Summary
हम एक इन विट्रो मॉडल जो अध्ययन और पूरे, गैर anticoagulated रक्त में जमावट के विश्लेषण की अनुमति देता है पेश करते हैं । प्रणाली में एंटिकोगुलेशन स्वस्थ endothelial कोशिकाओं के प्राकृतिक एंटिकोगुलेशन प्रभाव पर निर्भर करता है और endothelial कोशिका सक्रियण के थक्के में परिणाम होगा ।
Abstract
vivo में, endothelial कोशिकाओं रक्त संचार के प्राकृतिक एंटिकोगुलेशन के लिए महत्वपूर्ण हैं । नतीजतन, endothelial सेल सक्रियण रक्त जमावट की ओर जाता है । यह घटना कई नैदानिक स्थितियों में मनाया जाता है, पूर्व की उपस्थिति में अंग प्रत्यारोपण की तरह-विरोधी दाता एंटीबॉडी xenotransplantation सहित, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से ischemia में/reperfusion चोट । आदेश में 3R मानकों के अनुसार पशु प्रयोग को कम करने के लिए (कमी, प्रतिस्थापन और शोधन), इन विट्रो मॉडल रक्त जमावट पर endothelial कोशिका सक्रियण के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक वांछनीय होगा. हालांकि, endothelial सेल संस्कृति के आम flatbed प्रणालियों के 1-5सेमी 2 रक्त की प्रति मिलीलीटर, जो प्राकृतिक, endothelial मध्यस्थता एंटिकोगुलेशन के लिए पर्याप्त नहीं है की एक सतह से मात्रा अनुपात प्रदान करते हैं । microcarrier मोतियों पर संवर्धन endothelial कोशिकाओं ४०-१६० cm2/mL. के लिए सतह से मात्रा अनुपात बढ़ सकता है यह बढ़ा हुआ अनुपात पूरे रक्त के ' प्राकृतिक ' एंटिकोगुलेशन को सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त है, ताकि थक्का के उपयोग से बचा जा सके. यहां एक इन विट्रो microcarrier-आधारित प्रणाली पूरी, गैर anticoagulated मानव रक्त के जमावट पर सुअर endothelial कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधन के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए वर्णन किया गया है । वर्णित परख में, प्राथमिक सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं, या तो जंगली प्रकार (WT) या ट्रांसजेनिक मानव CD46 और thrombomodulin के लिए, microcarrier मोतियों पर बड़े हो रहे थे और फिर हौसले से तैयार गैर anticoagulated मानव रक्त से अवगत कराया । यह मॉडल माप और cytokine रिहाई के साथ ही पूरक और रक्त प्लाज्मा में जमावट के सक्रियण मार्कर के ठहराव के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, सक्रिय endothelial सेल और इम्युनोग्लोबुलिन के जमाव की इमेजिंग, पूरक और endothelialized मोतियों पर जमावट प्रोटीन फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदर्शन किया गया । इस परख भी दवाओं जो endothelial सेल सक्रियकरण को रोकने के लिए और, इस प्रकार, जमावट माना जाता है परीक्षण किया जा सकता है । अपनी क्षमता के शीर्ष पर इस तरह की जांच के लिए इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम करने के लिए, वर्णित परख प्रदर्शन करने के लिए और लगातार प्रतिलिपि आसान है ।
Introduction
संवहनी endothelium endothelial कोशिकाओं (ईसी) जो रक्त वाहिकाओं के लुमेन लाइन की एक monolayer के होते हैं । एक शारीरिक स्थिति में, quiescent चुनाव आयोग एक थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ वातावरण के रखरखाव के लिए जिंमेदार हैं । 1 यह चुनाव आयोग की सतह पर थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ प्रोटीन की अभिव्यक्ति द्वारा मध्यस्थता है । उदाहरण के लिए, चुनाव आयोग के ischemia/reperfusion चोट या संवहनी अस्वीकृति की वजह से (एक्सो-) प्रत्यारोपण अंगों एक थक्कारोधी और विरोधी भड़काऊ राज्य से एक समर्थक कौयगुलांट और समर्थक भड़काऊ करने के लिए endothelial सतह के परिवर्तन में परिणाम राज्य. 1
