Summary
We presenteren een in vitro model waarmee de studie en analyse van coagulatie in hele, niet-vertonen bloed. Antistolling in het systeem is afhankelijk van de natuurlijke anticoagulation effect van gezonde endotheliale cellen en endothelial cel activatie zal resulteren in de bloedstolling.
Abstract
In vivo, endotheliale cellen zijn cruciaal voor de natuurlijke antistolling van circulerende bloed. Bijgevolg leidt endothelial cel activatie tot bloedstolling. Dit verschijnsel is waargenomen in veel klinische situaties, zoals orgaantransplantatie in aanwezigheid van pre-gevormde antistoffen anti-donor, met inbegrip van xenotransplantatie, evenals in ischemie/reperfusie letsel. Teneinde dierproeven volgens 3R normen (vermindering, vervanging en verfijning), in vitro model voor het bestuderen van het effect van endothelial cel zou activering op de bloedstolling zeer wenselijk zijn. Gemeenschappelijke flatbed systemen van endothelial celcultuur bieden echter een oppervlak-te-volume verhouding van 1-5 cm,2 van endotheel per mL bloed, dat niet voldoende voor natuurlijke, endotheel-gemedieerde antistolling is. Kweken van endotheliale cellen op microcarrier kralen kan verhogen de oppervlak-te-volume verhouding tot 40-160 cm2/mL. Deze verhoogde ratio is voldoende om ervoor te zorgen de "natuurlijke" antistolling volbloed, zodat het gebruik van anticoagulantia kan worden vermeden. Hier is een in vitro microcarrier gebaseerde systeem beschreven te bestuderen van de gevolgen van genetische modificatie van varkens endotheliale cellen voor stolling van hele, niet-vertonen menselijk bloed. In de beschreven assay, primaire varkens aorta endotheliale cellen, ofwel wild-type (WT) of transgene voor menselijke CD46 en thrombomodulin, werden geteeld op microcarrier kralen en vervolgens blootgesteld aan vers getrokken niet-vertonen menselijk bloed. Dit model zorgt voor de meting en kwantificering van cytokine release evenals activering markers van aanvulling en coagulatie in het bloedplasma. Daarnaast werden beeldvorming van geactiveerde endothelial cel en de afzetting van immunoglobulinen, aanvulling- en stolling eiwitten op de endothelialized parels uitgevoerd door confocale microscopie. Deze test kan ook worden gebruikt voor het testen van geneesmiddelen die worden verondersteld om te voorkomen dat endothelial cel activatie en dus coagulatie. Op de top van zijn potentieel om het aantal proefdieren voor dergelijke onderzoeken, is de beschreven test gemakkelijk uit te voeren en consequent reproduceerbaar.
Introduction
De vasculaire endotheel bestaat uit een monolayer van endotheliale cellen (EG) die lijn de lumen van bloedvaten. In een fysiologische toestand, rustige EG zijn verantwoordelijk voor het onderhoud van een antistollingsmiddel en anti-inflammatoire milieu. 1 dit is bemiddeld door de uitdrukking van antistollingsmiddel en anti-inflammatoire eiwitten op het oppervlak van de EG. Bijvoorbeeld, EG activering veroorzaakt door ischemie/reperfusie letsel of vasculaire afwijzing van (xeno-) getransplanteerde organen resultaten in een verandering van het endotheel oppervlak van een antistollingsmiddel en anti-inflammatoire staat naar een Pro-coagulant en pro-inflammatoire staat. 1
Om te bestuderen van de boeiende en complexe interactie tussen het endotheel en bloedstolling factoren, in vitro modellen die als nabootsen dicht mogelijk zijn de situatie in vivo zeer wenselijk. Een gemeenschappelijke beperking die conventionele in vitro coagulatie assays kenmerkt is het gebruik van vertonen bloed waardoor de analyse van stolling-gemedieerde effecten moeizame en zelfs recalcification citrated volbloed niet reproduceren resultaten kunnen worden verkregen met niet-vertonen van vers bloed. 