prima replica, la linea rossa è la seconda e la linea blu è il terzo. Si noti che le frecce vengono utilizzate per sottolineare la 240 min tempo-punto in diversi campioni. Analisi delle componenti principali (PCA) è stata effettuata in R utilizzando la funzione di prcomp (Q-modalità, o decomposizione a valori singolari) sulla matrice log2-trasformati contenenti geni nelle colonne e intervalli di tempo in righe 29. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 3. Heatmap mostrando espressione della 607 geni identificati come O2-regolamentato.
Questi geni sono stati significativi in almeno uno dei test DESeq2 e cambiato espressione di più di 4 volte. Viene mostrato il registro2(espressione relativa). Rosso = espressione aumentata. Verde = espressione in diminuzione. Intensità del colore è proporzionale al grado di cambiamento. Prima di creare l'heatmap in TreeView 30, espressione genica era k-means cluster con k = 10 in Cluster 3.0 31. Il tasto sotto l'heatmap mostra la scala. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nella figura 4. I livelli di mRNA relativa dei quattro geni nel corso del tempo nei tre replica.
La linea nera è la prima replica, la linea rossa è la seconda e la linea blu è il terzo. I nomi del comune/genoma sono CYC1/YJR048W, ERG5/YMR015C, DAN1/YJR150Ce NCE103/YNL036W. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
File supplementare 1. fastq_pipeline.sh
Clicca qui per scaricare questo file.
File supplementare 2. time_course_script. R
Clicca qui per scaricare questo file.
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Discussion
In questo studio, i livelli di mRNA per tutti i geni è stata misurata durante l'ipossia nel lievito S. cerevisiae. L'obiettivo era di analizzare i cambiamenti di espressione genica globale a causa della crescita in un ambiente controllato vicino-anossico. Sono state adottate numerose misure per garantire che il metodo qui descritto è stato attentamente controllato e riproducibile. In primo luogo, le cellule sono state esposte ad un ambiente ipossico precisamente definito: 99,999% N2 in contenuti multimediali (YPD). Altri studi di ipossia hanno chiuso fuori la boccetta o il tubo di aria 32, utilizzato il cloruro di cobalto ipossia-mimetici 33o impiegato che inducono ipossia anaerobica chambers o borse 34. Ciascuno di questi metodi può causare diversi livelli di ipossia o di altri cambiamenti ambientali non intenzionale. Sarebbe utile studiare l'espressione genica pur variando sistematicamente la miscela di gas (ad es., 90% N2 e 10% O2), come lievito nel selvaggio sono probabile che si verifichino condizioni di ipossia meno gravi. In secondo luogo, ergosterolo e acidi grassi insaturi (ad es., Tween 80) non sono stati aggiunti al terreno di coltura, poiché essi influenzano l'espressione genica, come discusso nell'introduzione. In terzo luogo, per ridurre al minimo i cambiamenti di espressione genica causati da diverse fasi di crescita, empiricamente determinato diluizioni sono state eseguite in modo che quando una cultura ha raggiunto un punto di tempo, era in fase di Mid-registro di crescita (~ 1-2 x 107 cellule/mL). Quarto, la veloce filtraggio e congelamento (~ 15 s) delle cellule che sono state rimosse da ipossia è critica, come cambiamenti di espressione genica possono verificarsi in < 5 min di esposizione di O2, si verifica quando le cellule vengono raccolte mediante centrifugazione (dati non mostrati). Nel momento in cui le cellule sono esposte a O2 potrebbe essere ridotto eseguendo la crescita e la raccolta delle cellule in un cappuccio anossica o una camera. Quinto, un ceppo appropriato è stato scelto per questo studio; per essere coerenti con altri studi di genomiche, è stato impiegato un comune S288C background di sforzo in laboratorio. Tuttavia, i ceppi S288C contiene un allele mutante hap1 e così è stato riparato 11. Questo ha permesso lo studio di geni come CYC1 che rispondono a O2 livelli tramite il fattore di trascrizione Hap1 11.
Intervalli di tempo sono stati scelti perché hanno esibito i cambiamenti di espressione di gene di grandi dimensioni in precedenti esperimenti di ipossia. I risultati mostrati qui possono informare gli esperimenti futuri. Ad esempio, sarebbe utile utilizzare una risoluzione più elevata di punti temporali durante gli intervalli che mostrano grandi cambiamenti (ad esempio, da 0 a 30 min ipossia) per catturare più finemente la cinetica diversificata. Inoltre, dopo intervalli di tempo, oltre il periodo di tempo analizzato qui (cioè, 4 h di ipossia) possono rivelare ulteriori cambiamenti di espressione.