endothelium और जमावट कारकों के बीच आकर्षक और जटिल बातचीत का अध्ययन करने के लिए, इन विट्रो मॉडल जो के रूप में निकटता के रूप में संभव के रूप में नकल में vivo स्थिति अत्यधिक वांछनीय हैं । एक आम सीमा है जो इन विट्रो जमावट परख में पारंपरिक की विशेषता है anticoagulated रक्त जो जमावट की मध्यस्थता प्रभाव दुरूह और यहां तक कि recalcification पूरे रक्त की प्रतिलिपि नहीं बना सकते है के विश्लेषण बनाता है का उपयोग है ताजा गैर anticoagulated रक्त के साथ परिणाम प्राप्य । 2 इसके अलावा, पारंपरिक फ्लैट बिस्तर सेल संस्कृति प्रणालियों में यह endothelium के थक्कारोधी गुणों का दोहन करने के लिए असंभव है के रूप में रक्त की मात्रा प्रति पर्याप्त endothelial कोशिका सतह तक नहीं पहुंचा जा सकता है । यहां प्रस्तुत मॉडल गोलाकार microcarrier मोतियों की सतह पर संवर्धन चुनाव आयोग द्वारा इन सीमाओं पर काबू पा, इतना है कि एक चुनाव आयोग की सतह के लिए रक्त अनुपात & #62; 16 सेमी2/mL तक पहुंचा जा सकता है, जो छोटे धमनियों या नसों में स्थिति के समान है, और जिसमें ईसी सरफेस द्वारा खून की "नेचुरल" एंटिकोगुलेशन को अनुमति देने के लिए पर्याप्त बताया गया था । 3 , 4 पूरे रक्त का उपयोग इस सेटिंग में जोड़े गए थक्का के बिना किया जा सकता है । रक्त के नमूनों प्रयोग और साइटोकिंस के दौरान एकत्र किया जा सकता है, जमावट कारकों और घुलनशील पूरक सक्रियण मार्करों का पता लगाया जा सकता है और मात्रा. इसके अलावा, चुनाव आयोग लेपित microcarrier मोती पूरक के लिए विश्लेषण किया जा सकता है और immunoglobulin बयान के रूप में के रूप में अच्छी तरह से फोकल माइक्रोस्कोप द्वारा चुनाव आयोग सक्रियकरण मार्करों की अभिव्यक्ति । एक और दिलचस्प आवेदन endothelial सेल सक्रियण को रोकने के लिए और, इस प्रकार, जमावट माना जाता है जो दवाओं के परीक्षण भी शामिल है । 5 हालांकि इस मॉडल को पूरी तरह से पशु प्रयोग की जगह नहीं कर सकते, यह एक विधि प्रदान करता है विशिष्ट कार्यात्मक परिकल्पनाओं का परीक्षण करने के लिए पूर्व vivo कोशिकाओं का उपयोग और इस प्रकार ischemia पर बुनियादी अनुसंधान में इस्तेमाल जानवरों की संख्या को कम/reperfusion चोट या (एक्सो) ट्रांसप्लांटेशन ।
वर्णित मॉडल एक xenotransplantation सेटिंग जिसमें सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं (PAEC) microcarrier मोतियों पर बड़े हो रहे है और पूरे, गैर anticoagulated मानव रक्त के साथ मशीन की नकल करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । विभिंन ट्रांसजेनिक PAEC, इस तरह के पूरक प्रणाली के विनियमन के लिए CD46 के रूप में कई मानव जीन ले जाने और/या जमावट प्रणाली के विनियमन के लिए thrombomodulin (hTBM), उनके थक्कारोधी गुणों के लिए विश्लेषण किया गया । Endothelial सेल सक्रियण, पूरक, और जमावट प्रणालियों कसकर नियंत्रित कर रहे हैं और परस्पर । 6 यह समझने के लिए कि कैसे अलग ट्रांसजेनिक कोशिकाओं आसंजन अणु अभिव्यक्ति और cytokine रिहाई के संबंध में मानव रक्त के संपर्क के बाद व्यवहार महत्वपूर्ण है, glycocalyx और थक्कारोधी प्रोटीन के नुकसान का छप्पर । 7
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Protocol
- प्री-कोट एक 6-वेल प्लेट विथ fibronectin १२.५ & #181; g/mL में एमएल 1x और यह ३७ पर एक मशीन में जगह & #176; C for 1 h.