2 bovendien, in traditionele flat-bed cel cultuur systemen is het onmogelijk om te exploiteren de anticoagulatie-eigenschappen van het endotheel als een voldoende endothelial celoppervlak per bloed volume kan niet worden bereikt. De hier gepresenteerde model overwint deze beperkingen door het kweken van de EG op het oppervlak van de sferische microcarrier kralen, zodat een EG oppervlak-te-bloed ratio van > 16 cm2/mL kan worden bereikt, die is vergelijkbaar met de situatie in kleine arteriolen of aderen, en die werd beschreven als toereikend zijn voor "natuurlijke" antistolling van het bloed door het oppervlak van de EG. 3 , 4 volbloed kan worden gebruikt zonder toegevoegde anticoagulantia in deze instelling. Bloedmonsters kunnen worden genomen tijdens het experiment en cytokines, stollingsfactoren en oplosbare aanvulling activering markeringen kunnen worden gedetecteerd en kan worden gekwantificeerd. EG-gecoate microcarrier kralen, kunnen bovendien door confocale microscopie voor aanvulling en immunoglobuline depositie, alsmede de uitdrukking van de EG-markeringen voor activering te worden geanalyseerd. Een andere interessante toepassing omvat het testen van geneesmiddelen die worden verondersteld om te voorkomen dat endothelial cel activatie en dus coagulatie. 5 dit model niet volledig het vervangen van dierproeven, maar biedt een methode om te testen specifieke functionele hypothesen ex vivo cuvetten en dus vermindering van het aantal proefdieren bij het basisonderzoek op ischemie/reperfusie letsel of (xeno) transplantatie.
Het beschreven model werd gebruikt om na te bootsen van een xenotransplantatie bepalen in welke varkens aorta endotheliale cellen (PAEC) worden geteeld op de kralen microcarrier en geïncubeerd met hele, niet-vertonen menselijk bloed. Verschillende transgene PAEC, uitvoering van verschillende menselijke genen zoals CD46 voor de regulering van het complementsysteem en/of thrombomodulin (hTBM) voor de regulering van de stolling systeem, werden geanalyseerd voor hun anticoagulatie-eigenschappen. Endothelial cel activatie, aanvulling en stolling systemen zijn strak gecontroleerde en met elkaar verbonden. 6 daarom is het belangrijk om te begrijpen hoe de verschillende transgene cellen gedragen na blootstelling aan menselijk bloed met betrekking tot de adhesie molecuul expressie en cytokine release, vergieten van de glycocalyx en verlies van anticoagulatie eiwitten. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Duits landras varkens (wild type gekweekt in een lokale boerderij en transgene gefokt bij het Instituut van de fokkerij van de moleculaire en biotechnologie, Ludwig-Maximilians-Universiteit, München, Duitsland), met een gewicht van 30 kg tot 40 kg, werden gebruikt Deze studie. Alle dieren waren gehuisvest onder standaardomstandigheden met water en voedsel ad lib. Alle dierproeven werden uitgevoerd volgens de U.K. dieren Act (wetenschappelijke procedures) en de NIH-gids voor de zorg en gebruik van proefdieren, evenals het recht van de Zwitserse dierenbescherming. Alle dierproeven is naleving van de richtsnoeren voor het aankomen. Het Comité van de dierproeven van de kantonnale veterinaire dienst (kanton van Bern, Zwitserland) procedures afgekeurd op alle dierlijke, toestemming niet. BE70/14. Experimentele protocollen werden verfijnd volgens de principes van 3R en state-of-the-art anesthesie en pijnbehandeling werden gebruikt om te minimaliseren van het aantal dieren en het verminderen van de blootstelling van de dieren aan stress en pijn tijdens de experimenten.
bloed werd getrokken uit gezonde individuen door gesloten systeem Venapunctie volgens Zwitserse richtsnoeren op het gebied van jurisdictie en ethiek van het universitair ziekenhuis van Bern. De uitdrukking " niet-vertonen bloed " betekent dat het bloed niet behandeld is met een antistollingsmiddel.
de volgende stappen worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden. Vertrouwdheid met fundamentele cel cultuur steriele techniek vereist is.
