Summary
Det här protokollet beskriver karakterisering av DNA-polymeras syntes av modifierad DNA genom observation av infrarött fluorescently märkt DNA med hjälp av gelelektrofores och gel imaging-förändringar. Akrylamid geler används för högupplöst avbildning av avskiljandet av kort nucleic syror, som vandrar i olika takt beroende på storlek.
Abstract
För varje enzym krävs robusta, kvantitativa metoder för karakterisering av både infödda och konstruerade enzymer. För DNA-polymerases, kan DNA-syntesen karakteriseras med hjälp av ett in vitro- DNA syntesen test följt av polyakrylamid gelelektrofores. Målet med denna analys är att kvantifiera syntes av både naturliga DNA och modifierad DNA (M-DNA). Dessa metoder är särskilt användbara för att lösa oligonukleotider med enda nukleotid upplösning, möjliggör observation av enskilda stegen under enzymatisk oligonukleotiden syntes. Dessa metoder har tillämpats till utvärderingen av en rad biokemiska och biofysiska egenskaper såsom mätning av steady state konstanter av enskilda stegen av DNA-syntes, felprocenten av DNA-syntes och DNA affinitet. Genom att använda modifieras komponenter inklusive, men inte begränsat till, modifierade nukleosid trifosfater (NTP), M-DNA och/eller muterade DNA polymeraser, relativa nyttan av substrat-DNA-polymeras som par kan utvärderas effektivt. Här, detalj vi analysen själv, inklusive de ändringar som måste göras för att tillgodose icke traditionella primer DNA märkning strategier såsom infrarött fluorescently märkt DNA. Dessutom vi har detaljerade avgörande tekniska steg för akrylamid gel hälla och kör, som ofta kan vara tekniskt utmanande.
Introduction
DNA-polymerases utför noggranna och effektiva DNA-syntes och är avgörande för att bibehålla genomet integritet. Förmågan att syntetisera hundratals nukleotider per sekund utan att göra fel gör också DNA-polymerases viktiga verktyg inom molekylärbiologi och bioteknik. Dock begränsa dessa egenskaper också vilka program för M-DNA substrat; generellt sett inte kan naturliga DNA-polymerases syntetisera många potentiellt värdefulla M-DNA substrat, sannolikt på grund att den höga selektionstryck mot att använda icke-standardiserade substrat i vivo. Många grupper har utvecklat riktad evolution metoder för att generera muterat DNA-polymerases kan M-DNA syntesen1a,2,3,4,5. dessa ansträngningar har utökat det biotekniska verktyget av DNA6,7,8.
Att utvärdera muterat DNA-polymerases förmåga att syntetisera M-DNA, vi9,10, och andra11,12,13 använder vanligtvis in vitro- mätningar av DNA polymeras aktivitet, som beskrivs i detta manuskript. I dessa experiment är DNA-polymerases samtidig ruvade med en märkt primer/mall duplex och nukleosid trifosfat substrat; produkterna utvärderas med gelelektrofores. Beroende på den specifika experimentella fråga, muterat DNA-polymerases, modifierade primers, kan modifierade mallar eller modifierade nukleosid trifosfater användas, möjliggör systematiska biokemiska utvärderingen av muterade enzymaktiviteten.
Historiskt har dessa analyser har förlitat sig på en 5' radioaktiva etikett att spåra DNA-syntes; vanligast, har 32P och 33P använts. typiskt, märkning uppnås med T4 polynucleotide kinase11. Dock på grund av den begränsad livslängd och relativt höga kostnaderna för radioaktiva etiketter och deras säkert bortskaffande använder vår grupp i stället en syntetisk 5' nära-infraröd fluorophore märkt DNA. Med en relativt låg kostnad nära infrarött gel imager, har vi observerat liknande detektionsgränser till tidigare studier med radioaktivt etiketter (opublicerade resultat). Vi har framgångsrikt återgav tidigare observationer9, och vi har inte observerat någon stor kvantitativ skillnad med tidigare uppmätta konstanter (opublicerade resultat).
För att analysera DNA storlek, och därmed omfattningen av DNA-syntes, litar vi på polyakrylamid gelelektrofores metoder utvecklades ursprungligen för Sanger sekvensering14 före tillkomsten av kapillärelektrofores15. Distansera av separation eller rörlighet kan användas som ett mått på molekylvikt; stort format, vertikala polyakrylamidgeler kan nå enda nukleotid upplösning, möjliggör kvantitativa observation av DNA oligonukleotider av varierande längd.
Sammantaget är dessa experiment en robust metod för polymeras karakterisering. På grund av tiden är känsliga reaktioner, förberedelse och vård nödvändigt för att uppnå reproducerbara resultat. Ytterligare, medan den akrylamid gel är ett mycket effektivt sätt att mäta DNA-syntes, liksom många andra DNA modifiera reaktioner, med enda nukleotid upplösning, kan det vara tekniskt utmanande. Protokollet här kommer förhoppningsvis att användare ska kunna utföra dessa experiment samtidigt undvika de vanligaste misstagen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. aktivitet Assay
Obs: det finns två vanliga typer av analyser som ofta körs för att karakterisera DNA-polymerases använder de metoder som beskrivs här. De skiljer sig i huruvida de kvalitativt karakterisera övergripande syntes (som omfattar många steg av DNA-syntes) eller huruvida de kvantitativt fokuserar på enskilda stegen. Vi beskriver de åtgärder som krävs för varje av dessa nedan.
