Summary
우리는 전체, 비 anticoagulated 혈액에서 응고의 분석과 연구를 허용 하는 체 외에서 모델 제시. 그리고 시스템에 anticoagulation 건강 한 내 피 세포의 자연 anticoagulation 효과에 따라 내 피 세포 활성화 응고 귀 착될 것 이다.
Abstract
Vivo에서, 내 피 세포는 혈액 순환의 자연 anticoagulation에 대 한 중요 한. 따라서, 내 피 세포 활성화 혈액 응고에 지도 한다. 국 소 빈 혈 또는 reperfusion 상해에서 뿐만 아니라 장기 이식 xenotransplantation를 포함 하 여 미리 형성 된 안티 기증자 항 체의 존재 처럼 많은 임상 상황에서이 현상이 관찰 됩니다. 3R 표준 (감소, 교체 및 수정), 생체 외에서 모델 내 피 세포의 효과 연구에 따르면 동물 실험을 감소 시키기 위하여 활성화 혈액 응고에 매우 바람직한 것 이다. 그러나, 내 피 세포 배양의 일반적인 평판 시스템은 자연, 내 피-중재 anticoagulation에 대 한 충분 한 혈액의 mL 당 피 내 막의 1-5 c m2 의 표면-볼륨 비율을 제공 합니다. Microcarrier 구슬에 내 피 세포를 배양 하는 것은 표면 볼륨 비율 40-160 cm2/mL을 증가할 수 있습니다. 이 증가 비율은 전체 혈액의 "자연" anticoagulation 되도록 충분 한 응고의 사용을 피할 수 있도록 합니다. 여기는 생체 외에서 microcarrier 기반 시스템 전체를 비 anticoagulated 인간의 혈액의 응고에 돼지 내 피 세포의 유전자 조작의 효과 공부 설명 되어 있습니다. 기술된 분석 결과, 기본 돼지 대동맥 내 피 세포, 중 야생 종류 (WT)에서 또는 유전자 변형 인간 CD46 thrombomodulin, 했다 microcarrier 구슬에 성장 그리고 다음 갓 그려진된 비 anticoagulated 인간의 혈액에 노출. 이 모델은 측정 및 활성화로 사이토카인 방출의 정량화에 대 한 보완 및 혈액 플라스마에 응고의 마커 수 있습니다. 또한, 활성화 된 내 피 세포와 면역 글로불린의 증 착의 이미징, 보완 및 응고 단백질 endothelialized 구슬에 confocal 현미경 검사 법에 의해 수행 되었습니다. 이 분석 결과 또한 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물 테스트를 사용할 수 있습니다. 그런 수사에 사용 되는 동물의 수를 줄이기 위해 그것의 잠재력, 위에 설명 된 분석 결과 수행 하기 쉽고 일관 되 게 재현할 수입니다.
Introduction
단층 선 루멘 혈관의 내 피 세포 (EC)의 혈관 내 피에 의하여 이루어져 있다. 생리 적인 상태에서 무부하 EC는 응고 제와 항 염증 제 환경의 유지 보수에 대 한 책임이 있습니다. 1 이 응고 제와 항 염증 단백질 EC 표면에 표현에 의해 중재 됩니다. 예를 들어 EC 활성화 국 소 빈 혈 또는 reperfusion로 인 한 부상 또는 혈관 거부 (이종-) 이식의 내 피는 응고 제와 항 염증 상태에서 프로 응집과 프로-염증 성 변화에 장기 결과 상태입니다. 1
매혹적이 고 복잡 한 상호작용으로 모방 하는 체 외에서 모델 endothelium 및 응고 요인 연구 가능한 vivo에서 상황 매우 바람직한 있습니다. 기존의 시험관에 응고 분석 실험을 짓는 일반적인 제한 anticoagulated 혈액 응고 중재 효과의 분석 힘든 게의 사용 이며 심지어 recalcification citrated 전체 혈액의 복제 수 없습니다. 신선한 비 anticoagulated 혈액으로 얻을 수 있는 결과. 2 사실, 전통적인 침대 형 세포 배양 시스템에서 그것은 혈액 볼륨 당 충분 한 내 피 세포 표면에 도달 하실 수 없습니다 endothelium의 항 응 혈 약 속성을 이용할 수 있습니다. 