1. isolatie van PAEC
Opmerking: thoracale aorta segmenten van 6 tot 10 cm werden verkregen van euthanized Duits landras varkens van 3 tot en met 6 maanden van leeftijd (gebruikt voor andere experimenten in vivo) en onmiddellijk omgezet in een fles van 500 mL met transportmedium (DMEM + 1% penicilline/streptomycine).
- Vooraf jas een 6-well plaat met fibronectine 12,5 µg Mo/mL in PBS 1 x en breng dit in een incubator bij 37 ° C voor 1 h.
- Vooraf warm steriel PBS 1 x en cel cultuur medium (DMEM).
- Nemen de varkens aorta uit transportmedium.
- Plaats van de aorta op een polystyreen plaat.
- Spoelen met warme PBS zachtjes vooraf.
- De aorta Overlangs snijden en op te lossen met naalden.
- Warme cel kweekmedium toevoegen op het oppervlak van de innerlijke schip.
- Gecombineerd fibronectine-cel kweekmedium en toevoegen van verse cel kweekmedium (DMEM aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix).
- Geniet een wattenstaafje in het kweekmedium cel. De kiem van katoen, wol op de top van het innerlijke vaartuig oppervlak wisser voorzichtig en langzaam in dezelfde richting.
- De cellen in een put van 6-well-plate ronde door ronde wrijf.
- Hetzelfde doen voor de rest van de putten.
- Controleer cellen onder de Microscoop en plaats van de 6-well-plaat in de incubator bij 37 ° C, 5% CO 2.
- Het medium wijzigen op de tweede dag en het weer elke 2-3 dagen.
- Cellen zijn gonna be confluente, trypsinize cellen als ze zaad in een maatkolf van T75 (PAEC P1).
2. Karakterisering van het PAEC
- vooraf jas een chamberslide 8-well met fibronectine 12,5 µg Mo/mL in PBS 1 x en breng dit in een incubator bij 37 ° C voor 1 h.
- 5 x 10 4 cellen/goed zaad en na een nacht bebroeden in de incubator bij 37 ° C.
- Wassen van de cellen tweemaal met PBS ++ (PBS aangevuld met CaCl 2 en MgCl 2), 300 μl per putje.
- Herstellen van cellen met 3,7% paraformaldehyde gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur, 200 μl per putje.
- Wassen van cellen 3 keer met PBS ++, 300 μl per putje.
- Toevoegen van 300 μL van PBS 1 x-3_% BSA (buffer met blokkerend) en laat 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Toepassen van primaire antilichamen (anti-VE-cadherine, anti-CD31, anti-vWF) verdund in PBS 1x-1%BSA-0.05% wasmiddel, 160 μl per putje en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- 3 keer wassen met PBS ++ (200 μl per putje).
- Secundaire antilichamen en DAPI verdund in PBS 1x-1%BSA-0.05% wasmiddel, 160 μl per putje, toepassen en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- 3 keer wassen met PBS ++ (200 μl per putje).
- Monteren van dia's met glycerol gebaseerde montage medium en controleer of endothelial cel markeringen expressie onder een fluorescentie Microscoop.
Opmerking: Cultuur varkens aorta endotheliale cellen in een T175 kolf (DMEM lage glucose medium + 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine en 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix) tot 90% samenvloeiing is bereikt. (dichtheid 1 x 10 6 cellen zaaien, samenvloeiing van 90% overeen met ongeveer 5 x 10 6 cellen).