- पूर्व गर्म बाँझ पंजाबन 1x और सेल कल्चर मीडियम (DMEM).
- परिवहन माध्यम से सुअर महाधमनी बाहर ले.
- महाधमनी को polystyrene प्लेट पर रखें ।
- धीरे पहले से गर्म पंजाबियों के साथ फ्लश ।
- महाधमनी longitudinally को काट कर उसे सुइयों के साथ ठीक कर लें.
- भीतरी पोत सतह पर गर्म कोशिका संस्कृति माध्यम जोड़ें ।
- महाप्राण fibronectin-कोशिका संस्कृति माध्यम और ताजा सेल कल्चर मीडियम जोड़ें (DMEM 10% FBS के साथ पूरक, 1% पेनिसिलिन/streptomycin और ०.४% Endothelial सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स).
- सेल संस्कृति माध्यम में एक कपास झाड़ू सोख । भीतरी पोत की सतह के बहुत ऊपर धीरे और एक ही दिशा में धीरे से कपास ऊन कली झाड़ू ।
- एक अच्छी तरह से 6-खैर प्लेट दौर से गोल में कोशिकाओं रगड़ ।
- बाकी कुओं के लिए भी ऐसा ही करते हैं.
- माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं की जांच करें और ३७ पर मशीन में 6-खैर प्लेट जगह & #176; ग, 5% कं 2 .
- दूसरे दिन पर मध्यम परिवर्तन और इसे फिर से बदल हर 2-3 दिन ।
- जब कोशिकाओं को धाराप्रवाह होने जा रहे हैं, trypsinize कोशिकाओं और उंहें एक T75 कुप्पी (PAEC P1) में बीज ।
- पूर्व कोट एक 8 अच्छी तरह से chamberslide with fibronectin १२.५ & #181; g/मब में एमएल 1x और यह ३७ पर एक मशीन में जगह & #176; ग के लिए 1 ज.
- बीज 5 x 10 4 कक्ष/३७ & #176; C. पर मशीन में रातोंरात मशीन/
- के साथ दो बार कोशिकाओं को धो लें + + (पंजाबियों के साथ पूरक CaCl 2 और MgCl 2 ), ३०० & #956; L/ठीक है ।
- फिक्स कोशिकाओं ३.७% paraformaldehyde के लिए 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर, २०० & #956; L/
- वॉश सेल 3 बार के साथ पंजाब + + , ३०० & #956; L/
- Add ३०० & #956; पंजाबन 1x के एल-3% BSA (बफर अवरुद्ध) और कमरे के तापमान पर 30 मिनट छोड़ दें ।
- लागू प्राथमिक एंटीबॉडी (एंटी-VE-cadherin, एंटी-CD31, एंटी vWF) पंजाबियों में पतला 1x-1% BSA-०.०५% डिटर्जेंट, १६० & #956; L/ठीक है और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
- धो 3 बार के साथ पंजाब + + (२०० & #956; L/
- लागू माध्यमिक एंटीबॉडी और पंजाब में पतला DAPI 1x-1% BSA-०.०५% डिटर्जेंट, १६० & #956; L/ठीक है, और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
- धो 3 बार के साथ पंजाब + + (२०० & #956; L/
- माउंट ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते मध्यम और सत्यापित endothelial सेल मार्करों अभिव्यक्ति एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप के तहत के साथ स्लाइड ।
नोट: Culture सुअर महाधमनी endothelial कोशिकाओं में एक T175 कुप्पी (DMEM कम ग्लूकोज मीडियम + 10% FBS, 1% पेनिसिलिन/streptomycin और ०.४% endothelial सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स) तक ९०% संगम तक पहुँच गया है । (सीडिंग घनत्व १ x १० ६ कक्ष, ९०% संगम मोटे तौर पर ५ एक्स १० ६ कोशिकाओं के अनुरूप).