여기에 제시 된 모델 구형 microcarrier 구슬의 표면에 EC를 경작 하 여 이러한 한계를 극복 있도록 EC 표면 혈액 비율의 > 작은 arterioles 또는 정 맥, 상황에 비슷한 16 cm2/mL 도달 될 수 있다 고 EC 표면에 의해 혈액의 "자연" anticoagulation 수 있도록 충분 한 것 설명 했다. 3 , 4 전체 혈액이이 설정에서 추가 응고 없이 사용할 수 있습니다. 혈액 샘플을 실험 하 고 cytokines, 응고 요인 동안 수집 될 수 있습니다 고 수용 성 보수 활성화 마커를 감지 및 측정할 수 있습니다. 또한, EC 코팅 microcarrier 구슬 EC 활성화 마커의 식으로 보완 및 면역 증 착 confocal 현미경 검사 법에 의해 분석 수 있습니다. 또 다른 흥미로운 응용 프로그램 내 피 세포 활성화 하 고, 따라서, 응고를 방지 하는 약물의 테스트 포함 되어 있습니다. 5 이 모델을 완전히 동물 실험 대체 수 없습니다, 비록 특정 기능 가설 비보 전 셀을 사용 하 여 테스트 하 고 따라서 국 소 빈 혈 또는 reperfusion에 기초 연구에 사용 된 동물의 수를 줄일 수 있는 방법을 제공합니다 부상 또는 (xeno) 이식.
설명된 모델 모방 xenotransplantation 돼지 대동맥 내 피 셀 (PAEC) microcarrier 구슬에 성장 하 고 전체, 비 anticoagulated 인간의 피와 알을 품는 사용 되었다. 보완 시스템 thrombomodulin 응고 시스템의 규정 (hTBM)의 규칙을 위한 CD46 등 여러 가지 인간 유전자를 운반 하는 다른 유전자 변형 PAEC 그들의 항 응 혈 약 속성에 대 한 분석 했다. 내 피 세포 활성화, 보수, 및 응고 시스템 긴밀 하 게 제어 하 고 상호 연결. 따라서 다른 유전자 변형 세포 접착 분자 식 및 cytokine 릴리스, 인간의 혈액에 노출 된 후 동작 하는 방법을 이해 하는 것이 중요 6 은 항 응 혈 약 단백질의 손실과 glycocalyx 흘리기. 7
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Protocol
독일 Landrace 돼지는 (야생 타입 지역 농가에서 사육 하 고 유전자 변형 동물 사육 분자 연구소와 생명 공학, 루드비히 막시밀리안 대학, 뮌헨, 독일에서 자란), 무게 40 k g, 30 킬로그램 사이 사용 되었다 이 연구는. 모든 동물이 물과 음식을 임의로 광고와 표준 조건 하에서 보관 되어 있었다. 모든 동물 실험은 스위스 동물 보호 법률 뿐만 아니라 치료와 실험 동물의 사용에 대 한 영국 동물 (과학적인 절차) 고 NIH 가이드에 따라 수행 했다. 모든 동물 연구 도착 지침 준수. Cantonal 수의학 서비스 (구획의 베른, 스위스)의 동물 실험 위원회 아니 모든 동물 절차를, 허가 승인 했다. BE70/14입니다. 실험 프로토콜 3R 원칙에 따라 세련 되었고 최신의 마 취와 통증 관리 동물의 수를 최소화 하 고 실험 하는 동안 스트레스와 통증을 동물의 노출을 줄일 하는 데 사용 했다.
피는 건강 한 개인에서 베른 대학 병원의 스위스 관할 및 윤리 지침에 따라 폐쇄 시스템 venipuncture에 의해 그려진 했다. 문구 " anticoagulated 비 혈액 " 어떤 응고 제와 혈액은 치료 되지 의미.
다음 단계는 무 균 조건 하에서 수행 됩니다. 기본 셀 문화 무 균 기법으로 친숙이 필요.
1. 절연의 PAEC
참고: 6 ~ 10 cm의 흉부 대동맥 세그먼트 3 ~ 6 개월의 나이 (다른 vivo에서 실험을 위해 사용)의 즉시 안락사 독일 Landrace 돼지에서 가져온 포함 하는 전송 매체 (DMEM + 1% 페니실린/스) 500 mL 유리병으로 옮겨.
- 미리 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 6 잘 플레이트 코트 x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치
- 미리 따뜻한 무 균 PBS 1 x와 셀 문화 매체 (DMEM).