3. Coating van Microcarrier kralen
- Meng 7 mL microcarrier kralen met 42 mL van collageen oplossing in een tube van 50 mL (100 μg/mL verdund in een azijnzuur-oplossing van 0,2%) en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- Wassen kralen twee keer met 25 mL PBS pH 7.4 (Voeg 25 mL PBS, goed mengen met de pipet en wacht totdat de kralen zijn neergestreken vervolgens negeren de bovendrijvende substantie en herhaal) en één keer met 25 mL van DMEM medium.
- Dekken de kralen in de 50 mL tube met 10mL medium 199 aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1% L-Glutamine, 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix en 25 μL van heparine (5000 IU/mL) en laat de equilibratietijd voor 10 min voor verder gebruik.
4. Het verzamelen van cellen
- het kweekmedium cel verwijderen uit de kolf van de T175 met PAEC en voeg 5 mL PBS pH 7.4.
- Verwijderen PBS van de kolf T175.
- Voeg 5 mL van de Trypsin-0.05% EDTA en incubeer gedurende 3-4 minuten bij 37 ° C.
- De cellen verzamelen door het spoelen van de kolf met 15 mL cel kweekmedium en spoel de suspensie in een tube van 50 mL.
- Centrifugeren cellen op 1.200 x g gedurende 8 minuten bij kamertemperatuur, verwijderen van overtollige medium en resuspendeer de pellet in 5 mL cel kweekmedium.
5. Zaaien van de cellen in de maatkolf van de roerder
- Voeg toe 20 mL cel kweekmedium aan de celsuspensie en resuspendeer.
- Toevoegen van 20 mL cel kweekmedium (w/o cellen) in de maatkolf van 500 mL magneetroerder.
- De cellen toevoegen aan de gewassen microcarrier kralen uit stap 3.3 en meng zorgvuldig met serologische Pipetteer 25 mL.
- Het mengsel kralen/cel Pipetteer in de kolf magnetische spinner.
- De 50 mL tube met 10 mL van cel voedingsbodem voor het verzamelen van de resterende cellen spoelen.
- Toevoegen van een extra 85 mL van cel voedingsbodem in de maatkolf van spinner en leg deze in de incubator's nachts bij 37 ° C op een shaker (100 x g, mengen interval: 3 min elke 45 min).
- Voeg 50 mL cel kweekmedium (total volume 200 mL) en blijven roeren voor extra 24 uur bij 37 ° C op een shaker (100 x g, mengen interval: 3 min elke 45 min).
- Toevoegen kleurloze RPMI medium (aangevuld met 10% FBS, 1% penicilline/streptomycine, 1% L-Glutamine, 0,4% van Endothelial cel groei Medium Supplement Mix en 25 μL van heparine) tot 320 mL totale volume is bereikt.
- Vervangen het medium elke oud medium 48 h: verwijderen 100 mL en voeg 100 mL vers aangevuld kleurloze RPMI.
- Cultuur de cellen gedurende 5 tot 7 dagen. De tijd hangt af van de staat van de samenvloeiing van de cel beklede parels.
- 200 μL van cel beklede kralen met behulp van een precisiepipet verzamelen en ze vervolgens overbrengen naar een polypropyleen buis.
- Wassen van de parels 3 keer met 600 μL van PBS 1 x (toevoegen van PBS, kantelen de buis en meng voorzichtig om te voorkomen, detachement van de cellen de kralen wachten om te settelen, negeren van de PBS en herhaal).
- Bevestigen de kralen gedurende 10 minuten door toevoeging van 200 μL van parapicric zuur.
- Wassen 3 keer met 600 μL van PBS 1 x.
- Toevoegen DAPI verdund in PBS 1 x en incubeer gedurende 10 min.
- Overbrengen van de kralen op een glasplaatje en breng een dekglaasje aan met behulp van op basis van glycerol montage middellange.
- Visualiseren de kralen onder een confocal microscoop.