- एक ५०-एमएल ट्यूब में ४२ मिलीलीटर कोलेजन समाधान के साथ Microcarrier मोतियों की 7 मिलीलीटर मिश्रण (१०० & #956; g/एमएल, एक ०.२% एसिटिक एसिड समाधान में पतला) और कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए मशीन ।
- धो मोती दो बार पंजाब के 25 मिलीलीटर पीएच ७.४ के साथ (पंजाब के 25 मिलीलीटर जोड़ें, प्लास्टिक के साथ अच्छी तरह से मिश्रण है और इंतजार जब तक मोती नीचे बसा रहे है तो supernatant और दोहराने) और DMEM मध्यम के 25 मिलीलीटर के साथ एक बार छोड़ दें ।
- ५०-एमएल ट्यूब मध्यम १९९ 10% FBS के साथ पूरक के 10mL के साथ में मोतियों को कवर, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 1% L-Glutamine, ०.४% Endothelial सेल ग्रोथ मीडियम सप्लीमेंट मिक्स और 25 & #956; एल ऑफ हेपरिन (५००० IU/एमएल) और 10 मिनट के लिए equilibration की अनुमति आगे उपयोग करने से पहले.
- PAEC युक्त T175 कुप्पी से सेल संस्कृति माध्यम को हटाने और पंजाब पीएच ७.४ के 5 मिलीलीटर जोड़ें ।
- निकालो T175 कुप्पी से.
- Trypsin के 5 मिलीलीटर जोड़ें-०.०५% EDTA और 3-4 मिनट के लिए मशीन ३७ & #176; C.
- सेल संस्कृति माध्यम के 15 मिलीलीटर के साथ कुप्पी धोने और निलंबन एक ५०-एमएल ट्यूब में स्थानांतरण द्वारा कोशिकाओं को इकट्ठा ।
- कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए १,२०० x g पर कोशिकाओं केंद्रापसारक, अतिरिक्त मध्यम निकालें और सेल संस्कृति माध्यम के 5 मिलीलीटर में गोली reसस्पेंड ।
- सेल संस्कृति माध्यम के 20 मिलीलीटर सेल निलंबन और reसस्पेंड करने के लिए जोड़ें ।
- 20 मिलीलीटर सेल संस्कृति मध्यम (w/५००-मिलीलीटर चुंबकीय सरगर्मी कुप्पी में जोड़ें ।
- कदम ३.३ से धोया microcarrier मोतियों के लिए कोशिकाओं को जोड़ने और एक 25 मिलीलीटर सीरम पिपेट के साथ ध्यान से मिश्रण ।
- चुंबकीय स्पिनर कुप्पी में मोती/सेल मिश्रण स्थानांतरण ।
- कुल्ला ५०-एमएल ट्यूब सेल संस्कृति मध्यम के 10 मिलीलीटर के साथ शेष कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए ।
- स्पिनर कुप्पी में सेल संस्कृति माध्यम के एक अतिरिक्त ८५ मिलीलीटर जोड़ें और यह रात भर मशीन में ३७ & #176 पर; सी एक शेखर पर (१०० एक्स जी, मिश्रण अंतराल: 3 मिनट हर ४५ मिनट).
- जोड़ें ५० एमएल सेल संस्कृति मध्यम (कुल मात्रा २०० मिलीलीटर) और अतिरिक्त 24 के लिए सरगर्मी जारी रखें ३७ & #176 पर; C एक शेखर पर (१०० x g, मिश्रण अंतराल: 3 मिनट हर ४५ मिनट).
