Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي

doi: 10.3791/56234 Published: December 15, 2017
* These authors contributed equally

Summary

ويصف هذه المخطوطة نهج عام لتصميم مصممة خصيصا لزراعة الميكروبات وسائط الإعلام. يتم تمكين هذا بسير عمل تكراري الجمع بين القائم على كريجينج التجريبية التصميم وميكروبيوريكتور التكنولوجيا لإنتاجية زراعة كافية، الذي يدعمه مختبر الروبوتات زيادة الموثوقية وسرعة في السائل التعامل مع وسائل الإعلام إعداد.

Abstract

أعمال أساسية في مجال التكنولوجيا الحيوية الصناعية باستخدام الخلية الميكروبية إنتاج المصانع هي عملية تكرارية من سلالة الهندسة والاستغلال الأمثل للظروف البيولوجية. أحد الجوانب الهامة هو تحسين زراعة المتوسطة لتوفير بيئة مثلى لتشكيل الميكروبي للمنتج للفائدة. من المقبول أيضا أن تشكيل وسائل الإعلام يمكن أن تؤثر تأثيراً جوهريا الأداء الشامل البيولوجية. تعرف التغذية المتوسطة الحجم الأمثل لتحسين بروتين المؤتلف الإنتاج مع النظم الميكروبية، وبالتالي، هذا خطوة مفيدة في التنمية البيولوجية. ومع ذلك، وصفات الوسائط القياسية في كثير من الأحيان مأخوذة من الأدب، نظراً لتصميم مصممة خصيصا للمتوسط زراعة مهمة شاقة تتطلب تكنولوجيا ميكروبيوريكتور ليكفي زراعة الإنتاجية، وتحليلات سريعة المنتج، فضلا عن الدعم بمختبر الروبوتات لتمكين الموثوقية في السائل التعامل مع الخطوات. وعلاوة على ذلك، الأساليب الرياضية المتقدمة المطلوبة لتحليل بيانات القياس عقلانية وكفاءة تصميم تجارب موازية مثل تحقيق محتوى المعلومات الأمثل.

الطبيعة العامة للبروتوكول قدم يسمح لتكييف سهلة لمعدات مختبر مختلفة وأخرى تستضيف التعبير والبروتينات المستهدفة من الفائدة، فضلا عن مزيد من البارامترات البيولوجية. وعلاوة على ذلك، يمكن اختيار أهداف التحسين الأخرى مثل معدل إنتاج البروتين، ومحصول معين، أو جودة المنتج لتتناسب مع نطاق الدراسات التحسين الأخرى. الأدوات كريجينج التطبيقية (كريكيت) هو أداة عامة للتصميم للتجارب (وزارة الطاقة) أن يسهم البيولوجية كلي تحسين أمثلية. وهو يدعم أيضا متعدد الأهداف الأمثل الذي يمكن أن يكون هاما في تحسين عمليات المنبع والمصب على حد سواء.

Introduction

تكنولوجيا الجينات المؤتلف الحديثة تتيح الاستخدام الواسع للإنزيمات التقنية لمختلف التطبيقات في صناعة المستحضرات الصيدلانية والحيوان التغذية، الكيمياء العضوية، والأغذية المعالجة1،2،3. إنتاج الإنزيمات التقنية بكميات كبيرة موضوع رئيسي للتكنولوجيا الحيوية الصناعية وإنتاج البروتين المؤتلف الأمثل، وكل سلالة وهناك حاجة للهندسة البيولوجية. تتوفر لتوليد سلالات الإنتاج كفاءة هندسيا، المكتبات الوراثية مختلفة، مثلاً، ل التعبير الجيني متوازن4 أو إفراز زيادة كفاءة5.

جلوتاميكوم وتدية منتج رئيسي للأحماض الأمينية في6،النطاق الصناعي7 ويمثل مضيف جاذبية تعبير غير تقليدية لإنتاج البروتينات المؤتلف8 الافرازية ،9. العامة الافرازية (ثانية) والمسار إزفاء التوأم ارجينين (تأت) موجودة في جلوتاميكوم جيم- وطبقت بنجاح ل إفراز البروتين المؤتلف10. خبرة واسعة في مجال الهندسة البيولوجية فيما يتعلق بإنتاج الأحماض الأمينية على نطاق صناعي، فضلا عن القدرة على إفراز البروتينات غرام/لتر المبالغ11 ومتانة كبيرة بشأن إينهوموجينيتيس البيولوجية الموجودة في نطاق واسع جعل الزراعات12،13، جلوتاميكوم C. كائن منصة واعدة لإنتاج البروتينات مغايرة الافرازية على النطاق الصناعي.

ومن المعروف التغذية المتوسطة الحجم الأمثل لتحسين إنتاج البروتين المؤتلف مع النظم الميكروبية14،15،،من1617 ، ونتيجة لذلك، تعديل المتوسطة التكوين خطوة مفيدة في البيولوجية التنمية فيما يتعلق بالإنتاجية المثلى18،19،،من2021. البحث المكثف عن تطبيق لوحات ميكروتيتير (MTPs) لزراعة الميكروبات22،،من2324 مهد الطريق لوضع وتصميم الخطط المتوسطة الأجل لزراعة الميكروبات25 ،26 وتطوير نظم ميكروبيوريكتور على أساس الخطة المتوسطة الأجل (MBR) مع مراقبة الإنترنت والبيئية مراقبة27،28. تمكين مبرس زيادة كبيرة في إنتاجية زراعة تجريبية. وعلاوة على ذلك، تتوفر أنظمة MBR النابعة من الأنواع الأخرى من المفاعلات الحيوية، مثلاً، فقاعة الأعمدة أو دبابة المقلبة المفاعلات، للجراثيم البيولوجية الأمثل29،،من3031، 32.

وبصفة عامة، دراسات تحسين الاستفادة من زيادة الإنتاجية التجريبية، التي تصبح أكثر قوة في تركيبة مع المنهجيات الكيان التشغيلي المعين، مثل تقييم التفاعلات بين متغيرات التصميم أو تقليل المسافات البحث عالية ثلاثي الأبعاد. ونتيجة لذلك، قد ثبت الجمع بين استخدام نظم MBR وأتمتة معمل والكيان التشغيلي المعين أن طريقة قوية في مجال التكنولوجيا الأحيائية8،16،33،،من3435.

بروتوكول لتحسين وسائل الإعلام يرد الجمع بين أتمتة مختبر الدولة للفنون، والتكنولوجيا MBR مع رصد عملية على الإنترنت، وتصميم التجارب/تحليل البيانات المستندة إلى كريجينج. يتم تطبيق المنهجية كريجينج في مجموعة أدوات MATLAB ("كريكيت") والتي يمكن تحميلها واستخدامها مجاناً مقابل36. كمثال على التطبيق، يظهر تعظيم إنتاج البروتين (بروتينات فلورية خضراء) الافرازية fluorescent الخضراء مع جيم جلوتاميكوم عن طريق تحسين تكوين متوسط الحد الأدنى كجكسيي. واختير عيار بروتينات فلورية خضراء كالهدف الأمثل كما أنه يمكن قياسها كمياً بسهولة ويتم تطبيقه على نطاق واسع كنموذج البروتين للدراسات المتعلقة بحصر نظم37،،من3839.