RNA-seq è stato utilizzato per misurare i livelli di mRNA perché sua riproducibilità e ampia gamma dinamica consente la misura di piega grandi cambiamenti 18,35. RNA è stato estratto di rottura meccanica delle cellule usando i branelli vigorosamente agitate e purificato su una colonna. Altri metodi di purificazione di RNA potrebbero essere utilizzati, ad esempio fenolo caldo 36. Idealmente, la concentrazione di RNA sarà nel range di 200 ng / µ l - 1000 ng / µ l poiché la concentrazione di RNA sarà diluita a 100 ng / µ l per trascrizione inversa e preparazione di biblioteca. La concentrazione di RNA deve essere misurata con un fluorimetro e tintura di RNA-specifico; uno spettrofotometro UV è limitato, dato che misura la concentrazione totale degli acidi nucleici, consistente di RNA e di DNA. La qualità del RNA è determinata mediante elettroforesi in gel; RNA ribosomiale bande dovrebbero essere ben definite sul gel e sbavature indica la degradazione del RNA. Qui, trascritti di mRNA sono stati arricchiti, ma ci sono diversi metodi per isolare diversi di tipi di RNA 20 che può anche essere importante nella risposta.
Per risparmiare risorse, tra 8 e 12 campioni erano multiplexati e sequenziati insieme in una sola corsia, conseguente a una media di almeno 693 letture al gene per ogni campione, sufficiente a riproducibile determinare il numero di letture al gene. Infatti, più di 12 campioni potrebbero essere multiplexati in una corsia, probabilmente conseguente campionamento adeguato della maggior parte dei geni. Al fine di calcolare che la media letture al gene, il numero totale di letture mappato a geni (nel file di output di HTSeq) è stato diviso per il numero di geni fornite a HTSeq (in questo studio, 7140). Quando si stima il numero massimo di campioni che possono essere multiplexati in una corsia, considera geni di interesse che mostrano l'espressione più basso (cioè, più basso normalizzato conta), utilizzando i dati di questo e altri studi di RNA-seq. Se la lettura conta normalizzata per un gene varia significativamente tra replica, allora il numero di letture può essere troppo basso, suggerendo che meno campioni dovrebbero essere multiplexati per corsia di sequenziamento.
Sequenziamento di nuova generazione genererà il file FASTQ contenente le letture e altre informazioni. Se è stato effettuato il multiplexing, potrebbe essere generati un file di codice a barre e un ulteriore file FASTQ. Questi file possono essere scaricati per analisi locale, come in questo protocollo. In alternativa, ci è parecchi sequenza di generazione online strumenti di analisi per chi non ha familiarità con le funzioni della riga di comando o R. A questo proposito, si consiglia di Galaxy (https://usegalaxy.org/) 37 e GenomeSpace (http://www.genomespace.org/). Nel presente protocollo, vengono utilizzati due script che sono stati scritti dagli autori per FASTQ elaborazione e analisi dell'espressione. Gli script sono ben annotati e possono essere modificati per diversi disegni sperimentali e impostazioni del computer. Inoltre, i due script e la tabella di "Materiali" fornire siti Web per scaricare gli strumenti utilizzati in questi script. Il primo script, "fastq_pipeline.sh", è uno script di shell da eseguire dalla riga di comando in un terminale UNIX/Linux. Questo script demultiplexing file FASTQ originale che contiene tutte le letture ottenute da una corsia del sequencer, generando così un unico file FASTQ per ciascun campione presenti in quella corsia. Successivamente, la legge d'ogni file FASTQ sono qualità tagliato utilizzando Trimmomatic con impostazione predefinita impostazioni 21. Le letture di profilati vengono mappate al genoma di riferimento di S. cerevisiae S288C (SGD R64-1-1_20110203) utilizzando TopHat2 con impostazione predefinita impostazioni 22. Infine, lo script utilizza HTSeq per determinare il numero di letture che eseguono il mapping a ogni funzionalità con annotazioni 19.