Obs: Eftersom montering av material är relativt komplexa, för tiden känsliga experiment, rekommenderar vi att alla material är monterade i förväg. Recept av alla kritiska komponenter i analysen nedan. Kommersiella leverantörer för komponenter listas i Tabell för material.
- 10 x SF buffert recept (10 x SFB)
Observera: I våra analyser, vi vanligtvis använder N-terminala trunkering av DNA polymerase I Thermus aquaticus, allmänt känd som Stoffel fragment (SF) 16 , 17. Receptet här är rekommenderad bufferten för SF 3 , 13. Andra buffertar kan ersättas beroende på den specifika DNA-polymerasen.
Obs: 10 x SF buffert komponenter slutliga koncentration är 500 mM Tris pH 8.5, 65 mM MgCl 2, 0,5 mg/mL BSA, 500 mM KCl (s), och ultrarent vatten. Mätningar är för 1 mL SF buffert, vilket är tillräckligt för 100-200-analyser, beroende på skalan. Bufferten kan lagras på obestämd tid vid-20 ° C.- Kombinera 0,5 mL 1 m Tris, 65 µL av 1 M MgCl 2, 50 µL av 10 mg/mL BSA och 0.0373 g av KCl (s) i en 1,5 mL tub. Tillsätt 385 µL av ultrarent vatten för att nå en slutlig volym av 1 mL.
- 1 x lagring buffert recept (1 x SB)
Obs: slutliga koncentration på 1 x buffert komponenter är 50 mM Tris pH 7.5, 1 mM DTT, 0.6 mM EDTA och 50% glycerol. Receptet gör 20 mL 1 x SB.- Kombinera 0,012 g DTT, 100 µL 0,5 M EDTA, och fyll en 50 mL konisk tub med 40 mL 100 mM Tris (pH 7,5) att göra 2xSB. Mix av vortexa.
- Överför 10 mL av 2 x SB till en ny 50 mL koniska rör och späd med glycerol genom att tillsätta 10 mL glycerol till nya koniska.
- Quenching buffert orange (QBO) recept
Obs: När radioaktivt etiketter används, användare kommer ofta anställa bromofenolblått eller xylen cyanol som spårning färgämne för elektrofores framsteg. Dock kommer dessa färgämnen svagt fluorescerar i nära infraröda området, stör DNA signalen. Således använder vi Orange G i deras ställe för alla reaktioner som innehåller prover. Medan vi har hittat Orange G vara lämpliga för att spåra gel lastning, har vi hittat Orange G vara mindre konsekvent som ett färgämne som spårar elektrofores framsteg; Därför kör vi tom körfält som innehåller bromofenolblått som på de externa köer av gel som inte innehåller provet för att spåra framsteg som gel.- Kombinera 950 µL 95% formamid med 25 µL 0,5 M EDTA och 25 µL ultrarent vatten. Lägg till 1 skopa orange G färgämne (~ 10 mg). Mix av vortexa.
Varning: Formamid är giftiga; Använd personlig skyddsutrustning (PPE) såsom handskar, Glasögon och labbrock, och kassera som riskavfall.
- Kombinera 950 µL 95% formamid med 25 µL 0,5 M EDTA och 25 µL ultrarent vatten. Lägg till 1 skopa orange G färgämne (~ 10 mg). Mix av vortexa.
2. Assay kör
- kvalitativa karakterisering av samlade verksamhet
Obs: för denna analys, vi vanligtvis behålla konstant koncentration av M-NTP och variera tid. Målet är att utvärdera de övergripande egenskaperna hos proteinet i stället för att mäta varje enskilt steg. För att förbereda en reaktion, kommer att en lika stor volym av två separata komponenter, duplex mixen (som beskrivs i steg 2.1.1) och dNTP blandning (som beskrivs i steg 2.1.2), vara beredd separat och sedan kombineras för att ge den avslutande volymen i 49 µL. Tillägg av 1 µL 50 x enzym kommer då att inleda reaktionen. Varierande tidpunkter kan tas; vanligtvis släcka vi på 0, 5, 15 och 60 min.- Beredning av DNA duplex mix
Obs: duplex mix består av 10 x SF buffert, primer oligonukleotiden, mall oligonukleotiden och ultrarent vatten. Total volym till varje reaktion är 25 µL. 1 µL av enzymet kommer att läggas till huvudmixen föregår inledandet av experimentet.
Obs: För våra analyser använder vi vanligtvis en 45-mer mall och en 18-mer eller 23-mer primer. Medan ett antal olika längder kan användas, tenderar vi att använda denna längd eftersom produkterna (alltifrån 18 nukleotider till 45 nukleotider) löses enkelt på en enda nukleotid nivå med protokollen beskrivs gelelektrofores. När oligonukleotiden produkter ökar i längd, det kan vara svårt för att lösa produkterna på enda nukleotid upplösning.
Obs: I vårt experiment, använder vi en 5 ' nära infrarött fluorescerande färgämne etikett på primer strand att iaktta de primer produkterna. Vi köper anpassade syntetiserade oligonukleotider uthärda denna modifiering. dock kan denna etikett införlivas med valfritt antal efter syntetiska märkning strategier. Den mall oligonukleotiden är inte märkt och så är det inte observerats med gel kameran. För båda oligonukleotider, lagrar vi oligonukleotider vid 100 µM i 10 mM Tris (pH 8), 1 mM EDTA.
Obs: Eftersom vi observerar bara primern, ett tvåfaldigt överskott av mallen används för att säkerställa att alla grundfärger (de DNA arter som efterlevs) är glödgas i mallen. Slutliga duplex koncentration i denna reaktion är 40 nM.