إطار المقدمة ينقسم إلى أربع خطوات، التي تتجلى في الشكل 1. الخطوات المشار إليها بواسطة مربع الإطارات وتتوافق مع أجزاء من البروتوكول. الخطوة الأولى (الشكل 1A) هي لتحديد أهداف المشروع وتحديد أساليب المطلوبة. المزيج من منهجيات وزارة الطاقة والتكنولوجيا MBR وأتمتة معمل يسمح زيادة إنتاجية تجريبية تتطلب معالجة البيانات القوية. الخطوة الثانية (الشكل 1B) يهدف إلى الكشف عن متغيرات التصميم الحساسة (أيمكونات متوسطة) مع عالية التأثير على الهدف الأمثل. وهذا يؤدي إلى تخفيض عدد متغيرات التصميم للفائدة. الخطوة الثالثة (الشكل 1) تضم الأمثل متكررة لإجراء تحقيق أكثر تفصيلاً للعلاقة الوظيفية بين متغيرات التصميم المتبقية والهدف من الفائدة. استخدام مجموعة البيانات الموسعة تباعا، تطبيق هذا النهج كريجينج للتنبؤ بنتائج تجريبية في مواقع المقيسة. توقف دورة متكررة بمجرد نموذج كريجينج تتنبأ الأمثل أو الهضبة بدقة كافية. يتم التحقق من النتائج في الخطوة الرابعة (الشكل 1)، بدءاً بتحليل حساسية مزيد حول المثلى التي تم تحديدها. إذا في البداية، يتم العثور على مكونات غير حساسة تكون متحسسة أيضا في منطقة الأمثل، فمن المعقول أن نفترض أن هذا صحيح أثناء إجراء التحسين متكررة في الخطوة الثالثة. بعد ذلك، ينصح بتطبيق أساليب متعامد، مثل تحليل نشاط أو الحزب الديمقراطي الصربي صفحة للتحقق من النتائج الأمثل.

الطبيعة العامة للبروتوكول قدم يسمح للتأقلم مع سهلة لمعدات مختبر مختلفة وأخرى تستضيف التعبير والبروتينات المستهدفة للاختيار، فضلا عن مواصلة البيولوجية المتغيرات مثل درجة الحرارة القيمة أو زراعة الأس الهيدروجيني.وعلاوة على ذلك، يمكن اختيار أهداف التحسين الأخرى مثل معدل إنتاج البروتين، ومحصول معين، أو جودة المنتج لتتناسب مع نطاق الدراسات التحسين الأخرى.

Figure 1
الشكل 1 : سير الدراسة الأمثل. الإطار أربعة المربعات تتوافق مع أجزاء من البروتوكول، "تصور دراسة وتعريف لأساليب" (القسم 1)، "تحليل الحساسية" (القسم 2)، "تكرارية الأمثل" (المادة 3)، و "التحقق من الصحة" (المادة 4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Protocol

1-تصور أن الدراسة وتعريف أساليب (الشكل 1: الجزء ألف)

ملاحظة: تعريف الهدف الأمثل: هو بالطبع وقت لتشكيل المنتجات المطلوبة أو ذات الصلة سوى فترة زمنية محدودة أو حتى نقطة محددة من الزمن؟ أيضا، النظر في القضايا المحتملة مثل الاستقرار، جهد للتحليل الكمي، أو وقت زراعة. كبديل لعيار البروتين النهائي، يمكن النظر في أهداف أخرى مثل الوقت الكتلة الحيوية أو زراعة. الكتلة الأحيائية ينعكس غلة الكتلة الحيوية منتج معين، بينما يعكس الوقت زراعة الفضاء بعد المحصول مرة. جودة المنتج (الحد الأدنى) يمكن أن تكون هدفا. الأمثل متعدد الأهداف قد تكون مطلوبة في حالات معينة، كما ورد في مكان آخر من40. في هذه الدراسة، تم اختيار عيار بروتينات فلورية خضراء بعد ح 17 زراعة الهدف الأمثل. يمكن أن يتبع الأسفار التجارة والنقل عبر الإنترنت باستخدام المعدات المتاحة في هذه الدراسة، الذي يبسط إلى حد كبير في تحديد تركيز البروتين النموذجي.
ملاحظة: تعريف المعلمات الأمثل: المتوسطة كجكسي تتألف من المكونات الفردية 1641 والتحقيق في كل هذه في تصميم مضروب الكاملة ستؤدي إلى تجارب 65,000 ≈16 2. ونتيجة لذلك، يحتاج مساحة البحث يتم تخفيض على أساس عقلاني ويحركها إلى الخبرة. ويمكن دعم اختيار مكونات الإعلام النظر للتحسين بمعرفة الخبراء المتاحة أو البيانات الأدب.