7. Experimentele Procedure
- verwijderen van de cel beklede parels uit de kolf van de magneetroerder (procedures hoeft niet te worden uitgevoerd onder steriele omstandigheden) serologische Pipetteer 10 mL en ze vervolgens overbrengen naar polypropyleen tubes van 12 mL ronde onderkant.
- Laat de parels gaan zitten (ongeveer 1-2 min) en verwijderen van de overtollige middellange.
- Toevoegen van meer kralen aan de buizen totdat elke buis precies 2 mL gesteld kralen bevat.
- Voeg 5 mL duidelijk RPMI aan elke buis toe en meng zorgvuldig gebruik te maken een serologisch pipet 10 mL.
- Laat de kralen settelen en het verwijderen van overtollige middellange.
- Herhaalt u de procedure wassen één meer tijd met RPMI en verwijder alle overtollige middellange.
8. Incubatie met Non-vertonen bloed
- zorgvuldig en langzaam (met behulp van jet noch vacutainers) bloed trekken vrijwilliger gezonde en verzamel het in 9 mL neutrale polypropyleen buizen (geen antistollingsmiddel).
- Breng langzaam 8 mL bloed met een serologische pipet 10 mL in elk van de polypropyleen tubes met 2 mL cel beklede kralen (het totale volume zullen 10 mL). Vermijd altijd ruwe behandeling van bloed of kralen ter voorkoming van vroegtijdige EG activering. De procedure duurt 1-2 min.
- Zorgvuldig het mengsel van de bloed/kraal om te zorgen voor gelijke mengen en verzegel het GLB met paraffine film kantelen.
- Plaats de buizen op een horizontale kantelbare tafel (met zachte kantelbare instellingen alleen) binnen een 37 ° C incubator en record stolling tijden.
- Op vaste tijdstippen, bijvoorbeeld na 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, verwijderen van ten minste 1,5-2 mL bloed-kraal mix serum of plasma p.a..
Opmerking: voor 6 tijdstippen raden we hebben meer dan 3 wordt gerepliceerd binnen een groep van cellen, zoals de bloedmonsters in verschillende buisjes gebeuren zal. - Voor de verzameling van het serum, laat het bloed stollen. Het verzamelen van het plasma, EDTA of toevoegen citraat 2 mL buizen voor het toevoegen van bloedmonsters.
- Slaan de buizen op ijs, centrifugeer bij 2.500 x g gedurende 10 minuten bij 4 ° C en bewaren van serum/plasma bij 80 ° C tot gebruik.
Opmerking: Informatie over materialen vindt u in de Tabel van materialen
- Op vaste tijdstippen, bijvoorbeeld na 10, 20, 30, 50, 70, 90 min, verwijderen van ten minste 1,5-2 mL bloed-kraal mix serum of plasma p.a..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Na 7-10 dagen van cultuur in de spinner kolf (Figuur 1) waren de cellen confluente, die betrekking hebben op het gehele oppervlak van de microcarrier parels (Figuur 2). Verificatie van de confluency staat is een belangrijke stap, omdat een niet-heuvels enkelgelaagde van de EG op de microbeads zal leiden tot een duidelijke afname in de bloedstolling tijd, gezien de microcarrier parels oppervlak is sterk Pro-coagulant (bloedstolling tijd: 4 ± 1 min) ( Figuur 3).