- 전송 매체에서 돼지 대동맥 꺼내.
- 폴리스 티 렌 격판덮개에 대동맥 장소.
- 부드럽게 미리 따뜻한 PBS를 가진 플러시.
- 경도 대동맥을 잘라 고 바늘으로 수정.
- 내부 용기 표면에 따뜻한 세포 배양 매체 추가.
- Fibronectin 세포 배양 매체를 발음 하 고 신선한 세포 배양 매체 (DMEM 10 %FBS와 1% 페니실린/스 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 보충) 추가.
- 세포 배양 매체에서 한 면봉을 담근 다. 같은 방향으로 부드럽게 그리고 천천히 맨 내부 용기 표면에 목화 꽃 봉 오리를 면봉.
- 6 잘 플레이트의 한 잘에 셀 라운드 라운드 문.
- 우물의 나머지 부분에 대 한 동일한 작업을 수행.
- 현미경 세포를 확인 하 고 37 ° c, 5% CO 2 배양 기에서 6-잘 접시를 놓습니다.
- 둘째 날에는 매체를 변경 하 고 다시 2-3 일 마다 변경.
- 셀 confluent 될 거 야, trypsinize 셀 고 T75 플라스 크 (PAEC P1)으로 씨앗.
2. PAEC 특성화
- 미리 코트 fibronectin 12.5 µ g/mL PBS 1와 8 잘 chamberslide x 1 h. 위해 37 ° C에는 인큐베이터에 배치
- 5 x 10 4 셀/잘 씨와 37에 인큐베이터에서 밤새 품 어 ° c.
- PBS + + (PBS CaCl 2와 MgCl 2 보충), 두 번 셀 세척 300 μ/잘.
- 실내 온도에, 200 μ/잘 10 분 3.7 %paraformaldehyde 셀 수정.
- 셀 3 회 PBS + +, 300 μ/잘 씻어.
- PBS 1 x-3_% BSA (블로킹 버퍼)의 300 μ를 추가 하 고 실 온에서 30 분 두고.
- 1 차 항 체 (안티-VE-cadherin, 안티 CD31, 안티-vWF) PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ/잘에에서 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
- PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.
- 이차 항 체와 DAPI에서 PBS 1x-1%BSA-0.05% 세제, 160 μ, 잘 희석 적용 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
- PBS + + (200 μ/잘)를 가진 3 번 세척.
- 글리세롤 기반된 설치 매체와 함께 슬라이드를 탑재 하 고 내 피 세포 마커 식 형광 현미경 확인.
참고: 90% 합류까지 T175 플라스 크 (DMEM 낮은 포도 당 매체 + 10 %FBS, 1% 페니실린/스와 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4%)에 문화 돼지 대동맥 내 피 세포에 도달. (시드 밀도 1 x 10 6 셀, 90% 합류 해당 약 5 x 10 6 셀).
3. Microcarrier 구슬의 코팅
- 콜라겐 솔루션 50 mL 튜브 (100 μ g/mL, 0.2% 초 산 용액에 희석)의 42 mL와 함께 microcarrier 구슬의 7 mL를 혼합 하 고 실 온에서 1 h에 품 어.
- 구슬 두 번 PBS pH 7.4의 25 mL로 씻고 (25 mL PBS의 추가, 잘와 함께 혼합에 피펫으로 상쾌한 및 반복 구슬 다음 삭제 정착은 될 때까지 기다립니다) DMEM 매체의 25 mL와 함께 한 번.
- 커버 매체 199 10% 보충의 10 mL 50 mL 튜브에 구슬 FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 25 μ 헤 파 린 (5000 IU/mL)의 10 분에 대 한 평형 수 더 사용 하기 전에.
4. 세포를 수집
- PAEC 포함 된 T175 플라스 크에서 세포 배양 매체를 제거 하 고 PBS pH 7.4의 5 mL을 추가.
- T175 플라스 크에서 PBS 제거.
- Trypsin-0.05% EDTA의 5 mL을 추가 하 고 37에서 3-4 분 동안 품 어 ° c.
- 세포 배양 매체의 15 mL로 플라스 크를 rinsing 하 여 세포를 수집 하 고 전송 50 mL 튜브에 서 스 펜 션.
- 실 온에서 8 분 1200 x g에서 세포를 원심 초과 매체를 제거 하 고 세포 배양 매체의 5 ml에서는 펠 릿 resuspend.