- जोड़ बेरंग RPMI मध्यम (पूरक के साथ 10% FBS, 1% पेनिसिलिन/streptomycin, 1% L-Glutamine, ०.४% के Endothelial सेल विकास मध्यम पूरक मिश्रण और 25 & #956; L of हेपरिन) तक कुल मात्रा का ३२० मिलीलीटर तक पहुँच गया है.
- हर ४८ एच माध्यम की जगह: पुराने मध्यम के १०० मिलीलीटर निकालें और ताजा पूरक बेरंग RPMI के १०० मिलीलीटर जोड़ें ।
- संस्कृति 5 से 7 दिनों के लिए कोशिकाओं । समय कोशिका लेपित मोतियों की संगम अवस्था पर निर्भर करता है ।
- कलेक्ट २०० & #956; सेल लेपित मोतियों की एल एक पिपेट का उपयोग कर और उंहें एक इंच ट्यूब में स्थानांतरण ।
- धो के मोतियों को 3 बार ६०० & #956 के साथ; पंजाबज़ 1x के एल (पंजाबियों जोड़ें, ट्यूब झुकाव और धीरे मिश्रण कोशिकाओं की टुकड़ी से बचने के लिए, नीचे बसने के लिए मोती इंतजार, पंजाबियों और दोहराने को छोड़).
- 10 मिनट के लिए मोतियों को जोड़कर ठीक कर २०० & #956; parapicric अम्ल के एल.
- धो 3 बार ६०० & #956 के साथ; पंजाबज़ 1x के L
- DAPI पंजाब में पतला जोड़ें 1x और 10 min. के लिए मशीन
- एक गिलास स्लाइड पर मोती हस्तांतरण और एक coverslip लागू ग्लिसरॉल आधारित बढ़ते माध्यम का उपयोग कर ।
- एक फोकल माइक्रोस्कोप के तहत मोतियों की कल्पना ।
- चुंबकीय सरगर्मी से सेल लेपित मोती निकालें कुप्पी (प्रक्रियाओं बाँझ शर्तों के तहत किया जा करने के लिए नहीं है) एक 10-एमएल सीरम पिपेट के साथ और उन्हें 12 मिलीलीटर राउंड-बॉटम के ट्यूब में हस्तांतरण.
- चलो मोती नीचे (1-2 मिनट के आसपास) बसने और अतिरिक्त मध्यम निकालें ।
- ट्यूबों के लिए और अधिक मोती जोड़ने जब तक हर ट्यूब बिल्कुल मोती के 2 मिलीलीटर शामिल हैं ।
- प्रत्येक ट्यूब के लिए 5 मिलीलीटर स्पष्ट RPMI जोड़ें और ध्यान से एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट. का उपयोग कर मिश्रण
- चलो मोती नीचे बसने और अतिरिक्त मध्यम निकालें ।
- RPMI के साथ एक और समय धोने की प्रक्रिया को दोहराने और सभी अतिरिक्त माध्यम को हटा दें ।
- ध्यान से और धीरे (न तो जेट और न ही vacutainers का उपयोग) एक स्वस्थ स्वयंसेवक से रक्त आकर्षित और यह 9 मिलीलीटर तटस्थ के ट्यूब (कोई थक्कारोधी) में इकट्ठा ।
- धीरे से एक 10 मिलीलीटर सीरम पिपेट के साथ रक्त के 8 मिलीलीटर हस्तांतरण सेल लेपित मोती के 2 मिलीलीटर (कुल मात्रा 10 मिलीलीटर होगा) युक्त के प्रत्येक में । हमेशा समय से पहले ईसी सक्रियण से बचने के लिए रक्त या मोतियों की किसी न किसी से निपटने से बचें । प्रक्रिया लेता है 1-2 min.