  1. تحديد تركيزات المكونات المتوسطة التي ينبغي أن لا تكون متنوعة. للاستفادة المثلى متوسطة كجكسيي، تم اختيار المكونات التالية لتكون ثابتة:
    1. الجلوكوز هو ثابت في 10 جرام/لتر. هذا التحسين تافهة لأن الجلوكوز أكثر غلة أكثر بروتينات فلورية خضراء إفراز الكتلة الحيوية. يهدف إلى الكشف عن الآثار المتوسطة غير بديهية.
    2. 3-(N-morpholino) حمض بروبانيسولفونيك (والمماسح) هو ثابت في 42 غ/ل. وهذا يوفر سعة التخزين المؤقت كافية أثناء زراعة دفعة ولا يتم استقلاب.
      ملاحظة: إضافة والمماسح في هذا التركيز النهائي يضمن قيمة بداية من الرقم الهيدروجيني 7، حتى مع كميات مختلفة من الحلول الأسهم الأخرى المضافة، التي ليست على درجة الحموضة 7. ومع ذلك، لاستبعاد أي انحراف في بدء قيم الأس الهيدروجيني، درجة الحموضة يجب التحقق من التراكيب المتوسطة حيث يتم إضافة كافة الحلول الأسهم في أحجامها الحد الأقصى والحد الأدنى.
    3. يتم إصلاحها خ2ص4 وك2هبو4 في 1 غرام/لتر كل. هذه توفير قدرات التخزين المؤقت أيضا، ويخدم كمصدر لفوسفات.
    4. اليوريا ثابتاً عند 5 غ/ل. وهذا يخدم كمصدر النيتروجين القاعدية وعامل استقرار الأس الهيدروجيني، كافية لمنع الحد من N.
    5. البيوتين هو ثابت في 0.2 مغ/ل. جلوتاميكوم C. ATCC13032 أوكسوتروفيك البيوتين.
    6. حمض بروتوكاتيتشويك (PCA) هو ثابت على 30 مغ/لتر. هو بمثابة عامل خالب حديد.
    7. يتم إصلاح الأيزوبروبيل-β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج) في 100 ميكرومتر. فإنه يدفع تعبير الجينات التجارة والنقل .
  2. حدد ارتفاع وانخفاض تركيزات مكونات وسائط الإعلام لفحوص الحساسية الأولية. هنا، وقد تم اختيار مكونات من ثلاث مجموعات نموذجية من عناصر الوسائط. التحقيق تركيزات منخفضة وعالية لكل مكون من مكونات،:
    1. مصدر النيتروجين القياسية: (NH4)2هكذا4 (8-32 غرام/لتر)؛ تباين مصدر النيتروجين أفيد أن تكون واعدة للاستغلال الأمثل للتجارة والنقل الخاصة بالكتلة الأحيائية إشارة8.
    2. العناصر النزرة: FeSO4 ∙ 7 ح2س (4-16 مغ/لتر)، منسو4 ∙ ح2س (4-16 مغ/لتر)، زنسو4 ∙ 7 ح2س (0.4 1.6 مغ/لتر)، CuSO4 ∙ ح 52س (125-501 ميكروغرام/لتر)، نيكل2 ∙ 6 ح2س ( 8-32 ميكروغرام/لتر) وكوكل2 ∙ 6 ح2س (52-208 ميكروغرام/لتر). يتم توريث تكوين العناصر النزرة من المنشور الأول من كجكسي متوسطة41. وباﻹضافة إلى ذلك، مو نا24 ∙ ح2س (26-104 ميكروغرام/لتر) وح3بو3 (20-80 ميكروغرام/لتر) قد أدرجت باعتبارها عناصر التتبع، كما أنها تستخدم في البديل منشورة من كجكسي متوسطة42.
    3. عناصر الماكرو: مجسو4 ∙ 7 ح2س (0.2-0.4 g/L)، كاكل2 ∙ ح 22س (5.3-21.2 مغ/لتر). هذه عثر بين الكاتيونات divalent الأخرى لتعزيز إنتاج بروتينات فلورية خضراء الافرازية في آخر دراسة14، التي استخدمت فيها سلالة جلوتاميكوم C. R مع خلفية متوسطة مختلفة والببتيد الإشارات تأت CgR0949.
  3. إعداد المواد والإجراءات تعريف
    ملاحظة: ينصح بتعريف وإصلاح طرق تجريبية على مستوى تفصيلي. ويكفل هذا التوحيد أن نتائج مختلفة يمكن أن ترجع إلى التغيرات البيولوجية الجوهرية أو التراكيب متوسطة مختلفة.
    ملاحظة: وسائط الإعلام الأسهم الحلول: إعداد الحلول الأسهم الفردية لجميع مكونات وسائط الإعلام بالتحقيق. إعداد الأرصدة مركزة للغاية للسماح لتخفيف أحجام مختلفة لكافة المكونات. وهذا يعني أن بعد الجمع بين كافة الحلول الأسهم في حجمها أعلى وفقا لخطة التصميم، لا يمكن أن يتجاوز هذا حجم زراعة النهائي، انظر الفقرة "جيل قائمة الحل الأسهم المتوسطة بيبيتينج" خطوة 1.3.3. إذا كانت النتائج إضافة إلى حل مركزة بشكل كبير في وحدة تخزين منخفضة جداً بإضافة، مثل < 1/100th حجم زراعة النهائي، تمييع الحل الأسهم تبعاً لذلك. على سبيل المثال، وفي هذه الدراسة عرف حجم أقل من 10 ميليلتر بيبيتينج أن تكون غير مجدية. عادة، حلول العناصر النزرة مركزة عالية ك 1,000fold فيما يتعلق بتركيز القياسي النهائي في الأجل المتوسط. فمن المفيد أن تركز وسائل الإعلام مكونات كمضاعفات (تجليد-X) فيما يتعلق بتركيزات في وصفه مرجع. بالقيام بذلك، يتم تجنب وحدات التخزين بيبيتينج غير مجدية لكسور عشرية. وترد في الوثيقة التكميلية وصفات تفصيلية لجميع الحلول الأسهم المتوسطة كجكسيي.
    1. العامل خلية بنك (WCB)
      ملاحظة: لكل تجربة النمو، يتم استخدام واحد WCB اليكووت. إذا كانت هناك حاجة إلى مزيد من مختبرين، استخدام 100 مل الدماغ القلب ضخ (بهي) المتوسطة في حيرة 1,000 مل يهز قوارير أو تطعيم قوارير اهتزاز متعددة، التي يتم تجميعها قبل إضافة الحل والغليسيرول.
      1. إعداد المستعمرات واحدة من بكجفود جلوتاميكوم C. سلالة التعبير المؤتلفبكالوريوسالتجارة والنقل-43 في لوحات أجار (مسحوق بهي 37 غرام/لتر، أجار 20 غرام/لتر، كاناميسين 25 مغ/لتر). تصفيح المواد يمكن أما تأتي من التحول طازجة أو من قاسمة cryopreserved.
احتضان عند 30 درجة مئوية حتى ظهور مستعمرات واحدة؛ وهذا يأخذ عادة يوم أو يومين.
  • تلقيح ثقافة قارورة شاكر (50 مل بهي المتوسطة مع 25 مم تهز القطر، 250 دورة في الدقيقة، 30 درجة مئوية، كاناميسين 25 مغ/لتر، 500 مل حيرة قارورة) مع المواد مستعمرة واحتضان بين عشية وضحاها (حوالي 16 ح).
  • الجمع بين حجم واحد من تعليق الخلية الناتجة مع حجم واحد من 500 غرام/لتر والغليسيرول العقيمة الحل وتوزيعها في مختبرين 2 مل في قنينات للواسمات العقيمة. مخزن في-80 درجة مئوية.
  • بروتوكول زراعة MBR
    ملاحظة: لنظام MBR بيوليكتور العاملين في هذه الدراسة، منتشرة في ضوء (الكتلة الحيوية) والأسفار بروتينات فلورية خضراء هي قياسات الكثافة، التي تحتاج إلى كسب قيمة معينة تم تعيينها. ارتفاع المكاسب، هو تضخم أعلى الإشارة الضوئية؛ وهذا أيضا لماذا يتم قياس الضوء المتناثرة والأسفار في وحدات التعسفي (a.u.). تحديد قيم الربح مناسبة للكتلة الأحيائية واكتشاف بروتينات فلورية خضراء في التجارب الأولية، جنبا إلى جنب مع اهتزاز تردد مناسبة وملء وحدة التخزين لتجنب القيد الأكسجين في تركيزات أعلى من الكتلة الحيوية خلال المراحل اللاحقة من عملية. شروط زراعة العاملين ("فلوويربلاتيس"، أي، MTPs 48، حسنا، تهز التردد 1,200 لفة في الدقيقة، ملء حجم 1,000 ميليلتر، 10 غرام/لتر الجلوكوز كمصدر للكربون الرئيسية على شكل زهرة) كفل الأكسجين الزراعات غير محدود. معدلات نقل الأوكسجين القصوى الناجمة عن تركيبات أخرى ملء مجلدات وتهز الترددات في MTPs 48-جيدا على شكل زهرة، تتوفر أوراق البيانات من المورد. أيضا، قد تحدث عيوب نمو الثقافات الفردية بسبب كميات قليلة من الركازات الثانوية (مثلاً، والنيتروجين، والعناصر النزرة). ولذلك، تحقق من تركيزات الكتلة الحيوية في نهاية الزراعات. ولوحظ في هذه الدراسة، أي آثار مثل هذا النمو.
    1. تعريف البروتوكول زراعة لنظام MBR ("بيوليكتور") على النحو التالي:
    2. فيلتيرسيت 1: الكتلة الحيوية، والحصول على 14. فيلتيرسيت 2: درجة الحموضة، كسب مسبقاً. فيلتيرسيت 3: pO2، كسب مسبقاً. 4: التجارة والنقل، الحصول على 80.
    3. هز التردد: 1,200 لفة في الدقيقة.
    4. درجة الحرارة: 30 درجة مئوية.
    5. دورة الوقت: 15 دقيقة.
    6. التجربة المرة: دليل (زراعة لم يتم إيقاف تلقائياً).
  • جيل قائمة الحل الأسهم المتوسطة بيبيتينج
    ملاحظة: تقريبا أي سائل معالجة نظام روبوت قادر على قراءة الإجراءات بيبيتينج من ملفات خارجية. أساسا، هو الحد الأدنى المعلومات اللازمة نقل حجم وموضع المصدر الكاشف، فضلا عن الوجهة لكل ممثلة بموقف المختبرات الطبية من على سطح السفينة الروبوتية وتجويف محددة داخل المختبرات الطبية. ومع ذلك، يجب النظر في جمل مختلفة للسائل مختلف نظم معالجة. ويبين الشكل 2 بنية ملف مثال لنظام بيبيتينج العاملين في هذه الدراسة.
    1. أربعة أنواع من الحلول الأسهم هي بيبيتيد في كل زراعة جيدا:
      1. الأسهم حلول عناصر الوسائط التي متنوعة ("تباين الأرصدة السمكية").
      2. المياه للتعويض عن مختلف أحجام التراكمي أعلاه الأرصدة.
      3. حل أسهم ("بقية الأسهم") التي تحتوي على كافة المكونات التي تم إصلاحها. يمكن أن يتألف هذا الحل الأرصدة من المخزونات التي تحتوي على مختلف العناصر التي تكون، مثلاً، يتم تخزينها في درجات حرارة مختلفة أو تعقيمها بطرق مختلفة.
      4. العدوى، التي ينبغي أن تضاف كمكون آخر ووضعت على worktable فقط من قبل، بالإضافة إلى تجنب تسوية للخلايا.
    2. كل زراعة جيدا، حساب الكميات ستنقل لجميع مكونات وسائل الإعلام وفقا ل:
      Equation 1
      وحدة التخزين المراد إضافتها لبعض الأرصدة التباين ربما الصفر، أيعندما تم حذف هذا العنصر المحدد.
    3. مراجعة كافة أحجام المحسوبة الخامسأنا لإعداد مناسبة. لا ينبغي أن بيبيتينج حجم الزيادات في حجم خطوات صغيرة جداً. إذا لزم الأمر، قم بضبط تركيزات تباين الأرصدة. على سبيل المثال، كان يعرف حجم بيبيتينج الحد الأدنى هنا 10 ميليلتر، والزيادة في الحد الأدنى وعرف أنه 5 ميليلتر. وبصفة عامة، ينبغي تعريف وحدات التخزين هذه استناداً إلى دقة تصميماً تجريبيا ودقة للسائل المستخدمة التعامل مع محطة15،44.
    4. حساب حجم بقية الأسهم التي تحتوي على مكونات ثابتة لجميع الآبار كما يلي:
      Equation 2
      حيث حجم المخزون التباين التراكمي الحد الأقصى Equation 3 المستخدمة. ونتيجة لذلك، حساب تركيزات المكونات الثابتة في بقية الأسهم المطلوبة على النحو التالي:
      Equation 4
      إعداد بقية الأسهم تبعاً لذلك.
    5. كل زراعة جيدا، حساب حجم المياه التي ستضاف على النحو التالي:
      Equation 5
    6. كل زراعة جيدا، قائمة بكافة وحدات التخزين لإضافتها في الترتيب التالي لإضافة: الخامسH2O, Vريستستوك, Vأنا، الخامسإينوك. تنسيق قائمة بيبيتينج وفقا للمواصفات السائل التعامل مع محطة، كما يتضح على سبيل مثال في الشكل 2.
  • الثقافة البذور، وإعداد وسائل الإعلام الآلي وبدء الثقافة الرئيسية
    1. إنشاء بروتوكول للتعامل مع السائل الروبوت. انظر رقم 3 و رقم 4 لبروتوكول مثال لنظام "يانوس"، نفذت في برنامج "وينبريب" المقابلة. البروتوكول ينبغي النظر في الجوانب التالية:
      1. وتشمل وقت كاف الإسكان العقيمة قبل إعداد وسائل الإعلام.
      2. وتشمل الأولى التنظيف المفرط والغسيل لجميع النصائح بيبيتينج وأنابيب.
      3. اختر حاويات المختبرات الطبية المناسبة لحلول الأسهم. هنا، لوحات عميقة جيدا مع الأعمدة 12 مناسبة لتخزين مخزونات الاختلاف، كما يمكن أن تراجع كل ثمانية نصائح بيبيتينج في ترتيب مواز في أعمدة جيدا. وهذا يسرع إلى حد كبير إعداد وسائل الإعلام. إذا أنابيب كاشف 15 مل أو 50 مل تستخدم كمستودعات، أن تراجع نصيحة بيبيتينج واحدة فقط في ذلك مرة واحدة.
  • للأرصدة الأخرى مثل المياه و بقية الأسهم، تستخدم أحواض 100 مل، كما تتطلب هذه الحلول الأسهم كميات أعلى في المجموع.
  • توفير حجم مجموع كاف لكل حل الأسهم للتعويض عن كميات النفايات وارتفاع بيبيتينج الإزاحة، إلخ
  • قم بإدراج مطالبة مستخدم قبل الخطوة التطعيم، ضمان أن تتم هذه الخطوة قبل الإجراء الثقافة البذور مباشرة.
  • إعداد جميع الحلول المخزون بطريقة عقيمة وتخزين حتى الاستخدام، في حاويات مناسبة، مثلاً، والعقيمة 15 مل وأنابيب الاختبار 50 مل.
  • تعقيم لوحات عميقة جيدا لتخزين حل الأسهم في worktable، مثلاً، بمسح مع الإيثانول 70 في المائة وتجفيف اللاحقة في غطاء الاندفاق الصفحي.
  • ابدأ ثقافة البذور بتطعيم 50 مل بهي المتوسطة المحتوية على كاناميسين 25 مغ/لتر مع قاسمة واحدة من WCB. قبل زراعة MBR، تعد العدوى الطازجة وحيوية من تزايد أضعافاً مضاعفة البذور الثقافات في كمية كافية.
  • ضع جميع المختبرات الطبية اللازمة على worktable الروبوتية ومن أجل حلول الأسهم في المختبرات الطبية المقابلة.
  • بدء سير العمل الروبوتية لإعداد وسائل الإعلام، حتى أن الخطوة الأخيرة (التطعيم)، هو الذي تم التوصل إليه في الوقت المناسب مع بدء الثقافة البذور. مجموع وقت التشغيل لسير العمل الروبوتية يحتاج إلى تقييم سابقا. هنا، كان وقت التشغيل الإجمالي حوالي 1.5 ح.
  • تذوق ثقافة البذور بعد حوالي 2 حاء، ثم كل ساعة، لرصد النمو حسب الكثافة البصرية (OD600). بعد حوالي 5 ساعات، تصل إلى 3-4 OD600 الثقافة ويستخدم لتطعيم الثقافات الرئيسية.
  • وضع ثقافة البذور على worktable معالج السائل والاستمرار في بروتوكول إعداد وسائل الإعلام. ختم زراعة الخطة المتوسطة الأجل بعد التطعيم.
  • مكان زراعة مختومة الخطة المتوسطة الأجل في الجهاز بيوليكتور وبدء تشغيل البروتوكول زراعة المعرفة مسبقاً.
  • التصرف حلول الأسهم المتبقية، وفقا للوائح السلامة البيولوجية إذا لزم الأمر، وبذور الثقافة من worktable الروبوتية. تنظيف معدات المختبرات يمكن إعادة استخدامها وبدء تشغيل معالج السائل البروتوكول إزالة التلوث.
  • المنتج الكمي وتجهيزها للبيانات الخام للتحليل
    1. أن نوقف ثقافة الرئيسية بعد وقت تشغيل ح 17.
    2. نقل بيانات القياس من MBR بيوليكتور الجهاز إلى الكمبيوتر متصل باستخدام حزمة البرامج بيوليكشن وفقا لدليل المستخدم الخاص بالشركة المصنعة.
    3. استخدام "إدارة البيانات ← تحويل البيانات" وظيفة حزمة برامج "بيوليكشن" الذي يصاحب نظام MBR لتحويل ملف البيانات الخام إلى تنسيق جدول بيانات سهولة وصول. نسخ البيانات إشارة بروتينات فلورية خضراء لكل زراعة الآبار من العمود الطابع الزمني الأقرب إلى حاء 17 تحديد الإشارات التجارة والنقل من الآبار زراعة المرجعية والمتوسط. تطبيع جميع الإشارات بروتينات فلورية خضراء المتبقية بإشارة مرجعية متوسط.
    4. قياس عيار بروتينات فلورية خضراء باستخدام أساليب إضافية (إذا لزم الأمر)
      1. نقل تعليق خلية من كل زراعة الآبار في أنابيب رد فعل بريلابيليد والحصول على الخلية الحرة المادة طافية بعد الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة بأقصى سرعة باستخدام الطرد مركزي benchtop.
      2. نقل 200 ميليلتر من كل المادة طافية الخلية الحرة في الخطة المتوسطة الأجل 96-بئر سوداء مع أسفل شفافة، وقراءة الأسفار خاصة التجارة والنقل في 488/520 نانومتر باستخدام قارئ ميكروسكوبية مناسبة. تطبيع التجارة والنقل إشارة من جميع الآبار مع إشارة متوسط من الزراعات المرجعية، كما هو الحال في الخطوة 1.5.3.
        ملاحظة: لا يمكن مقارنة الإشارات fluorescence بروتينات فلورية خضراء المطلقة لأجهزة قياس مختلفة. ولذلك، السلالات المرجعية 5 من جميع الزراعات الرئيسية بمثابة معيار داخلي. ويمكن التعبير عن تحسين عيار التجارة والنقل فيما يتعلق بمعيار داخلي. وهذا يسمح لمقارنة نتائج من تجارب مختلفة وأساليب القياس الكمي بروتينات فلورية خضراء مختلفة (انظر الخطوات التالية اثنين).
      3. تحديد محتوى البروتين supernatants الخلية خالية مع البروتوكولات القياسية، مثلاً، مقايسة برادفورد أو اتفاق التعاون الأساسي. في تركيبة مع النتائج من الخطوة 2، من الممكن تحديد عيار بروتينات فلورية خضراء محددة البروتين.
        ملاحظة: بعد قياس الأسفار، واستخدام العينة مباشرة من هذا الميكروسكوبية. استخدام الماصات متعدد القنوات يسهل إلى حد كبير السائل اللازمة التعامل مع الخطوات.
      4. القيام تصور الحزب الديمقراطي الصربي صفحة خالية من الخلية supernatants عقب البروتوكولات القياسية للتحقق من أن معظم محتوى البروتين زيادة بسبب زيادة إفراز بروتينات فلورية خضراء.
        ملاحظة: الحزب الديمقراطي الصربي صفحة أكثر شاقة من الأساليب المذكورة آنفا، لا سيما مع تحميل عينة عالية. لأغراض التحقق، أنها غالباً ما يكفي لتشغيل صفحات الحزب الديمقراطي الصربي من supernatants الخلية خالية من مرجع المتوسطة والنهائية الأمثل الزراعات المتوسطة15.
  • 2-حساسية التحليل (الشكل 1: الجزء ب).