Il secondo script, "time_course_script. R", è anche stato scritto dagli autori e viene eseguito all'interno l' ambiente statistico R 24. Lo script inizialmente importazioni sono i dati di lettura totali generati da HTSeq. Ogni campione è presupposto per essere un punto di tempo e così è organizzato rispetto ad altri punti di tempo. La lettura raw conta è quindi importata il pacchetto R, DESeq2 25, al fine di identificare i geni differenzialmente espressi in uno dei punti di tempo rispetto al primo (vale a dire, aerobica, tempo 0). Grazie alla sua flessibilità, DESeq2 può essere utilizzato per eseguire altri test statistici, ad esempio se l'espressione cambia in funzione del tempo 13. In alternativa, altri strumenti che impiegano statistica parametrica e non parametrica per RNA-seq leggono i dati di conteggio potrebbero essere usato 20. Lo script quindi normalizza la lettura conta al controllo per il grado di sequenziamento di ogni campione e log2 trasforma i conteggi. Queste letture trasformate vengono utilizzate per eseguire analisi PCA, per determinare la massima variazione piega per ogni gene e per creare i grafici di espressione nella Figura 4.
Una questione importante è modo migliore di impiegare le statistiche per identificare geni che rispondono in modo significativo all'ipossia. Almeno tre repliche biologiche del corso tempo sono necessari per calcolare la variabilità naturale di ciascun gene e così determinare geni che rispondono all'ipossia in modo più significativo rispetto al previsto per caso. In alternativa, è possibile correttamente identificare geni che rispondere nel corso del tempo, senza repliche biologiche 13,25,38,39. Lo svantaggio principale di questi metodi è che non prendono in considerazione la variabilità biologica di ciascun gene. Tuttavia, se non vengono eseguite ripetizioni di RNA-seq, cambiamenti di espressione genica individuali possono essere verificati eseguendo che RT-qPCR con più biologico replica 13.
Ci sono due vantaggi principali per valutare più punti di tempo di una risposta. In primo luogo, come discusso in precedenza (soprattutto nella Figura 2), un corso di tempo identifica gli intervalli che esibiscono cambiamenti di grande espressione, informare se sono necessari per migliorare la risoluzione della cinetica o per osservare gli eventi successivi di tempo ulteriori punti il risposta. In secondo luogo, un corso a tempo consente la differenziazione della cinetica di espressione di ogni gene. Questo aiuta ad identificare le uniche vie di segnalazione che agiscono in momenti specifici durante la risposta e offre uno sguardo la tempistica di apertura e chiusura della segnalazione. In particolare, il clustering dei geni di pattern di espressione che è stata eseguita qui ha provocato set di geni co-regolati. I promotori di un set di gene possono condividere un sito di legame di fattore di trascrizione, suggerendo che il fattore di trascrizione diventa attivo quando i geni cambiano espressione.
Quando si studia una risposta cellulare, la variabilità osservata è idealmente a causa dello stimolo (per esempio, ipossia) e non ad altre variabili sperimentali. Tuttavia, come si vede nella Figura 2, il singolo ricercatore e/o i lotti di componenti multimediali fare maggiori contributi alla variabilità nell'espressione genica. Così, questi parametri dovrebbero essere considerati al fine di raggiungere un'elevata riproducibilità e minima variabilità sperimentale. Più breve tempo possibile deve separare ogni replica, perché variabili sperimentali sono più propensi a cambiare col passare del tempo.
In conclusione, questo metodo può essere utilizzato per monitorare con precisione le alterazioni del genoma nei livelli di mRNA (o altri eventi come modificazioni istoniche o i livelli della proteina) durante un corso di tempo di ipossia. Il metodo può essere adattato per altri organismi, soprattutto le specie microbiche che possono essere coltivate in coltura liquida. Tali analisi di tempo-corso di genoma completerà gli studi di morfologia delle cellule, attività della proteina e metabolismo. Insieme, questi dati porterà ad una comprensione più ricca di una risposta cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Ringraziamo l'Istituto Lewis-Sigler per Integrative Genomics Sequencing Core Facility all'Università di Princeton per consulenza tecnica e per il sequenziamento e preparazione di RNA biblioteca. Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni da Rowan University e NIH NIGMS R15GM113187 a Boy
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Enclosed dry incubator | Thermo Scientific | MaxQ 4000 | Set at 30 °C. Modify the door to allow entry of one Tygon tube. Alternatively, use the New Brunswick G25 incubator, which contains a tube port. Do not use an open-air water shaker, as condensation will collect in the tubes between flasks, possibly cross-contaminating cultures. |