Obs: Infrarött fluorescerande färgämnen är ofta något ljuskänsligt; När det är möjligt, täcker vi primern (och eventuella lösning innehållande primer) med folie. Detta inkluderar Polyakrylamidgelen medan det körs.
Obs: Nedan är ett representativt exempel på syntes av 2 ' F M-DNA.- Utspädd primer 1 och mall 1 (se Tabell av material för sekvens) till 1 µM varje i ultrarent vatten.
- För varje analys reaktion, i separata rör, kombinera 5 µL 10 x SF buffert, 2 µL 1 µM grundfärg 1, 4 µL av 1 µM mall 1 och 13 µL av ultrarent vatten i rören som är kompatibel med en termocykel.
- Glödga duplex i en termocykler använder följande program: 98 ° C under 2 minuter, 70 ° C i 5 min, 50 ° C i 5 min, 40 ° C i 5 min, håll vid 25 ° C. Det särskilda programmet kan variera beroende på primer/mallen duplex glödgning temperatur. Typiskt, vi föredrar att inkludera minst en 5 min steg vid glödgning temperatur, och sedan en annan 5-min vid en temperatur 5-10 grader under glödgning temperaturen.
- Beredning av 2 x dNTP blandning
Obs: beroende på experimentet, det är möjligt att använda rörliga dNTP och koncentrationer av dNTP. Vanligtvis använder vi 50-200 µM i reaktionen.- Förbered en 25 µL lösning innehållande 100 µM varje 2 ' F-NTP. Lagra de M-NTP på 100 mM.
- Beredning av 50 x protein utspädning
Obs: för långtidsförvaring, enzymer bör förvaras vid-20 ° C i 1xSB. När bort från-20 ° C frysen, bör enzymer hållas på isen hela tiden före tillägg till huvudmixen. Enzymet spädningar göras färsk från koncentrerad lager varje dag. Koncentrerade enzym beståndet ska returneras till-20 ° C frysen omedelbart efter användning.
Obs: Eftersom vi utvärdera primärt muterat DNA-polymerases, vi använder endast enzymer som har uttryckt och renas i vårt laboratorium som använder etablerade metoder 9 , 10. För kommersiellt tillgängliga polymeraser, användare bör vara försiktiga med optimal buffertar för olika proteiner och deras förenlighet med de buffertar som beskrivs häri.
Obs: Enzym koncentrationer varierar för varje experiment. Här visar vi ett representativt exempel för 2 ' F-DNA-syntes.- Att göra en 10 nM enzym lösning, späd 1 µL av enzymet into 1 x SB att göra en 50 x slutliga enzym koncentration. Koncentrationen av 50 x lösningen bör vara 500 nM. Till exempel om koncentrationen i lager enzym 50 µM, Lägg 1 µL lager enzym till 99 µL 1 x SB.
Obs: Eftersom enzymet lagras normalt i 50% glycerol, lösningen är ganska trögflytande. Även om du använder mycket noggranna pipetter, vi rekommenderar inte pipettering mindre än 0,5 µL, med tanke på vikten av noggrannhet och precision under enzym utspädning.
- Att göra en 10 nM enzym lösning, späd 1 µL av enzymet into 1 x SB att göra en 50 x slutliga enzym koncentration. Koncentrationen av 50 x lösningen bör vara 500 nM. Till exempel om koncentrationen i lager enzym 50 µM, Lägg 1 µL lager enzym till 99 µL 1 x SB.
- Inledande av assay
- satt en torr bad temperatur till 50 ° C.
- Lägg till 24 µL av glödgad duplex blanda (se steg 2.1.1) till 25 µL av 2 x dNTPs (se steg 2.1.2).
- Ta bort 9,8 µL av blandningen i steg 2.1.4.2 och tillsätt 20 µL av QBO (se punkt 1.3 för recept). Denna alikvot fungerar som en " ingen enzymet " styra och bör erhållas för varje körning.
- Tillsätt 0,8 µL av 50 x enzym (se steg 2.1.3.1) till duplex/dNTP mixen. Pipettera upp och ner med en stor volym mikropipett skall kunna blanda.
- Efter 5, 15, och 60 min, släcka reaktionen genom att ta bort 10 µL av varje reaktion lösning och lägga i en mikrocentrifug rör innehållande 20 µL QBO (beskrivs i avsnitt 1.3).
- När kylda, reaktioner kan lagras under folie på obestämd tid vid 4 ° C eller -20 ° C.
Obs: För kvantitativa karaktärisering av enskilda stegen av M-DNA-syntes, en mycket liknande analys kan köras för att kvantitativt få Michaelis-Menten parametrar. Denna analys använder alla samma material. Michaelis-Menten parametrar kan mätas för dNTP; i detta fall den mest betydande skillnaden är att i stället lägga duplex mixen till dNTP mix, det tillför duplex mixen med enzym till en serie av 2 x dNTP lösningar. Likaså kan Michaelis-Menten parametrar mätas för DNA duplex. Särskilda villkor måste vara uppfyllda för att tillfredsställa de antaganden som behövs för att använda Michaelis-Menten ekvationen. Dessa villkor och den grundläggande mekaniken i analysen, är väl förklaras i en föregående metoder artikel 11.
- Beredning av DNA duplex mix
3. Gel elektrofores
Obs: eftersom hälla gelen är gången känsliga, alla material är monterade i förväg. Recept av alla kritiska komponenter i analysen är listade nedan; leverantörer listas i Tabell för material.
- Förbereder akrylamid för 20% akrylamid gel.