    ملاحظة: الهدف من هذا الجزء هو تحديد العوامل الهامة التي لها تأثير كبير على الهدف.

    1. اختر مجموعة تركيز أولى من عناصر الوسائط. تكوين مرجع المتوسط ينبغي أن تقع داخل نطاقات التركيز الذي تم اختياره.
    2. اختر وزارة الطاقة مناسبة. يمكن الاطلاع على هذه التصاميم في الأدب، مثلاً، من نيست/SEMATECH الإلكترونية-كتيب "الأساليب الإحصائية" (متوفرة في www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm). التصميم المختار يعتمد على عدد من مكونات وسائط الإعلام للفائدة (هنا، 11) وعدد التجارب المنجزة (هنا، 32). في المثال المعطى، تم اختيار تصميم "2الرابع11-6" أن النتائج في التجارب 32 ويسمح لتقدير تأثير على زيادة تركيز أحد المكونات الإحدى عشرة بشأن هدف الفائدة. أن تكون أكثر تحديداً، لا هي خلطت بين الآثار الرئيسية مع عامل لبير التفاعلات. يمكن أن تكون مرتبك مع أعلى ترتيب التفاعلات التي هي، مع ذلك، يرجح إلا كبيرة.
    3. استخدام الآبار المتبقية (هنا، 16) لأداء replicates متعددة مع المتوسط الإشارة إلى تقييم إمكانية تكرار نتائج عملية. وينبغي نشر replicates على قدم المساواة على لوحة لاكتشاف الآثار الموضعية. يتم استخدام القيمة يعني الناتج يقاس من التجارب المرجعية للتطبيع. فكل الناتج يقاس من تحليل الحساسية هو مقسوماً على متوسط قيمة الناتج إشارة.
    4. حساب الرئيسي، وإذا أمكن استخدام تأثيرات اندماجي البرامج الإحصائية المناسبة. يستند التصميم الكلاسيكي للتجربة على تقريب متعدد الحدود45. على سبيل المثال، يمكن استخدام مفريجريس دالة MATLAB لتقدير معاملات متعدد الحدود.
    الدالة مفريجريس جزء من الإحصاءات وآله التعلم مربع الأدوات.
  • تحديد آثار مختلف وسائل الإعلام المكونات ذات الصلة على الهدف باستخدام اختبار t. في المثال، NH4+ له أثر سلبي كبير، ومن Ca2 + و Mg2 + وتظهر الآثار الإيجابية أقوى (الشكل 5). لأنه تم تطبيع التجارة والنقل إشارة، المعاملات تمثل متوسط التغير النسبي في التجارة والنقل إشارة عند زيادة تركيز عنصر معين من قيمته مركز، Equation 7 ، إلى قيمة الحد الأقصى.
  • مكونات ثابتة دون تأثير صلة بقيمتها المرجعية أثناء التحسين.
  • 3-تكرارية الأمثل (الشكل 1: الجزء جيم)

    ملاحظة: الأداة MATLAB كركيت استخدمت لتفسير و تحليل البيانات الإحصائية36. كركيت يسمح للمستخدم ببناء نموذج كريجينج المبنية على البيانات. هذا نموذج كريجينج تتوقع العلاقة الوظيفية بين مكونات وسائط الإعلام والهدف. أنه يقدم أيضا معلومات عن التنبؤ بحالة عدم اليقين. عالية من عدم اليقين تشير إلى بيانات صاخبة و/أو كثافة البيانات غير كافية.