Een ander belangrijk punt dat aandacht nodig heeft is de snelheid van de kantelbare plaat. Een hoge kantelbare snelheid zal verbeteren bloedstolling. Een verlenging van de bloedstolling tijd kon worden waargenomen als een monolayer van EG was aanwezig op het oppervlak van de microcarrier-kralen. Het gebruik van transgene PAEC GalTKO/hCD46/hTBM liet een aanzienlijke stijging in de bloedstolling tijd in vergelijking met WT PAEC (Figuur 3). Het ontbreken van de Gal-α-1,3-Gal-xenoantigen op de PAEC (GalTKO) sprake van een toename in de bloedstolling op tijd (25 ± 8 min voor PAEC WT) en 68 ± 30 min. voor PAEC GalTKO. Een andere sterke stijging in de stolling van de tijd werd waargenomen wanneer PAEC GalTKO/hCD46/hTBM waren aanwezig op microcarrier kralen (205 ± 32 min), die suggereert een succesvolle modulatie van zowel de aanvulling (hCD46) en de coagulatie systemen (hTBM). Het einde van het experiment wordt gedefinieerd als een zichtbare clot is gevormd. De variabiliteit binnen monsters van hetzelfde van groep is verschuldigd zowel inter assay-veranderlijkheid en de donor bloed. Elk experiment had 3 wordt gerepliceerd en elke keer een andere bloed donor werd gebruikt om het verhogen van de betrouwbaarheid van de gegevens. Voor elke donor, werd een bloed-analyse (bloedplaatjes, WBC RBC, HCT en andere parameters) uitgevoerd door externe gezondheidszorg laboratoria. De resultaten afgebeeld in Figuur 3 worden verkregen van verschillende experimenten uitgevoerd met verschillende bloeddonoren.
Figuur 1: schematische weergave van de Microcarrier gebaseerde Assay. (A) EG zijn uitgebreid in T175 kolven en (B) overgebracht naar spinner kolven samen met collageen beklede microcarrier kralen. (C) niet-vertonen van vers bloed wordt verzameld uit gezonde vrijwilliger, (D) gemengd met EG-gecoate microcarrier kralen, en bij 37 ° c geïncubeerd. De uitdrukking "niet-vertonen blood" betekent dat het bloed niet behandeld is met een antistollingsmiddel. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: immunofluorescentie kleuring op EG-gecoate Microcarrier kralen. Microcarrier kralen werden opgehaald en gekleurd voor CD31 (PECAM-1) te beoordelen van de confluentie. De kernen werden gekleurd in blauw (DAPI) en CD31 werd gekleurd in rood (Cy3). Schaal bar: 100 μm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: bloedstolling tijden van de verschillende EG Bloedstolling tijden werden bepaald visueel en het einde van het experiment werd gedefinieerd als een zichtbare clot werd waargenomen. Een sterke procoagulatie effect werd waargenomen als niet-EG-coated microcarrier kralen werden blootgesteld aan hele niet-vertonen menselijk bloed. Het ontbreken van de Gal-α-1,3-Gal-xenoantigen op de PAEC (GalTKO) sprake van een toename in de bloedstolling op tijd (25 ± 8 min voor PAEC WT) en 68 ± 30 min. voor PAEC GalTKO. Een verdere stijging van de stolling van de tijd werd waargenomen toen PAEC GalTKO/hCD46/hTBM waren aanwezig op microcarrier kralen, die suggereert een succesvolle modulatie van zowel de aanvulling (hCD46) en de coagulatie systemen (hTBM). Gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± standaardafwijking. Statistische analyse is gedaan met behulp van ANOVA voor meerdere vergelijkingen met Bonferroni correctie. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier gepresenteerde model is geschikt voor coagulatie gerelateerde studies zodat de analyse van de verschillende aspecten van coagulatie en de wisselwerking daarvan met EG. 8 in xenotransplantatie onderzoek is het een nuttig systeem om te testen de anticoagulatie eigenschappen van verschillende genetisch gemanipuleerde varkens ECs na incubatie met menselijk bloed 9.
De belangrijkste stappen van het protocol zijn die zorgen voor volledige cel dekking (confluentie) van de microbeads voordat het experiment en die met betrekking tot de zorgvuldige collectie en de behandeling van de niet-vertonen-volbloed te voorbarig de activering van de bloedplaatjes te wijten aan hoge shear stress, die zich voordoen kunnen als vacutainers worden gebruikt voor het verzamelen van het bloed. 10 niettemin, dit systeem kent een aantal beperkingen, met inbegrip van het ontbreken van een recirculatie gesloten systeem en het ontbreken van fysiologische schuifspanning die zou beter vertegenwoordigen de voorwaarden in vivo .