Obs: Detta recept gör 1 L av akrylamid blandning; cirka 120 mL av denna lösning används per gel. Lagra denna lösning vid rumstemperatur under folie för upp till ett år.
Varning: Polyakrylamid är neurotoxiska. Det är viktigt att bära handskar och en labbrock under alla steg av gel hälla. Om polyakrylamid får på handskar, ersätta handskarna omedelbart. Om akrylamid inte är polymeriserat, placera de förorenade material i en märkt polyakrylamid skräppåse.
Obs: Färdigblandad 40% akrylamid som innehåller 38,67% akrylamid och 1,33% bis-akrylamid för en monomer cross-linker förhållandet 29: 1 användes i detta protokoll.- Väger 17 g färdigblandad TBE pulver. Väga sex separata delar av 70 g urea (totalt 420 g).
Obs: Ureaen måste läggas i portioner. Vi tycker att det är bäst att dela den i sex delar. - Ställa in en 2 L plast bägare på en uppståndelse tallrik. Lägga till en enda stor omrörning stav i bägaren. Täck bägaren med folie när man blandar för att förhindra stänk.
- Tillsätt 500 mL 40% akrylamid i bägare. Kontrollera att lösningen är omrörning.
- Lägg till tidigare vägde ut TBE. Lägga till en alikvot av urea. Låt lösningen att blanda. Urea löses upp långsamt och kan visas disigt och vita vid första tillägg. Tillsätt långsamt de återstående alikvoter av urea i smeten över nästa timme. Låt lösningen blanda tills det är helt klar och färglös.
Obs: Tillåt vanligtvis detta röra över natten. Om lösningen inte är fortfarande löst, tillsätt små delprover av vatten och väntar Ureaen att upplösa. - Tillsats av urea kommer att öka volymen nära 1 L. Lägg till vattnet att öka volymen till exakt 1 L.
- Butik i en 1 L tonade glasflaska eller täcka glasflaska med aluminiumfolie.
- Väger 17 g färdigblandad TBE pulver. Väga sex separata delar av 70 g urea (totalt 420 g).
- Hälla av akrylamid gel.
Obs: Vid hantering av exponeringsglas pläterar, var noga med att undvika kontakt mellan glasplattorna och någon hård yta. Detta är särskilt viktigt i detta ovarsam hantering kan orsaka små sprickor i glaset; dessa sprickor kan inte vara synliga tills gelen kör, som uppstår vid en högre temperatur. Vi använder cork ringar för att förhindra oönskade kontakten.- Rena plattor
- förvärva två 33 x 42 cm gel plattor, ett spårat och en unnotched platta. Lägg plattorna på separata cork ringar.
- Skölj plåtarna noggrant med tvål och vatten. Kontrollera att det finns ingen tvål streck eller gel ställen kvar.
- Anteckna vilken sida av plattan pärlor mindre vatten. Denna sida är gel vänd sida.
Obs: Om gelen körs på andra sidan av plattan, det kan göra gel överföringen utmanande.
- Torka plattor
- använder hushållspapper för att torka båda ansikten av varje platta.
- Användning grannlaga uppgift vindrutetorkare till torra återstående områden. Ägna särskild uppmärksamhet åt kanterna på plattorna där tejpen ska tillämpas.
- Skölj glasplattorna med ~ 70% etanol och torka med uppgift torkare.
- Kontrollera att det finns inga papper handduk fibrer eller vattendroppar. Dessa kan orsaka bubblor när hälla gelen.
- Lägga distanser
- förvärva 0,75 mm distanser. Kör behandskade fingrar under DI vatten och försiktigt blöt distanserna med behandskade fingrar.
- Plats distanser längs de långa kanterna på de fasade plattan. Städa upp något vatten som är fläckad på resten av plattorna. Kontrollera att distanser är i linje med glasskivan och inte hängande över kanten.
- Tätning gel
- sätta på torra handskar. Torka kanterna på glaset igen med delikat uppgift vindrutetorkare.
- Anpassa unnotched plattan topp ovanför fasade plattan, och långsamt lägre ner till tryck på plattorna mot varandra. Kontrollera igen för att se till att kanterna på alla plåtar är justerade.
- Använda gel tejp, placera bandet över alla kanter utom toppen. Kontrollera att tejpen är justerad jämnt och tätt förseglade. Tejp kan tillämpas i en rörelse, eller varje sida kan göras individuellt. Skär ändarna av bandet med en rakkniv.
- Lägga till ett extra lager tejp till botten av gelen. Ju snävare bandet, desto mindre sannolikt gelen kommer att läcka när hälla.
- Klipp sidorna av glas smörgås med vita klämmorna. Lägga till 3 clips på varje sida och 4 klipp längst.
- Hälla gelen
- göra 3 mL 10% ammonium persulfatoxidation lösning (APS) genom upplösning 0,3 g ammonium persulfatoxidation och späda upp till 3 mL i ultrarent vatten.
Obs: 1,2 mL av APS behövs per gel. Datum röret efter att göra det. APS lösning upphör att gälla i 2 veckor och bör förvaras vid 4 ° C. - Överför 125 µL av tetramethylethylenediamine (TEMED) till ett separat mikrocentrifug rör.
Obs: TEMED är giftiga; bär personlig skyddsutrustning såsom handskar, Glasögon och lab päls när hantering. - Skaffa en sprutande flaska och ta bort spetsiga tratten. Mäta ut 125 mL vatten i en graderad cylinder och lägga till flaskan. Markera vattennivån på utsidan av flaskan med en permanent spritpenna. Släng vattnet. Denna modifierade sprutande flaska kan återanvändas på obestämd tid med ordentlig rengöring (se nedan).