| Micro-analysis Filter Holder | Millipore | XX1002530 | 25mm diameter, stainless steel support, no. 5 perforated silicone stopper mounts in standard 125 mL filtering flask |
| Strong vacuum | Edwards | E-LAB 2 | The “house” vacuum may be too weak. Alternatively, use an electric-power portable vacuum pump like the one listed here. |
| 1,000 mL flask | To act as vacuum trap. | ||
| ~2 foot lengths of Heavy Wall Vacuum Tubing, inner diameter 3/8 in, outer diameter 7/8 in | Tygon | 38TT | Two pieces: the first connects vacuum to trap, and the second connects trap to filter system. |
| High-pressure N2 gas tank | 99.999% purity, >1,000 psi, with a regulator and gas flow controller | ||
| Autoclaved 500 mL flask | Opening covered with aluminum foil. One for each yeast strain. | ||
| Autoclaved 250 mL flasks | Openings covered with aluminum foil. One for each time point plus two for water traps. | ||
| Flask stoppers (size 6, two holes with 5 mm diameter) | Sterilized with 70% ethanol. One for each flask. | ||
| Glass tubing, length 9 cm or 17 cm, inner diameter 2 mm, outer diameter 5 mm | Sterilized with 70% ethanol. Two tubes for each flask. Place into the holes of each stopper. See Figure 1 for placement of 9- vs 17- cm tubes. | ||
| ~25 cm lengths of plastic tubing, inner diameter 5 mm | Tygon | E-3603 | One piece for each flask. Sterilized with 70% ethanol. |
| Sterile filter discs | Millipore | HAWP02500 | 25 mm diameter, 0.45 µm pore size, one for each time point |
| Sterile dH2O (~100 mL) | |||
| 1 mL cuvettes | For measuring OD600 (i.e., cell concentration) | ||
| 50 mL sterile centrifuge tubes | One for each time point | ||
| Clean and sterile tweezers | |||
| liquid nitrogen | For freezing cells | ||
| acid-washed beads | Sigma | G8772 | Keep at 4 °C for lysing cells |
| Qiagen RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74104 | For RNA column purification |
| Qiagen RLT buffer | Prepare by adding 10 µL of β-Mercaptoethanol per 1 mL of RLT buffer, keep at 4 °C. | ||
| 2 mL collection tubes | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RPE | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| Buffer RW1 | Qiagen | included in the Qiagen Rneasy Mini Kit | |
| DNase I stock and working solutions | Qiagen | 79254 | The DNase I enzyme comes as lyophilized powder in a glass vial. Using a sterile needle and syringe, inject 550 µL of RNase-free water (provided in Qiagen kit) into the vial. Mix by gently inverting the bottle. To avoid denaturing the enzyme, do not vortex. Using a pipet, remove this stock solution from the vial and store in freezer (-20 °C) in single-use aliquots (80 µL each). The stock solution should not be thawed and refrozen. |
| Buffer RDD | Qiagen | included in the Qiagen DNase Kit | |
| Ice cold 2 mL screw-cap tubes | For lysing cells during RNA extraction | ||
| bead mill homogenizer | Biospec Mini-Beadbeater-24 | 112011 | Keep in cold room |
| Bacto Peptone | BD | DF0118 | for liquid YPD media |
| Bacto Yeast Extract | BD | DF0886 | for liquid YPD media |
| glucose | Fisher | D16 | for liquid YPD media |
| Qubit assay tubes | Thermo Fisher | Q32856 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM dsDNA BR Assay Kit | Thermo Fisher | Q32853 | for measuring nucleic acid concentration |
| Quant-iTTM RNA Assay Kit | Thermo Fisher | Q32855 | for measuring nucleic acid concentration |
| Qubit Fluorometer | Thermo Fisher | Q33216 | for measuring nucleic acid concentration |
| Commercial electrophoresis system | Agilent | Bioanalyzer 2100 | for measuring nucleic acid quality |
| Next-generation sequencer | Illumina | HiSeq 2500 | for sequencing libraries |
| automated liquid handling system | Wafergen | Apollo 324 | for creating sequencing libraries |
| PrepX PolyA mRNA Isolation Kit | Wafergen | 400047 | for isolating mRNA from total RNA |
| PrepX RNA SEQ for Illumina Library Kit | Wafergen | 400039 | for creating strand-specific sequencing libraries from total RNA |
| Barcode Splitter | https://toolshed.g2.bx.psu.edu/repository?repository_id=7119c4f7a89efa57&changeset_revision=e7b7cdc1834d | ||
| Samtools, which includes the gzip command | http://www.htslib.org/download/ | ||
| Trimmomatic | http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic | ||
| Bowtie2 (installed before TopHat) | http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml | ||
| TopHat | https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml | ||
| HTSeq | http://www-huber.embl.de/HTSeq/doc/overview.html | ||
| R (installed before R Studio) | https://cran.rstudio.com | ||
| R Studio (free version) | https://www.rstudio.com/products/rstudio/download/ |
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