    1. الكيان التشغيلي المعين
      ملاحظة: تجارب جديدة تكراري مصممة، استناداً إلى نتائج التشغيل السابقة.
      1. في التكرار الأول، تصميم التجارب الجديدة لتحقيق مفصل من عناصر الوسائط التي تم تحديدها للفائدة. النتائج التجريبية من الباب 2 لا يمكن نقلها إلى التحسين متكررة (الجزء 3)، كما أن تركيزات المكونات دون تأثير ذات الصلة يتم إصلاحها الآن إلى القيمة المرجعية الخاصة بكل منها. ونتيجة لذلك، تجارب من تحليل الحساسية والتحسين متكررة ليست قابلة للمقارنة.
      2. وبخلاف ذلك، اتبع النظام هو مبين في الشكل 1، الإطار "التحسين متكررة". إذا كانت إمكانات الأمثل يكمن داخل نطاق التركيز المحدد، تم تصميم تجارب جديدة باستخدام40،التحسن المتوقع46. تم دمج تصميم تجريبي يستند إلى التحسن المتوقع في الأدوات كركيت. إذا الأمثل يكمن في الحدود، قم بتوسيع نطاق التركيز.
    2. القيام بتجارب في نقطة العينة المصممة وفقا للأساليب التجريبية المحددة في الفرع 2.
    3. التحليل الإحصائي
      1. بناء نموذج كريجينج باستخدام البيانات المجمعة من كافة التكرارات، بما في ذلك الحالية.
      2. التحقيق الإخراج النموذجي حسب التصور باستخدام أدوات شاملة كريكيت (2/3D الاستيفاء، وتحليل الفيلم، فحص الأرض، إلخ).
    4. إذا قدرت مساحتها أمثل بدقة كافية، وقف التحسين. إذا لم يكن الأمر كذلك، تابع مع الخطوة 3.1.
      ملاحظة: يبين الشكل 6 التحسين متكررة لدراسة اختبار. وتم توسيع نطاق التركيز تباعا حتى تم العثور على هضبة (التكرار 1-6). واستخدمت في التكرار السابع لاستكشاف حدود بمزيد من التفصيل.

    4-تحقق نتائج (الشكل 1: الجزء دال)

    ملاحظة: بعد الانتهاء من التحسين متكررة، تحتاج الافتراضات الأولية التحقق من صحة.

    1. إعادة تحليل الحساسية (الفرع 2) لتكوين متوسطة الحجم الأمثل. فهي ثابتة تركيزات المكونات التي يتم التحقيق فيها في الشكل 1 (الجزء جيم) إلى القيم المثلى. وتتنوع تركيزات المكونات الأخرى وفقا وزارة الطاقة مناسبة.
      ملاحظة: تشير نتائج مماثلة في كل العروض إلى أن مستويات تركيز عناصر التحقيق لا تغير من تأثير المكونات الأخرى. إذا كان الفرز تظهر اختلافات كبيرة في النتائج من الجزء باء، ينبغي إضافة المكونات مع تأثير تغير إلى تجمع عناصر التحقيق ويجب تكرار الجزء جيم.
    2. وفي حالة القياس غير المباشر (مثلاً، الأسفار كمؤشر لتركيز المنتج)، تطبيق نهج القياس متعامد (مثلاً، نشاط الإنزيم، برادفورد أو اتفاق التعاون الأساسي البروتين الكمي، الحزب الديمقراطي الصربي صفحة) لتأكيد التغيير في وهدف الاهتمام بمقارنة النتائج من المتوسط المرجع و متوسطة الحجم الأمثل15.

    Representative Results

    وكان تطبيق البروتوكول أدخلت إلى أقصى حد من عيار يفرز التجارة والنقل. على وجه التحديد، عيار بروتينات فلورية خضراء بعد ح 17 من زراعة وتم اختيار الهدف الأمثل. يسمح اكتشاف الأسفار أون لاين للتجارة والنقل الكمي المنتج بسيط. غير تطبيع إشارة بروتينات فلورية خضراء مع البيانات المستمدة زراعة مرجع لا غنى عنه لضمان إمكانية تكرار نتائج ومقارنة النتائج. وأجرى اختيار المسبق لمكونات وسائط الإعلام على أساس رشيد كما هو موضح في المقطع 1. وأجريت التجارب التالية بناء على تعليمات من القسم 1: تم تعريف معلمات إجراءات مختبر الرطب لضمان الاتساق وإمكانية تكرار نتائج نتائج الدراسة كله.

    كما هو موضح في القسم 2، أنجز فحص أولى لتحديد العناصر ذات الصلة تبين أثر كبير على الهدف الأمثل لدراسة أكثر تفصيلاً، والمزيد. ويسمح نظام MBR على أساس الخطة المتوسطة الأجل تجارب 48 المراد تنفيذها بالتوازي. مع مراعاة أقصى حد عدد ممكن من تجارب موازية في الخطة المتوسطة الأجل واحد (48) والعدد الكلي لمكونات وسائط الإعلام (11) يجعل 2رابعاتصميم11-6 كسور خياراً ملائماً. تضم 32 تجارب هذا التصميم التجريبي ويسمح لتقدير الأثر الرئيسي لكل عنصر من عناصر التحقيق في وسائل الإعلام. استخدمت الآبار زراعة المتبقية (16) replicates العديد من التجارب مع المتوسط المرجع لتقييم إمكانية تكرار نتائج وآثار الموضعية. فهو إجراء كل تجربة مرة واحدة (لا replicates)، باستثناء التجربة الإشارة (خمسة replicates).

    ويلخص الجدول 1 نتائج التحليل الفحص. في نطاق تركيز النظر، لم تظهر متفاوتة غالبية مكونات الإعلام له تأثير ملحوظ على الهدف. يظهر العنصر NH4+ له تأثير سلبي قوي، بينما Ca2 + و Mg2 + إظهار الاتجاه الإيجابي أقوى. أثر Mg2 + ليست هامة بالنسبة لنطاق التركيز الحالي ولكن قد يكون لمجموعة أوسع نطاقا من تركيز. ونتيجة لذلك، تقرر حذف NH4+ من الوسط والتحقيق في تأثير Ca2 + و Mg2 + في المزيد من التجارب.

    3 قسم يصف الإجراء الأمثل التكرارية المستخدمة لتعظيم إشارة fluorescence بروتينات فلورية خضراء بينما تتراوح تركيزات Ca2 + و Mg2 +. في التكرار 1، تم اختبار الفرضية القائلة بأنه يمكن إهماله NH4+ . واعتمد من تحليل فحص نطاق تركيز Ca2 + و Mg2 + . تم تعيين تركيز الحد الأدنى من NH4+ إلى صفر واعتمد تركيز بحد أقصى من تجربة الفحص. وفي التجارب التالية، وزعت تركيزات العنصر أكثر 3 × 3 × 3 الشبكة داخل نطاق تركيز محدد، أسفر عن تجارب 27. أدرجت خلال جميع الزراعات، replicates خمسة من المتوسط المرجع، الذي خدم كمعيار الداخلية وضمان حدوث أية تأثيرات الموضعية خلال الخطة المتوسطة الأجل. للآبار 16 المتبقية، وتركيزات NH4+و Ca2 +و Mg2 + وزعت عشوائياً داخل نطاقات معينة.

    الشكل 5 أ يتصور نتائج التكرارات الأولى. تسميات المحور تشير إلى تركيزات المكونات المستخدمة في المتوسط المرجع الأصلي، المشار إليه بواسطة x Ref. وتمثل الأسطح الزرقاء الاستنتاج كريجينج التي تم حسابها باستخدام البرمجيات كريكيت. كل سطح مقترن مع مستوى تركيز نسبي ل NH4+ (أزرق داكن: 0 x Ref، متقلب: 1 x Ref، أزرق فاتح: 2 x Ref). ويكشف هذا التمثيل المرئي أنها مواتية لحذف NH4+. الأسطح الاستيفاء كما تظهر الآثار الإيجابية لكل ملغ2 + و Ca2 +، كجميع الطائرات الارتفاع مع تزايد تركيزات.