- Ställa in korkade ringarna bredvid diskbänken så det finns plats att sätta gelen när det hälls. Placera plattan smörgås här. Sätta en kork i diskhon så det finns plats att sitta plattorna på medan gelen som hälls. Gelen kommer att hällas i glas tallrik smörgås i vinkel, så botten kommer att vila på korken medan toppen kommer att vila på kanten av diskbänken. Kontrollera att det finns kuddar under dessa områden om polyakrylamid häller off.
- Plats APS lösning och TEMED lösning på andra sidan av diskbänken, med tomt spruta flaska. Placera den väl kam med önskat antal brunnar på sidan av diskbänken med plattorna. Sätta 4 klämmor i närheten.
Obs: Nästa steg i förfarandet är mycket tid känsliga. Vara beredd att snabbt gå igenom dessa steg. Det finns en begränsad mängd tid att få blandningen mellan plattorna innan det polymerizes. Alla komponenter (Mikropipetter förinställd till rätt volym, lösningar, glasplattor) är noggrant ordnade till Häll gelen så snabbt som möjligt. Om en långsammare polymerisation önskas, APS och TEMED koncentrationer kan halveras; Detta kommer dock att kräva längre polymerisation. - Häll 20% akrylamid gellösningen i den sprutande flaskan till den Markera punkten. Häll lite mer gellösningen ovanför den markerade linjen, så det finns tillräckligt lösning när det gäller små läckor. Detta är cirka 120 mL gel lösning.
- Lägga till 120 μl TEMED och 600 µL APS till Polyakrylamidgelen lösningen i den sprutande flaskan på samma gång. Snabbt lägga till en ytterligare 600 µL av APS i polyakrylamid gellösningen.
- Cap snabbt den sprutande flaska och virvel. Placera plattan smörgås i diskhon.
- Börja hälla. Detta bör endast ta 1-2 min för att undvika polymerisation. Sakta, men säkert, lägga till trycket i spruta flaskan så gellösningen kommer ut jämnt. Om lösningen börjar stänker oregelbundet från flaskan med spruta, släppa trycket så flaskan blir uppblåst och återuppta hälla. Se Kontrollera gellösningen täcker alla områden, och det inte läcker från någon av sidorna. Ta bort luftbubblor, ändra vinkeln på plattorna. Bubblorna kommer pop överst, och kommer att köra snabbare om vinkeln är brantare. Fortsätt hälla tills lösningen har nått toppen av skårade området, och något överfyllda den skårade kanten. Avlägsna alla luftbubblor.
Obs: Om plattan smörgås läcker, eller finns det inte tillräckligt gel lösning och lösningen når inte toppen av plattorna, gelen kan inte användas. Vänta tills gelen har polymeriseras och rengör följaktligen. - Lägga till väl kammen plattan smörgås. Plats 4 klämmor på kammen att trycka ner och möjliggör jämn fördelning av brunnarna.
- Släng snabbt resterande gellösningen i flaskan med spruta i märkta polyakrylamid avfall. Skölj ut den sprutande flaskan med DI vatten 2 - 3 gånger, genom spruta munstycket.
Obs: Det är viktigt att utföra denna rengöring snabbt för att förhindra polyakrylamid från igensättning i den sprutande flaskan. Om även en liten mängd polymerisation inträffar inom munstycket, kommer nästa gelen hällas alltför långsamt och inte framgångsrikt. Kassera sprutande flaska om polymerisation inträffar.
- göra 3 mL 10% ammonium persulfatoxidation lösning (APS) genom upplösning 0,3 g ammonium persulfatoxidation och späda upp till 3 mL i ultrarent vatten.
- Rena plattor
- Kör akrylamid gelen
- medan gel är att vara polymeriserat, se 1 x TBE rinnande buffert. Lös upp 17 g färdigblandad TBE fast i 1 L ultrarent vatten. Skaka buffert tills alla TBE är upplöst.
- Ta bort alla bindemedel klipp från plattan smörgåsen.
- Använda en rakhyvel att klippa bandet och ta bort tejpen från alla kanter av plattan smörgås.
- Rena off alla polymeriserade gelen från glaset ytor. Använda en rakkniv längs kanterna för att skrapa bort kvarvarande gel. Torka av plattorna med hushållspapper och vatten för att avlägsna så mycket polyakrylamid rester som möjligt. Överskjutande akrylamid och/eller tejp kan ofta bränna under gelelektrofores.
- Ta bort väl kammen genom att trycka det ut jämnt på båda sidor.
- Använda en rakhyvel för att skära av överskjutande gelen längs toppen av plattan smörgås. Slice längs den skårade kanten av plattan.
- Använda en spruta och DI vatten skölj brunnarna och ta bort skräp i brunnarna. Kontrollera varje brunn kan fyllas med vatten och inte blockeras av överskjutande polymeriserade gelen.
- Placera plattan smörgåsen in i apparaten, så att längre plattan vänd utåt, och spårat utrymmet inåt.
- Lägg till klipp i clip plattan smörgås och aluminium plattan tillsammans med apparaten. Lägg till utsidan av plattan att främja även köra.
- Lägg TBE buffert för att täcka bas skårorna och precis tillräckligt för att täcka brunnarna på toppen. TBE-buffert kan filtreras och återanvändas för ca 5 geler.
- Varma plåtar för 20 min genom att köra den gel-elektrofores vid 50 W.