5. 활동가 플라스 크로 셀 시드
- 세포 현 탁 액을 세포 배양 매체의 20 mL를 추가 하 고 resuspend.
- 자력 500 mL 플라스 크에 20 mL 세포 배양 (세포) 제외 추가.
- 단계 3.3에서에서 씻어 microcarrier 구슬에 셀을 추가 하 고 신중 하 게 25 mL 혈 청 학적인 피 펫 혼합.
- 자석 스피너 플라스 크에 구슬/셀 혼합 전송.
- 나머지 수집 하 세포 배양 매체의 10 mL 50 mL 튜브 린스.
- 스피너 플라스 크에 세포 배양 매체의 추가적인 85 mL를 추가 하 고 통에 37 ° C에서 하룻밤 인큐베이터에 배치 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).
- 세포 배양 매체의 50 mL를 추가 (전체 용량 200ml) 추가 24 h에 대 한 교 반 통에 37 ° C에서 계속 (100 x g, 혼합 간격: 3 분 마다 45 분).
- 추가 무색 RPMI 매체 (보충 10 %FBS, 1% 페니실린/스, 1 %L-글루타민, 내 피 세포 성장 매체 보충 믹스의 0.4% 및 헤 파 린의 25 μ) 320 mL 전체 볼륨에 도달할 때까지.
- 대체 매체 오래 된 매체의 모든 48 h: 제거 100 mL 및 100 mL 신선한 보충된 무색 RPMI의 추가.
- 5 ~ 7 일에 대 한 셀을 문화. 시간 셀 코팅 구슬의 합류 상태에 따라 달라 집니다.
- 는 피 펫을 사용 하 여 셀 코팅 구슬의 200 μ를 수집 하 고 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.
- 세척 3 회 PBS 1의 600 μ와 구슬 x (PBS, 추가 기울기는 튜브 셀의 분리를 피하기 위해, 구슬 대기를 부드럽게 혼합 정착, PBS 삭제 및 반복).
- Parapicric 산의 200 μ를 추가 하 여 10 분 동안 구슬 해결.
- X. PBS 1의 600 μ로 3 번 세척
- 추가 DAPI에서 PBS 1 희석 x 10 분에 대 한 품 어 및
- 구슬 유리 슬라이드에 전송과 coverslip 글리세롤 기반 설치 매체를 사용 하 여 적용.
- Confocal 현미경 구슬 시각화.
7. 실험 절차
- 10 mL 혈 청 학적인 피 펫으로 셀 코팅 구슬 (절차 없는 메 마른 조건 하에서 해야 할) 자력 플라스 크에서 제거 하 고 12 mL 라운드-하단 폴 리 프로필 렌 튜브에 그들을 전송.
- 구슬과 정착 (약 1-2 분) 초과 매체를 제거 하자.
- 구슬의 정확히 2 mL를 포함 하는 모든 튜브까지 관에 더 많은 구슬을 추가.
- 5 mL 분명 RPMI 각 튜브를 추가 하 고 신중 하 게 10 mL 혈 청 학적인 피 펫을 사용 하 여 혼합.
- 구슬과 정착 초과 매체를 제거 하자.
- RPMI와 한 번 더 세척 절차를 반복 하 고 모든 초과 매체 제거.
8. 보육 비-anticoagulated 피
- 신중 하 고 천천히 (를 사용 하 여 jet도 vacutainers) 혈액 건강 한 지원자에서 그리고 9 mL 중립 폴 리 프로필 렌 튜브 (응고 제)에서 수집.
- 천천히 각 셀 코팅 구슬 (10 mL 전체 볼륨 것입니다)의 2 개 mL를 포함 하는 폴 리 프로필 렌 튜브에 8ml 혈액 10 mL 혈 청 학적인 피 펫과의 전송 합니다. 항상 혈액 또는 조기 EC 활성화를 피하기 위해 구슬의 거친 처리를 하지 마십시오. 절차 1-2 분 소요
- 신중 하 게 동등한 혼합 및 파라핀 필름 뚜껑을 밀봉 하 피/비드 혼합물을 기울기.
- 수평 틸팅 테이블 (부드러운 기울기 설정만) 37 ° C 배양 기 및 기록 시간을 응고 내부에 튜브를 놓습니다.
- 설정된 시간 간격 예: 10, 20, 30, 50, 70, 90 분, 후 혈 청 또는 플라스마 분석을 위한 혈액 비드 혼합물의 1.5-2 mL 이상 제거.