    وبناء على نتائج التكرار 1، تقرر توسيع تركيز مجموعة من Ca2 + و Mg2 + بمضاعفة التركيزات القصوى ويتحول نافذة التصميم التجريبي إلى الركن الأيمن العلوي، انظر الشكل 5 ب. داخل هذا النطاق، والتركيزات التي وزعت على شبكة 6 × 6. وهذا ما يضمن توزيعاً حتى على نطاق التركيز الكامل، مما يؤدي إلى نتائج الاستيفاء كريجينج مثلى. الشكل 5 تقاس ب يظهر المؤامرة الاستيفاء كريجينج استناداً إلى البيانات المجمعة في كل التكرارات (نقاط حمراء والمربعات الصفراء). على حد سواء، Ca2 + و Mg2 +، لا يزال الأثر الإيجابي لتلك التركيزات المتزايدة. ونتيجة لذلك، وكرر الإجراء مضاعفة التركيز الأقصى وهكذا، تم نقل إطار التصميم التجريبي لاستكشاف حدود الزاوية العلوية اليمنى.

    الرقم 6 أ يعطي لمحة عامة عن الإجراء الأمثل المتبقية. وكشف تحليل مجموعة البيانات التي تم جمعها حتى التكرار 3 عرف بحد من الأثر الإيجابي ل Mg2 +، أي، تركيز أمثل مجموعة Mg2 + . ولذلك تقرر توسيع نطاق التركيز فقط على Ca2 + (التكرار 4). تم تكرار هذا الإجراء مرتين (التكرار 5 و 6) حتى عثر على تشبع من إشارة التجارة والنقل. ويفسر هذا التشبع ترسيب أملاح Ca لتركيزات التطبيقية من Ca2 +، التي لا تتوفر على الخلايا.

    كما هي دائماً قلق النتائج التجريبية بالضوضاء، يظهر الاستيفاء كريجينج الناتجة عن عدم انتظام والفحص البصري يمكن أن تؤدي إلى استنتاجات خاطئة. ومع ذلك، يمكن تحديد نطاق التركيز الأمثل لمكونات وسائط الإعلام للإشارة بروتينات فلورية خضراء مشبعة موثوق بها مع إحصائية z-الاختبار، الذي ينفذ أيضا في كركيت. الاختبار z-يستخدم مباشرة المعلومات الإحصائية الجوهرية التي قدمها كريجينج الأسلوب، و أي، والتنبؤ بالقيم وأوجه عدم اليقين في التنبؤ. الرقم 6 ب يبين الهضبة التي تم تحديدها، العزم وتصور باستخدام مربع الأدوات كركيت.الأدوات كركيت متاحة بحرية36 ويأتي مع برنامج تعليمي تفصيلية التي توضح هذه المقالة كيفية استخدام ميزات الخاصة به.

    إذا تم العثور على اثنين أو أكثر من المكونات ذات الصلة، 3D التصور تصل إلى الحد الأقصى. كركيت يوفر عدة طرق التمثيل المرئي الممكنة الأخرى مثل الأفلام أو "فحص الأرض". إذا كانت إمكانات الأمثل يكمن داخل نطاق التركيز المحدد، صممت تجارب جديدة تلقائياً في استخدام ال40،التحسن المتوقع46. تم دمج تصميم تجريبي يستند إلى التحسن المتوقع في الأدوات كريكيت. يمكن الاطلاع على معلومات أكثر تفصيلاً في وثائق البرنامج.

    بعد هذا الإجراء تكرارية، أجريت لتحقق من النتائج، كما هو موضح في الجزء دال تم التحقق من صحة الافتراضات الأولية عن طريق إجراء تحليل حساسية إضافية باستخدام تكوين متوسطة الحجم الأمثل. فقد تباينت جميع عناصر الوسائط الأولية لمصلحة، ولكن Ca2 + و Mg2 + تم تعيين إلى مستويات التركيز الأمثل. في هذه الدراسة، التركيزات المثلى Equation 8 = 32 × Ref و Equation 9 = x 6.8 اختيرت Ref. ويبين الجدول 2 نتائج فحص التحقق من الصحة. مشابهة لحساسية الأولى فحص (انظر الجدول 1)، NH4+ لا يزال لديه تأثير سلبي كبير وآثارها المتبقية لا تزال ضئيلة.

    نظراً لسهولة الوصول، استخدمت إشارة fluorescence بروتينات فلورية خضراء من وقف زراعة لقياس عيار بروتينات فلورية خضراء خارج الخلية خلال جميع التجارب. لأسباب تتعلق بالتحقق، التحقق من صحة الأسفار بروتينات فلورية خضراء ضد قياسات أخرى. لأن يفرز التجارة والنقل عبر تأت-المسار، لا تميز إشارة الأسفار بين داخل وخارج الخلية بروتينات فلورية خضراء. وهكذا، استنسخت الزراعات استخدام المتوسط المرجع والوسيلة الأمثل. بالإضافة إلى قياس الأسفار من supernatants زراعة الخلية الحرة، كان كمياً المحتوى البروتيني المقايسة برادفورد و (شبه)-التحسين النوعي في التجارة والنقل تصور بالحزب الديمقراطي الصربي-الصفحة15. قياس الناتج جميع إشارات قد تضاعف تقريبا للزراعات مع المتوسطة الأمثل مقارنة بمتوسط مرجع والتحقق من صحتها حوالي 100% تحسين الأداء إفراز الوسيلة الأمثل. ونتيجة لذلك، يمكن اعتبار الأسفار بروتينات فلورية خضراء محددة لوقف زراعة مقياس مناسب للهدف الأمثل، أيعيار بروتينات فلورية خضراء خارج الخلية.