- Efter uppvärmningen plattorna, rensa brunnarna. Använd en spruta och TBE buffert i Bad för att spruta resterande buffert salter från brunnarna. Gör detta flera gånger för att säkerställa rena brunnar. Om brunnarna inte är rena, banden kommer striden och bilden kommer inte att vara tolkningsbara. Även om detta kan vara tidskrävande, vi har funnit det nödvändigt att erhålla bra data.
- Till yttersta körfält på båda sidor, Pipettera 5 µL av 95% formamid med bromophenol blå. Detta är samma lösning som QBO, men med bromofenolblått som i stället för Orange G. Detta kommer att ge en visuell på var att skära gelen för imaging, och hur långt ner DNA har köra.
- För varje prov som skall analyseras (genereras i avsnitt 2.1.1), tillsätt 3 µL till en enda brunn av gelen. Efter lastning alla prover, vänta 1 min för prover sedimentera.
- Sätta lock på både toppen och botten plast bad. Fästa trådarna till apparaten. Rött anger den positiv elektrisk laddningen, så det borde vara på botten så att DNA körs nedåt.
- Attach kablar till en makt källa och anger 50-55 W. Kör gelen för cirka 3 h eller tills bromophenol blått färgämne front har körts minst 2/3 ner gelen.
- Imaging gelen
Obs: denna gel är mycket tunt och kan vara svåra att hantera. Stor försiktighet måste vidtas för att förhindra rippning och förlust av hela gelen.
Obs: beroende på DNA etiketten, det kan behöva använda olika gel imagers. Detta protokoll använder infrarött fluorescerande färgämnen och avbildning av prover utfördes på en gel imager (se Tabell för material). Protokollet är speciellt skriven för att imager.- När bromofenolblått dye framsidan har kör minst 2/3 ner gelen (~ 28 cm), gelen kan stoppas genom att stänga av strömmen. Ta bort gelen från apparater och plats på cork ringar.
- Separata plattorna med en liten kil oljeavskiljare. Placera avgränsaren på insidan hörnet av skårorna att dra upp. Försiktig och Använd inte överdriven kraft; skårorna kan bryta om för mycket tryck appliceras.
- När sug mellan plattorna släpps, lyft den övre plattan försiktigt och avgöra vilken tallrik som gelen är på. Om gelen pinnar på bottenplattan, dra övre plattan av och placera på cork ring. Om gelen är på den övre plattan lyfts, flytta långsamt och gelen kan falla tillbaka till bottenplattan. Om gelen inte faller, igen flytta långsamt och dra den återstående delen av gelen från bottenplattan, och placera den övre plattan med gelen på en separat kork ring.
- När plattorna skiljs åt, se där färgen är på gel och ta bort överflödig gel från toppen och botten av gelen. Vanligtvis med våra konstruktioner, finns med hjälp av antingen en 18 eller 23 nukleotid primer och en 45 nukleotid mall, det ingen DNA mellan bromophenol blått färgämne framtill och botten av gelen. Klipp vertikalt från färgämnet till toppen av gelen. Mellanrummen mellan färgen och kanterna på gelen har också ingen DNA. Slutligen skär ett par inches nedanför väl utrymmet på gelen. Det finns ingen nukleinsyror på toppen av gelen.
Obs: Skära gelen till den minsta möjligt storlek gör det betydligt lättare att överföra på bildenheten. Om gelen är för stor, är det mer mottagliga för rippning under överföringen. Medan vi trimma ofta gelen före imaging, rekommenderar vi använda extrem försiktighet när trimning som relevanta data kan gå förlorade om man inte är försiktig. För att kontrollera om bort delar innehåller ytterligare data, kommer vi ofta utföra en ytterligare genomsökning av exciderad portionr av gelen att säkerställa att inga data förlorade. - Coat gel med vatten för att förhindra uttorkning.
- Rengör imager ytan. Använda uppgiften vindrutetorkare, torka ytan med vatten och etanol. Lägg ett tunt lager av vatten till ytan där gelen ska placeras.
- Överföra den önska delen av gel på våta ytan av den Li-Cor.
- Ta bort luft bubblor genom att försiktigt trycka ut dem från gelen och torka med en uppgift-torkare. Var försiktig eftersom det är mycket lätt att rippa gelen genom att trycka luftbubblor för hårt.
- Bild gelen enligt tillverkaren ' s protokoll. Analysera gelen med tillgänglig programvara för kameran.
- Medan gelen är som avbildas, rengör arbetsytan genom att ta bort överflödig akrylamid gel, tvätta plattorna och filtrering TBE buffert återanvändas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En framgångsrik Polyakrylamidgelen analys av en kvalitativ karakterisering av samlade verksamhet (beskrivs i avsnitt 2.1, figur 1) och steady-state kinetiken (beskrivs i not på ingående av avsnitt 2.1, figur 2) visas. En misslyckad Polyakrylamidgelen analys visas också (figur 3).
Observera att inga kommersiellt tillgängliga stege eller molekylär markör används. Ibland, kommer att vi använda en känd polymeras-substrat kombination för att skapa en molekylär markör; Det är dock viktigt att notera att olika modifierade nukleotider har mycket olika elektroforetiska mobiliteter, gör jämförelse av oligonukleotider av samma längd men olika nukleotid struktur olämpligt.
Figur 1: exempel på framgångsrika Polyakrylamidgelen analys av en kvalitativ karakterisering av samlade verksamhet. Observera att de enskilda banden är väldefinierade och regelbundna. Banden representerar oligonukleotider av varierande längd; Denna gel möjliggör enkel jämförelse mellan polymeraser. Ingen enzym kontroll körfältet indikeras med ett ”-”. Verksamhet bedöms av både längden på produkterna och del av den märkta primer som konverteras till större produkter. Från denna analys är E6 och E5 mest aktiva. E3 och E2 är ungefär lika i aktivitet, men mindre än E6 eller E5, och E4 och E1 är de minst aktiva enzymerna.