참고: 6 시간 점 좋습니다 셀의 한 그룹 내에서 3 개 이상의 복제 데로 다른 튜브에 혈액 샘플링을 할 수. - 혈 청의 컬렉션에 대 한 혈액 응고를 두고. 플라즈마를 수집 하려면 추가 EDTA 또는 구 연산 2 mL 튜브에 혈액 샘플을 추가 하기 전에.
- 얼음에 튜브를 저장, 4 ° C에서 10 분 동안 2500 x g에서 원심 및 사용까지 80 ° C에서 혈 청/플라즈마를 저장.
참고: 자료에 자료의 테이블에에서 제공 됩니다
- 설정된 시간 간격 예: 10, 20, 30, 50, 70, 90 분, 후 혈 청 또는 플라스마 분석을 위한 혈액 비드 혼합물의 1.5-2 mL 이상 제거.
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Representative Results
스피너 플라스 크 (그림 1)에서 문화 7-10 일 후 셀 confluent microcarrier 구슬 (그림 2)의 전체 표면을 커버 했다. Confluency 상태 확인은 중요 한 단계는 microbeads에 EC의 비 합칠 단층 응고 시간 표시 감소로 이어질 것입니다 때문에, microcarrier는 주어진 구슬의 표면 강하게 직업 응고 (응고 시간: 4 ± 1 분) ( 그림 3).
주의 필요로 하는 또 다른 중요 한 포인트는 틸팅 격판덮개의 속도입니다. 고속 틸팅 혈액 응고 향상 됩니다. 응고 시간 연장 EC의 단층 있었다면 microcarrier 구슬의 표면에 현재 관찰 될 수 있었다. GalTKO/hCD46/hTBM 유전자 변형 PAEC 사용 WT PAEC (그림 3)에 비해 응고 시간에 상당한 증가 보였다. PAEC (GalTKO)에 여자-α-1, 3-여자 xenoantigen의 부재는 응고 시간 (25 ± PAEC WT에 대 일 분)와 68 ± PAEC GalTKO에 대 일 분에 증가 보여주었다. 응고 시간에 다른 강한 증가 PAEC GalTKO/hCD46/hTBM microcarrier 구슬에 있었으나 때 관찰 되었다 (205 ± 32 분), 보수 (hCD46) 및 응고 시스템 (hTBM)의 성공적인 변조를 건의 하. 실험의 끝 보이는 응고 형성 될 때 정의 됩니다. 같은 그룹의 샘플 내 다양성 둘 다 분석 결과 변화와 혈액 기증자 간 때문 이다. 모든 실험 했다 3 복제 그리고 다른 때마다 혈액 기증자 데이터의 신뢰성을 높이기 위해 사용 되었다. 각 기증자에 대 한 혈액 분석 (혈소판 수, WBC, RBC, HCT 및 다른 매개 변수)는 외부 의료 실험실에 의해 수행 되었다. 그림 3 에 표시 된 결과 다른 혈액 기증자를 사용 하 여 수행 하는 다른 실험에서 얻을 수 있습니다.
그림 1: Microcarrier 기반 분석 결과의 도식 대표. (A) EC T175 플라스 크에 확장 되 고 (B) 회전자 플라스 크 콜라겐 코팅 microcarrier 구슬 함께 전송. (C)는 건강 한 자원 봉사자, (D) EC 코팅 microcarrier 구슬, 혼합 하 고 37 ° c.에 인 큐베이 팅에서 신선한 비 anticoagulated 혈액 수집 어구 "비 anticoagulated 혈액" 어떤 응고 제와 혈액은 처리 되지 의미 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 면역 형광 염색 EC 코팅 Microcarrier 구슬에. Microcarrier 구슬 검색 되었고 스테인드 CD31에 대 한 평가 confluency (PECAM-1). 핵은 파란색 (DAPI) 스테인드 그리고 CD31 빨간색 (Cy3) 스테인드 했다. 눈금 막대: 100 μ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 다른 적의 배 응고 응고 시간 시각적으로 결정 하 고 실험의 끝 보이는 응고 관찰 하는 때 정의 되었다. 비-EC-코팅 microcarrier 구슬 했다 전체 비 anticoagulated 인간의 혈액에 노출 되 면 강한 procoagulant 효과 관찰 되었다. PAEC (GalTKO)에 여자-α-1, 3-여자 xenoantigen의 부재는 응고 시간 (25 ± PAEC WT에 대 일 분)와 68 ± PAEC GalTKO에 대 일 분에 증가 보여주었다. 응고 시간에 더 증가 때 PAEC GalTKO/hCD46/hTBM 참석 했다 microcarrier 구슬에는 보수 (hCD46) 및 응고 시스템 (hTBM)의 성공적인 변조 제안 관찰 되었다. 데이터는 평균 ± 표준 편차로 표시 됩니다. 통계 분석 수행 되었습니다 ANOVA를 사용 하 여 여러 비교 Bonferroni 보정에 대 한. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기에 제시 된 모델은 응고에 대 한 적합 한 응고 및 적와의 상호 작용의 다양 한 측면의 분석을 허용 하는 연구 관련 8 xenotransplantation 연구에서는 인간의 피 9부 화 후 다른 유전자 변형된 돼지 ECs의 항 응 혈 약 속성을 테스트 하는 유용한 시스템입니다.