Ondanks deze beperkingen het beschreven model biedt belangrijke voordelen ten opzichte van momenteel bestaande modellen. Als gevolg van het gebruik van microcarrier kralen, wordt het oppervlak van de EG om bloed volumeverhouding verhoogd, waardoor de instelling van de anti-coagulans en anti-inflammatoire milieu en gebruik van niet-vertonen volbloed. In de actuele modellen van de cultuur van de cel van de flat-bed, dit is niet mogelijk en mechanismen waarbij bloedstolling als gevolg van EG activering vereisen daarom vaak het gebruik van dierproeven. Dit kan gedeeltelijk vermeden worden met behulp van het beschreven microcarrier bead model.
Bovendien, dit systeem zorgt voor een breed spectrum van toepassingen. Zijn veelzijdigheid bevindt zich in de mogelijkheid van het testen van verschillende drugs of verbindingen die niet alleen verband houden met (xeno-) transplantatie, maar ook om menselijke ziekten. De gevolgen van de drugs op het endotheel en op de stolling-systeem kunnen gemakkelijk worden beoordeeld door immunofluorescentie, ELISA en multiplex schorsing matrix analyse. Dit was eerder gedaan in een studie over het effect van transgene expressie van menselijke thrombomodulin in een omgeving van xenotransplantatie. 11
Een eventuele wijziging van de beschreven methode zou zijn de verzameling van niet-vertonen volbloed rechtstreeks in buizen die eerder zijn gevuld met cel beklede kralen teneinde het lucht-contact en bloed activeren met behulp van de pipet. Het gebruik van menselijke aorta endotheliale cellen (HAEC) kan een interessant besturingselement en is al opgenomen in de plannen voor de toekomst. Argon topping van de buizen kan worden gebruikt om het contact van niet-vertonen bloed met lucht, die leiden tot contact van de activering van de bloedstolling cascade is bekend. Als het bloed te snel wordt getekend, bijvoorbeeld met behulp van Stofzuig buizen met rubber kranen en invoering van bloed in de buis in een fijne straal, vervolgens bloedplaatjes worden geactiveerd en stolling zal optreden eerder vroeger. Gebruiken om te voorkomen dat bloedplaatjes activering, grote diameter injectienaalden (21ɢ - 16ɢ).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie werd ondersteund door de Zwitserse National Science Foundation (SNSF, Grant No. 320030_156193). De auteurs bedanken Dr. Benoît Werlen voor het verstrekken van het Biosilon microcarrier kralen. Wij danken ook Prof. Hans Peter Kohler en Prof. André Haeberli voor hulp bij het opzetten van de microcarrier-bead model.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PAEC | Isolated from pig aorta in our Lab | ||
| Microcarrier beads (Biosilon) | Thermo Fisher Scientific | 160-250 | |
| Collagen I, Bovine | Gibco | A10644-01 | |
| DMEM | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Sigma | M7528 | |
| RPMI | Gibco | 32404-014 | |
| Neutral tubes | Sarstedt | 02.1726.001 | |
| Polypropylene tubes | Simport | T406-2A | |
| Stirrer flasks | Tecnomara | ||
| Biological stirrer | Brouwer | MCS-104S | |
| Rat anti CD31 | R&D Systems | MAB33871 | Dilution 1:100 |
| Goat anti-rat IgG-Cy3 | Jackson Immuno Research | 112-166-003 | Dilution 1:500 |
| Goat anti VE-cadherin | Santa Cruz | sc-6458 | Dilution 1:100 |
| Rabbit anti vWF | DAKO | A0082 | Dilution 1:100 |