Figur 2: exempel på framgångsrika gel för kvantitativ analys med hjälp av steady-state kinetiken. Observera att banden är väl löst och väl definierade. För att mäta steady state konstanter av enskilda steg i syntesen av oligonukleotiden, inkuberas ett enzym som med varierande mängder nukleosid adenosintrifosfat (i detta fall, dCTP); Observera att endast n och (n + 1) produkter är syntetiserade möjliggör kvantifiering av händelsen singular.
Figur 3: exempel på en misslyckad gel för samlade verksamhet. Gelen slets under hanteringen, vilket resulterar i synliga luckor i band. Observera att banden gel är oregelbundet formade, försvårar kvantifiering och analys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här har vi beskrivit ett test för att karakterisera DNA-polymeras-medierad syntesen av M-DNA. Genom att använda infrarött märkt DNA primers och använder denatureringen polyakrylamid gelelektrofores för att lösa olika stora oligonukleotider, kan vi få enda nukleotid resolution om oligonukleotider, möjliggör exakt mätning av syntes. Dessa metoder kan användas till antingen mäta den totala aktiviteten av enzymet (avsnitt 2.1) eller att mäta Michaelis-Menten parametrarna för enskilda stegen (Observera följande steg 2.1). Vårt labb har nyligen använt dessa till både karakterisera tidigare utvecklade enzymer9 samt rationellt konstruerad enzymer10.
Våra analyser som beskrivs här skiljer sig från tidigare metoder i sin användning av en icke-radioaktiva DNA-etikett. Radioaktiviteten har historiskt använts för att spåra DNA-syntes på grund av den höga känsligheten som kan erhållas med hjälp av radioaktivt fosfor etiketter11,18. Tyvärr, de höga kostnaderna för bortskaffande samt radioaktivt etiketter begränsad hållbarhetstid kan göra användning av radioaktiva etiketter oöverkomliga. Här, beskriver vi användningen av infrarött fluorophore märkt DNA, som inte lider av dessa nackdelar. Noterbart med nära infraröd fluorescerande färger ser vi liknande detektionsgränser radioaktivt märkt DNA (opublicerade resultat). Dock med fluorescerande färgämnen i det synliga området var vi inte kunna observera liknande detektionsgränser (opublicerade resultat). Medan vår grupp använder normalt kommersiellt beredd DNA bär nära infrarött fluorophores, är dessa färgämnen kompatibel med ett antal etablerade efter syntes 5' modifiering kemiska sammansättningar som kan användas för att installera dessa etiketter.
Nära infrarött fluorescerande färgämnen är också fördelaktiga i att det finns flera kommersiellt tillgängliga färger, som kan aktivera mer komplexa experiment som övervakar syntes av två märkta oligonukleotider i ett enda experiment. Med radioaktivt etiketter utförs dessa typer av flerkomponents experiment enkelt inte. Detta gör sannolikt att ett antal mer komplexa experiment, särskilt för rätvinkliga replikering experiment.
Denna analys, och någon analysmetod som använder denatureringen polyakrylamid gelelektrofores, begränsas främst av tekniska utmaningen att exekvera elektrofores, låg genomströmning av dessa experiment, liksom begränsade storlek spänner som kan observeras på enda nukleotid upplösning. Vi hoppas att detta detaljerade protokoll tillåter grupper att övervinna de tekniska utmaningarna av dessa analyser. Särskilt, medan genomströmning av analysen är begränsande, ökar användning av infrarött fluorescerande etiketter genomströmningen, eftersom det inte kräver att användaren kan utveckla en autoradiograph. Gelen tar dock fortfarande cirka 4-6 h att ställa och köra, begränsning av antalet experiment som kan köra per dag. Den begränsade utbud orsakas av polyakrylamid elektrofores kapacitet. Praktiskt sett dessa begränsningar innebär att dessa analyser är bäst för fokuserad forskningsfrågor som kräver enda nukleotid upplösning.