- ध्यान से रक्त/मनका मिश्रण को बराबर मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए झुकाव और तेल फिल्म के साथ टोपी सील ।
- जगह एक क्षैतिज झुकाव मेज पर ट्यूबों (केवल कोमल झुकाव सेटिंग्स के साथ) एक ३७ & #176 के अंदर, सी मशीन और रिकॉर्ड थक्के बार ।
- निर्धारित समय अंतराल पर, जैसे 10, 20, 30, ५०, ७०, ९० मिनट के बाद, सीरम या प्लाज्मा विश्लेषण के लिए रक्त-मनका मिश्रण के कम से कम १.५-2 मिलीलीटर निकालें.
नोट: 6 समय अंक के लिए हम अधिक से अधिक 3 कोशिकाओं के एक समूह के भीतर दोहराने की, के रूप में रक्त का नमूना अलग ट्यूबों में किया जाएगा सुझाव ।
सीरम के संग्रह के लिए - , coagulate के लिए रक्त छोड़ दें । प्लाज्मा इकट्ठा करने के लिए, रक्त के नमूनों को जोड़ने से पहले 2 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए EDTA या साइट्रेट जोड़ें ।
- स्टोर बर्फ पर ट्यूबों, २,५०० पर 10 मिनट के लिए एक्स जी में 4 & #176; सी और स्टोर सीरम/प्लाज्मा पर ८० & #176; c तक उपयोग.
नोट: सामग्री पर विवरण सामग्री के तालिका में प्रदान की जाती हैं
- निर्धारित समय अंतराल पर, जैसे 10, 20, 30, ५०, ७०, ९० मिनट के बाद, सीरम या प्लाज्मा विश्लेषण के लिए रक्त-मनका मिश्रण के कम से कम १.५-2 मिलीलीटर निकालें.
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Representative Results
ऑफ कल्चर के 7-10 दिनों के बाद ऑफ स्पिनर कुप्पी(चित्रा १) में कोशिकाएँ धाराप्रवाह थीं, microcarrier मोतियों की पूरी सतह(चित्रा २) को कवर कर रही थीं. microbeads पर चुनाव आयोग के एक गैर-धाराप्रवाह monolayer के थक्के समय में एक चिह्नित कमी को बढ़ावा मिलेगा, क्योंकि प्रभावित राज्य के सत्यापन एक महत्वपूर्ण कदम है microcarrier ' मोती सतह दिया जोरदार समर्थक कौयगुलांट (थक्के समय: 4 ± 1 मिनट) ( चित्रा 3) ।
एक अंय महत्वपूर्ण बिंदु है जो ध्यान की जरूरत है झुका प्लेट की गति है । एक उच्च झुकाव गति रक्त के थक्के में वृद्धि होगी । अगर चुनाव आयोग के एक monolayer microcarrier मोतियों की सतह पर मौजूद था थक्के समय की एक लालसा मनाया जा सकता है । GalTKO/hCD46/hTBM ट्रांसजेनिक PAEC के उपयोग के थक्के समय में एक महत्वपूर्ण वृद्धि दिखाई WT PAEC की तुलना में (चित्रा 3) । लड़की के अभाव-α-1, 3-PAEC पर लड़की xenoantigen (GalTKO) थक्के समय में वृद्धि (PAEC WT के लिए 25 ± 8 मिनट और PAEC GalTKO के लिए ६८ ± 30 मिनट) दिखाया । थक्के समय में एक और मजबूत वृद्धि मनाया गया जब PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier मोती (२०५ ± ३२ मिनट) है, जो दोनों पूरक (hCD46) और जमावट प्रणालियों (hTBM) के एक सफल मॉडुलन पता चलता है पर मौजूद थे । प्रयोग के अंत में परिभाषित किया जाता है जब एक दिखाई थक्का बना है । समूह के एक ही के नमूनों के भीतर परिवर्तनशीलता दोनों अंतर परख-परिवर्तनशीलता और रक्त दाता के कारण है । हर प्रयोग 3 दोहराने और हर बार एक अलग रक्त दाता के लिए डेटा की विश्वसनीयता बढ़ाने के लिए इस्तेमाल किया गया था । प्रत्येक दाता के लिए, एक रक्त विश्लेषण (प्लेटलेट काउंट, WBC, आरबीसी, HCT और अंय मापदंडों) बाहरी स्वास्थ्य प्रयोगशालाओं द्वारा किया गया था । चित्रा 3 में दिखाए गए परिणाम अलग अलग रक्त दाताओं के साथ प्रदर्शन किया विभिन्न प्रयोगों से प्राप्त कर रहे हैं ।