| Dk anti Gt IgG – Alexa 488 | Molecular Probes | A11055 | Dilution 1:500 |
| Goat anti Rabbit - FITC | Southern Biotech | 4050-02 | Dilution 1:500 |
| DAPI | Sigma | 32670-25MG-F | Dilution 1 µg/mL |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| FBS | Gibco | 10270-106 | Concentration: 10% in cell culture medium |
| Adapter | Sarstedt | 14.1205 | |
| Confocal microscope | Carl Zeiss | LSM 710 | |
| Image analysis software | Image J | Available for free at: https://imagej.net | |
| Endothelial Cell Growth Medium SupplementMix | PromoCell | C-39216 | 2 mL in 500 mL of DMEM |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| L-Glutamine | Gibco | 25030-024 | Concentration: 1% in cell culture medium |
| Heparinun natricum | Drossa Pharm AG | Stock concentration: 5000 U.I./ mL | |
| Chamberslides | Bioswisstec AG | 30108 | |
| CaCl2 x 2H2O | Merck | 2382.0500 | |
| MgCl2 x6 H2O | Merck | 1.5833.1000 | |
| Tween 20 | Axon Lab AG | 9005-64-5 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7030 | |
| Glycergel mounting medium | Dako | C0563 |
References
- Rajendran, P., et al. The vascular endothelium and human diseases. Int. J. Biol. Sci. 9, 1057-1069 (2013).
- Rajwal, S., Richards, M., O'Meara, M. The use of recalcified citrated whole blood - a pragmatic approach for thromboelastography in children. Pediatric Anesthesia. 14, 656-660 (2004).
- Kohler, H. P., Muller, M., Mombeli, M., Mtraub, M. M., Maeberli, M. The Suppression of the Coagulation of Nonanticoagulated Whole-Blood in-Vitro by Human Umbilical Endothelial-Cells Cultivated on Microcarriers Is Not Dependent on Protein-C Activation. Thromb. Haemost. 73, 719-724 (1995).
- Biedermann, B., Rosenmund, A., Muller, M., Kohler, H. P., Haeberli, A., Straub, P. W. Human endothelial cells suppress prothrombin activation in nonanticoagulated whole blood in vitro. J. Lab. Clin. Med. 124, 339-347 (1994).
- Banz, Y., Cung, T., Korchagina, E. Y., Bovin, N. V., Haeberli, A., Rieben, R. Endothelial cell protection and complement inhibition in xenotransplantation: a novel in vitro model using whole blood. Xenotransplantation. 12, 434-443 (2005).
- Cowan, P. J., d'Apice, A. J. Complement activation and coagulation in xenotransplantation. Immunology and Cell Biology. 87, 203-208 (2009).
- Reitsma, S., Slaaf, D. W., Vink, H., van Zandvoort, M. A. M. J., oude Egbrink, M. G. A. The endothelial glycocalyx: composition, functions, and visualization. Pflugers Arch. 454, 345-359 (2007).
- Wiegner, R., Chakraborty, S., Huber-Lang, M. Complement-coagulation crosstalk on cellular and artificial surfaces. Immunobiology. 221, 1073-1079 (2016).
- Bongoni, A. K., et al. Transgenic Expression of Human CD46 on Porcine Endothelium: Effect on Coagulation and Fibrinolytic Cascades During Ex Vivo Human-to-Pig Limb Xenoperfusions. Transplantation. 99, 2061-2069 (2015).
- Miyazaki, Y., et al. High shear stress can initiate both platelet aggregation and shedding of procoagulant containing microparticles. Blood. 88, 3456-3464 (1996).
- Wuensch, A., et al. Regulatory Sequences of the Porcine THBD Gene Facilitate Endothelial-Specific Expression of Bioactive Human Thrombomodulin in Single-and Multitransgenic Pigs. Transplantation. 97, 138-147 (2014).