Hög genomströmning DNA sekvensering19 har nyligen använts alltmer som en metod för att karaktärisera DNA-polymerases20,21. Dessa analyser är anmärkningsvärd för sin dramatiskt ökad genomströmning, vilket gör bredare frågor fokuserade på sekvens fördomar och fel spektra. Viktigare, medan hög genomströmning sekvensering kan aktivera många parallella experiment, kan det vara svårt för att tolka på en enda nukleotid bas. Detta ger en spännande möjlighet för enzym analyser anställa polyakrylamid gelelektrofores att fylla i luckorna i hög genomströmning sekvensering, se till att de metoder som beskrivs i den här artikeln är relevant för många år framöver.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete fick stöd av forskning Corporation för vetenskapens framsteg (Cottrell College Scholar Award #22548) och av TriLink Biotechnologies (ResearchReward Grant #G139).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tris HCl | Promega | H5123 | |
| Tris Base | Promega | H5131 | |
| MgCl2 | Fisher Scientific | BP214-500 | |
| Acetylated BSA | Promega | PR-R3961 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| Dithiothreitol (i.e. DTT) | Research Products International | D11000 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid (i.e. EDTA) (0.5M solution) | Sigma | 03690-100mL | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Formamide | Acros | AC42374-5000 | |
| Orange G | Sigma Aldrich | O3756 | |
| Bromophenol blue | Fisher Scientific | 50-701-6973 | |
| dNTPs | Fisher Scientific | FERR0191 | |
| M-dNTPs (riboNTPs) | Fisher Scientific | 45-001-341 (343, 345, 347) | |
| M-dNTPs (all other modified NTPs) | TriLink Biotechnologies | assorted | |
| primer 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We use the IR700 dye which can be purchased as a custom synthesis. We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dTAATACGACTCACTATAGGGAGA |
| template 1 | IDT DNA / TriLink Biotechnologies | Custom Syntheses | We typically purchase the oligonucleotides HPLC purified. Sequence is 5’-dCGCTAGGACGGCATTGGATCAGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTA |
| Acrylamide | Research Products International | A11405 | 38.67% acrylamide and 1.33% bis-acrylamide |
| Tris/Borate/EDTA (TBE) solid | Research Products International | T22020 | |
| Urea ultrapure | Research Products International | U20200 | |
| Gel tape | CBS Scientific | GT-72-10 | |
| Large white spring clamp polypropylene | CBS Scientific | GPC-0001 | |
| Ammonium persulfate (APS) | Fisher Scientific | BP179 | |
| Tetramethylethylenediamine (TEMED) | Fisher Scientific | BP15020 | |
| 0.75 mm spacers | CBS Scientific | SGS-20-0740A | |
| 33x42 Notched Glass Plate Set | CBS Scientific | SGP33-040A | |
| Wedge plate separator | CBS Scientific | WPS-100 | |
| Comb for gel electrophoresis | CBS Scientific | SG33-0734 | |
| Gel electrophoresis rig | CBS Scientific | SG-400-33 | |
| ultrapure water | we use a Milli-Q system from Millipore | ||
| DNA polymerases | we prepare these in our laboratory using published protocols. |
References
- Ong, J. L., Loakes, D., Jaroslawski, S., Too, K., Holliger, P. Directed evolution of DNA polymerase, RNA polymerase and reverse transcriptase activity in a single polypeptide. J Mol Biol. 361 (3), 537-550 (2006).
- Chen, T., Romesberg, F. E.
- Leconte, A. M., et al. Directed evolution of DNA polymerases for next-generation sequencing. Angew Chem Int Ed Engl. 49 (34), 5921-5924 (2010).
- Xia, G., et al. Directed evolution of novel polymerase activities: mutation of a DNA polymerase into an efficient RNA polymerase. Proc Natl Acad Sci U S A. 99 (10), 6597-6602 (2002).
- Chen, T., et al. Evolution of thermophilic DNA polymerases for the recognition and amplification of C2'-modified DNA. Nat Chem. 8 (6), 556-562 (2016).
- Thirunavukarasu, D., Chen, T., Liu, Z., Hongdilokkul, N., Romesberg, F. E. Selection of 2'-Fluoro-Modified Aptamers with Optimized Properties. J Am Chem Soc. 139 (8), 2892-2895 (2017).
- Taylor, A. I., et al. Catalysts from synthetic genetic polymers. Nature. 518 (7539), 427-430 (2015).
- Alves Ferreira-Bravo, I., Cozens, C., Holliger, P., DeStefano, J. J. Selection of 2'-deoxy-2'-fluoroarabinonucleotide (FANA) aptamers that bind HIV-1 reverse transcriptase with picomolar affinity. Nucleic Acids Res. 43 (20), 9587-9599 (2015).
- Schultz, H. J., et al. Taq DNA Polymerase Mutants and 2'-Modified Sugar Recognition. Biochemistry. 54 (38), 5999-6008 (2015).
- Rosenblum, S. L., et al. Design and discovery of new combinations of mutant DNA polymerases and modified DNA substrates. Chembiochem. 18 (8), 816-823 (2017).
- Creighton, S., Goodman, M. F. Gel kinetic analysis of DNA polymerase fidelity in the presence of proofreading using bacteriophage T4 DNA polymerase. J Biol Chem. 270 (9), 4759-4774 (1995).
- Joyce, C. M., Benkovic, S. J. DNA polymerase fidelity: kinetics, structure, and checkpoints. Biochemistry. 43 (45), 14317-14324 (2004).
- Leconte, A. M., et al. Discovery, characterization, and optimization of an unnatural base pair for expansion of the genetic alphabet. J Am Chem Soc. 130 (7), 2336-2343 (2008).
- Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
- Karger, B. L., Guttman, A. DNA Sequencing by Capillary Electrophoresis. Electrophoresis. 30 (Suppl 1), S196-S202 (2009).
- Lawyer, F. C., et al. High-level expression, purification, and enzymatic characterization of full-length Thermus aquaticus DNA polymerase and a truncated form deficient in 5' to 3' exonuclease activity. PCR Methods Appl. 2 (4), 275-287 (1993).
- Lawyer, F. C., et al. Isolation, characterization, and expression in Escherichia coli of the DNA polymerase gene from Thermus aquaticus. J Biol Chem. 264 (11), 6427-6437 (1989).
- Carroll, S. S., Cowart, M., Benkovic, S. J. A mutant of DNA polymerase I (Klenow fragment) with reduced fidelity. Biochemistry. 30 (3), 804-813 (1991).
- Shendure, J., Ji, H.
- Larsen, A. C., et al. A general strategy for expanding polymerase function by droplet microfluidics. Nat Commun. 7, 11235 (2016).
- Cozens, C., et al. Enzymatic Synthesis of Nucleic Acids with Defined Regioisomeric 2'-5' Linkages. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (51), 15570-15573 (2015).