चित्रा 1: Microcarrier के योजनाबद्ध प्रतिनिधित्व-परख आधारित है । (क) चुनाव आयोग T175 कुप्पी में विस्तार किया और (ख) स्पिनर कुप्पी में एक साथ कोलेजन-लेपित microcarrier मोतियों के साथ हस्तांतरित कर रहे हैं । (ग) ताजा गैर anticoagulated रक्त एक स्वस्थ स्वयंसेवक से एकत्र किया जाता है, (डी) चुनाव आयोग लेपित microcarrier मोतियों के साथ मिश्रित है, और ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन । वाक्यांश "गैर anticoagulated रक्त" का मतलब है कि रक्त किसी भी थक्कारोधी के साथ इलाज नहीं किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 2: चुनाव आयोग पर धुंधला इम्यूनोफ्लोरेसेंस-लेपित Microcarrier मोती । Microcarrier मोतियों को प्राप्त किया गया था और CD31 के लिए दाग (PECAM-1) के लिए प्रवाह का आकलन । नाभिक नीले (DAPI) में दाग थे और CD31 लाल (Cy3) में दाग था । स्केल बार: १०० माइक्रोन । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
चित्रा 3: अलग चुनाव आयोग के थक्के बार. थक्के बार नेत्रहीन निर्धारित किए गए थे और प्रयोग के अंत में परिभाषित किया गया था जब एक दृश्य थक्का मनाया गया था । एक मजबूत procoagulant प्रभाव मनाया जब गैर चुनाव आयोग लेपित microcarrier मोती पूरे गैर anticoagulated मानव रक्त के संपर्क में थे । लड़की के अभाव-α-1, 3-PAEC पर लड़की xenoantigen (GalTKO) थक्के समय में वृद्धि (PAEC WT के लिए 25 ± 8 मिनट और PAEC GalTKO के लिए ६८ ± 30 मिनट) दिखाया । PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier मोतियों पर मौजूद थे, जो दोनों पूरक (hCD46) और जमावट प्रणालियों (hTBM) का एक सफल मॉडुलन पता चलता है जब थक्के समय में एक और वृद्धि मनाया गया था. डेटा मतलब ± मानक विचलन के रूप में दिखाया जाता है । सांख्यिकीय विश्लेषण Bonferroni सुधार के साथ कई तुलना के लिए ANOVA का उपयोग किया गया है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।
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Discussion
यहां प्रस्तुत मॉडल जमावट से संबंधित अध्ययन और चुनाव आयोग के साथ अपनी बातचीत के विभिन्न पहलुओं के विश्लेषण की अनुमति देने के अध्ययनों के लिए उपयुक्त है । 8 xenotransplantation अनुसंधान में, यह मानव रक्त 9के साथ मशीन के बाद अलग आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर ईसीएस के थक्कारोधी गुणों का परीक्षण करने के लिए एक उपयोगी प्रणाली है ।
प्रोटोकॉल का सबसे महत्वपूर्ण कदम है कि प्रयोग शुरू करने से पहले microbeads की पूरी सेल कवरेज (प्रवाह) सुनिश्चित करने के उन है और सावधान संग्रह और गैर anticoagulated पूरे रक्त की हैंडलिंग से संबंधित उन समयपूर्व से बचने के लिए उच्च कतरनी तनाव के कारण प्लेटलेट सक्रियण, जो हो सकता है अगर vacutainers रक्त इकट्ठा करने के लिए उपयोग किया जाता है । 10 फिर भी, इस प्रणाली के एक पुनर्संचारी बंद प्रणाली और शारीरिक कतरनी तनाव है जो बेहतर vivo स्थितियों में प्रतिनिधित्व करेंगे के अभाव सहित कुछ सीमाएं हैं ।