프로토콜의 가장 중요 한 단계는 실험을 시작 하기 전에 microbeads의 전체 셀 범위 (confluency)을 보장 및 주의 컬렉션에 관련 된 고을 피하기 위해 조 비 anticoagulated 전체 혈액의 처리 vacutainers 혈액을 수집 하는 데 사용 되는 경우 발생할 수 있는 높은 전단 응력으로 인해 혈소판 활성화. 10 그럼에도 불구 하 고,이 시스템 반복 닫힌된 시스템의 부재를 포함 하 여 몇 가지 제한 사항이 있으며 더 나은 것을 생리 적인 전단 응력의 부재 대표 비보에 조건.
이러한 제한에도 불구 하 고 현재 비해 설명된 모델 제공 상당한 이점을 기존 모델. Microcarrier 구슬의 사용, EC 표면 혈액 볼륨 비율 증가, 항 응고 제와 항 염증 성 환경 설립 및 비 anticoagulated 전체 혈액의 사용을 허용. 현재 평면 침대 셀 문화 모델, 이것은 불가능 하 고 종종 동물 실험 사용 해야 따라서 혈액 응고 때문에 EC 활성화를 포함 하는 메커니즘. 부분에서이 설명된 microcarrier 구슬 모델을 사용 하 여 피할 수 있습니다.
또한,이 시스템은 광범위 한 응용 프로그램에 대 한 수 있습니다. 다재 다능 한 테스트 다른 약 또는 화합물 인 (이종-) 관련된 이식 뿐만 아니라 또한에 인간의 질병의 가능성에 있는. 응고 시스템 및 endothelium에 약물의 효과 면역 형광 검사, ELISA와 다중 정지 배열 분석에 의해 쉽게 평가 될 수 있습니다. 이것은 이전 인간의 thrombomodulin xenotransplantation 속에서의 유전자 변형 식의 효과에 관한 연구에서 이루어졌다. 11
설명된 방법의 가능한 수정 가득 이전 셀 코팅 구슬에 피 펫을 사용 하 여 공기 접촉과 혈액 활성화를 줄이기 위해 튜브에 직접 비 anticoagulated 전체 혈액의 수집 될 수 있습니다. 인간의 대동맥 내 피 세포 (항구적)를 사용 하 여 재미 있는 제어 있을 수 있습니다 하 고 이미 미래의 계획에 통합 됩니다. 튜브의 아르곤 토 핑 비 anticoagulated 혈액 응고 폭포의 활성화 문의 이어질 알려져 있다 공기와 접촉을 줄이기 위해 사용할 수 있습니다. 피를 너무 빨리 그려진 경우 예 고무 stopcocks와 청소기 튜브를 사용 하 여 좋은 제트에 튜브에 혈액을 도입 후 혈소판 활성화 되 고 응고가 빨리 발생 합니다. 혈소판 활성화를 방지 하려면 큰 직경 피하 주사 바늘 (21ɢ-16ɢ)를 사용 합니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 연구는 스위스 국립 과학 재단 (SNSF, 보조금 번호 320030_156193)에 의해 지원 되었다. 저자 박사 Benoît Werlen Biosilon microcarrier 비즈 제공 감사 합니다. 우리는 또한 감사 교수 한스 피터 Kohler와 교수 안 드레 Haeberli microcarrier 구슬 모델을 설정 하는 방법에 대 한.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit - FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2 mL in 500 mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
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