इन सीमाओं के बावजूद, वर्णित मॉडल वर्तमान में मौजूदा मॉडलों पर महत्वपूर्ण लाभ प्रदान करता है । कारण microcarrier मोतियों के उपयोग के लिए, चुनाव आयोग की सतह रक्त की मात्रा के अनुपात में वृद्धि हुई है, की स्थापना की अनुमति विरोधी कौयगुलांट और विरोधी भड़काऊ वातावरण और गैर anticoagulated पूरे खून का उपयोग करें । वर्तमान फ्लैट में बिस्तर सेल संस्कृति मॉडल, यह संभव नहीं है और तंत्र जो रक्त चुनाव आयोग सक्रियण के कारण थक्के शामिल इसलिए अक्सर पशु प्रयोग के उपयोग की आवश्यकता है । भाग में, इस वर्णित microcarrier मनका मॉडल का उपयोग कर बचा जा सकता है ।
इसके अलावा, इस प्रणाली के आवेदनों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए अनुमति देता है । अपनी बहुमुखी प्रतिभा अलग दवाओं या यौगिकों जो न केवल करने के लिए (एक्सो-) प्रत्यारोपण लेकिन यह भी मानव रोगों के लिए संबंधित है परीक्षण की संभावना में रहता है । endothelium और जमावट प्रणाली पर दवाओं के प्रभाव इम्यूनोफ्लोरेसेंस, एलिसा और मल्टीप्लेक्स निलंबन सरणी विश्लेषण द्वारा आसानी से मूल्यांकन किया जा सकता है । यह पहले एक अध्ययन में मानव thrombomodulin के ट्रांसजेनिक अभिव्यक्ति के प्रभाव पर एक xenotransplantation सेटिंग में किया गया था । 11
वर्णित विधि का एक संभव संशोधन गैर का संग्रह हो सकता है anticoagulated पूरे रक्त सीधे ट्यूबों जो पहले सेल लेपित मोतियों के साथ भर रहे है क्रम में पिपेट का उपयोग करके हवा से संपर्क करें और रक्त सक्रियण को कम करने के लिए । मानव महाधमनी endothelial कोशिकाओं (HAEC) का उपयोग एक दिलचस्प नियंत्रण हो सकता है और पहले से ही भविष्य की योजनाओं में शामिल किया गया है । ट्यूब के आर्गन टॉपिंग के थक्के झरना के सक्रियण संपर्क करने के लिए नेतृत्व करने के लिए जाना जाता है, जो हवा के साथ गैर anticoagulated रक्त के संपर्क को कम करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । यदि रक्त भी जल्दी से तैयार की है, उदाहरण के लिए रबर stopcocks के साथ निर्वात ट्यूब का उपयोग करके और एक ठीक जेट में ट्यूब में रक्त शुरू करने, तो प्लेटलेट्स सक्रिय हो जाते हैं और जमावट जल्दी ही हो जाएगा. प्लेटलेट सक्रियण से बचने के लिए, बड़े व्यास hypodermic सुई (21ɢ-16ɢ) का उपयोग करें ।
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Disclosures
लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
इस अध्ययन को स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (SNSF, ग्रांट नो 320030_156193) ने समर्थन दिया था । लेखकों ने डॉ॰ Benoît Werlen को Biosilon microcarrier मोतियों की माला प्रदान करने के लिए धन्यवाद दिया । हम भी microcarrier मनका मॉडल की स्थापना के साथ मदद के लिए प्रो हंस पीटर कोल और प्रो आंद्रे Haeberli धंयवाद ।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit - FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2 mL in 500 mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
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