    Figure 2
    الشكل 2 : الصورة من قائمة حجم بيبيتينج لتحليل الحساسية- الإدخالات الموجودة في العمود الأول بتعيين معرف فريد لكافة وحدات التخزين من صف؛ هذا المعرف هو رقم جيد لزراعة هدف الخطة المتوسطة الأجل على worktable معالج السائل، انظر الشكل 4جالخطة المتوسطة الأجل. ترميز الأعمدة المتبقية وحدات التخزين لحلول مختلفة ("Sln-01" إلى "Sln-15") إلى أن بيبيتيد. الحجم التراكمي لصف واحد يطابق حجم زراعة النهائي المقابلة جيدا. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 3
    الشكل 3 : الصورة من السائل التعامل مع برنامج حاسوبي لمراقبة "وينبريب"- اليسار: صف أمرت الأوامر، بما في ذلك أمر نقل لكل حل الأسهم يكون بيبيتيد. يتم إدراج مطالبة مستخدم قبل الأمر النهائي لإضافة العدوى، ضمان وضع ثقافة البذور في الجدول في الوقت المناسب. حق: تخطيطي worktable، بما في ذلك المختبرات الطبية مصدر "تباين الأرصدة" (اللوحات جيدا عمق اثنين مع 12 عمود مثل الآبار)، والحوض كاشف "بقية الأسهم"، والمياه والعدوى، وزراعة الوسائط الهدف إعداد الخطة المتوسطة الأجل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 4
    الشكل 4 : تجميع للقطات تفصيلية للإعداد من بيبيتينج إلى حل الأسهم. (أ) غير ملفوف الأمر بيبيتينج من مخزون الحديد. المختبرات الطبية مصدر ومصدر جيد داخل يتم وضع علامة على worktable قراءة الإطار والعمود أحمر اللوحة جيدا عمق المقابلة. المختبرات الطبية الوجهة والوجهة الآبار داخل تميزت بإطار أزرق حول وآبار الأزرق زراعة المستهدف في الخطة المتوسطة الأجل. (ب) عرض مثال مفصل على الإحالة لوحدات التخزين بيبيتينج لهذه الخطوة (Fe حل الأسهم). تتم قراءة عدد الوجهات من قائمة بيبيتينج، التي لديها صفوف 48. تم العثور على وحدات التخزين dispense لجميع الآبار الوجهة لحل مخزون الحديد في العمود 4 في قائمة بيبيتينج. لاحظ أن العمود الأول في القائمة بيبيتينج يحتوي على معرفات وحدات تخزين لا يمكن تحويلها، انظر الشكل 2. (ج) تفاصيل عن الوجهة الترقيم. وسوف بيبيتيد مجلدات كتب في الصف #1 من القائمة بيبيتينج المقابلة في بئر علامة #1، وهلم جرا. آبار #01, #08, #41 و #48 تناظر الآبار A01، A08، F01 و F08 للترميز الرقمية ألفا، التي يتم طباعتها أيضا إلى زراعة الخطة المتوسطة الأجل نفسه. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 5
    الشكل 5 : بالتفصيل النتائج من التكرار الأول- (أ) الاستيفاء كريجينج استناداً إلى البيانات التجريبية للتكرار 1. تشير النقاط الحمراء إلى مجموعة البيانات. للمقارنة، كل الاستيفاء ثلاثة أسطح overlayed في قطعة واحدة (أزرق داكن: 0 x Ref، متقلب: 1 x Ref، أزرق فاتح: 2 x Ref). يمكن الاطلاع تمثيل بديل للنتائج في أماكن أخرى15. (ب) الاستيفاء كريجينج استناداً إلى التجارب التي أجريت في التكرار 1 (النقاط الحمراء) والتكرار 2 (المربعات الصفراء).أجزاء من البيانات المعروضة في هذا الرقم قد تم نشرها في السابق15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    Figure 6
    الرقم 6 : وصف النتائج الأمثل تكراري المجمعة. كريجينج النهائي (أ) نموذج التنبؤ. (ب) تحديد الإحصائية لمنطقة الأمثل (أحمر) استناداً إلى إحصائية z-اختبار، التي يتم توفيرها من قبل كريكيت. تشير خانات إلى خطوات متتالية لتصميم متكررة وتنفيذ التجارب. أجزاء من البيانات المعروضة في هذا الرقم قد تم نشرها في السابق15. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

    المكون معامل طبيعية يعني القيمة
    Fe2 + -0.08
    Mn2 + -0.05
    Zn2 + -0.21
    Cu2 + -0.21
    NH4+ -2.04
    ني2 + -0.11
    Co2 + -0.10
    مو42- 0.03
    بو33- 0.06
    Ca2 + 1.00
    Mg2 + 0.45

    الجدول 1: نتائج تحليل الحساسية- قيم معامل يمثل تأثير متوسط عند زيادة تركيز وسائط الإعلام الخاصة بكل منها مكون من قيمته مركز إلى قيمة الحد الأقصى. الأمثل والنماذج التجريبية، كما وجدت في الكتابات العادية والمستخدمة هنا، يمثل الانحراف المعياري مباشرة الاختلاف التجريبية بسبب تكرار هذه التجربة المرجعية. تم تطبيع قيم معامل بقيمة maxium (0.0422 للعنصر Ca2 +). الانحراف المعياري معامل طبيعية والمطلق هو 0.54 و 0.0226، على التوالي.

    المكون معامل طبيعية يعني القيمة
    Fe2 + -1.00
    Mn2 + 1.00
    Zn2 + -3.48
    Cu2 + -0.52
    NH4+ -15.95
    ني2 + 0.69
    Co2 + -0.51
    مو42- -0.45
    بو33- -1.11

    الجدول 2: نتائج تحليل حساسية نهائي- قيم معامل يمثل تأثير متوسط عند زيادة تركيز وسائط الإعلام الخاصة بكل منها مكون من قيمته مركز إلى قيمة الحد الأقصى. كما تم استخدام تصميم تجريبي أمثل، الانحراف المعياري يعتمد فقط على الاختلاف تجريبية باستخدام تكوين متوسطة الحجم الأمثل. تباين التجريبية زيادة طفيفة بالمقارنة مع اختلاف استخدام المتوسط المرجع. تم تطبيع قيم معامل بقيمة maxium (0.0106 لعنصر Mn2 +). الانحراف المعياري معامل طبيعية والمطلق هو 3.63 و 0.0385، على التوالي.

    Discussion

    الطبيعة العامة للبروتوكول قدم يسمح أدابتيونس مختلفة، مثلاً، لدراسة أخرى التعبير الميكروبية المضيفين9،47،48،49،، من50 51، أو لتحسين الخصائص الأخرى للبروتين المستهدفة، مثل السندات glycosylation نمط أو الميثيل. البروتوكول قد تحتاج أيضا إلى أن تتكيف مع معدات مختبر المتاحة. إدماج نظام MBR يسمح زيادة الإنتاجية التجريبية، مما يتيح تحقيق وفورات كبيرة في الوقت المناسب. ومع ذلك، عند استبدال المفاعلات الحيوية تماما الآلية ويمكن السيطرة عليها بنظم MBR، قابلية النتائج يجب النظر في8،37،،من5253. استخدام المنهجيات الكيان التشغيلي المعين والنمذجة الرياضية يساعد على زيادة محتوى المعلومات بيانات القياس فيما يتعلق ب هدف درس54 بكفاءة التخطيط التجريبية و تفسير البيانات المستندة إلى نموذج15.

    إدخال تعديلات على طريقة
    بجوار السائل إليه (روبوت) متعدد الأغراض وقابل للتوسيع التعامل مع نظم مثل تلك المستخدمة في هذه الدراسة، تجدر الإشارة إلى أن هناك عدة السائل أصغر التعامل مع النظم المتاحة تجارياً وهي قادرة على القيام بهذه المهمة ويمكن وضعها داخل من الاندفاق الصفحي مناضد العمل. في حالة توفر أي نظام بيبيتينج الآلي، يمكن أيضا تحقيق التراكيب وسائل الإعلام المختلفة وفقا لخطة وزارة الطاقة بيبيتينج اليدوي باستخدام الماصات مفرد أو متعدد القنوات. منذ إعداد دليل أكثر عرضه للخطأ، وسوف تتطلب تركيزاً عاليا من العمل منذ مدة طويلة، يوصي بأن تعد عددا أقل من التراكيب وسائل الإعلام المختلفة.

    اعتماداً على قدرات النظام حصر العاملين، ستختلف البروتوكول زراعة المقابلة. على سبيل المثال، في حالة توفر لا قياس على الإنترنت لتكوين الكتلة الحيوية، قد يكون كافياً لقياس تركيز الكتلة الحيوية بعد انتهاء تجربة النمو. في تركيبة مع مراقبة الإنترنت الأس الهيدروجيني والأكسجين المذاب، والذي يجري تنفيذه في عدد من أنظمة MBR، يمكن تحديد التشبع النمو بأمان. من حيث المبدأ، يمكن إجراء تجارب النمو في الخطط المتوسطة الأجل وحدها وضعت داخل تهز الحاضنات، دون استخدام نظام MBR. وفي هذه الحالة، يكون ظروف زراعة سليمة ضمان: (1) الأكسجين محدودة الزراعات يمكن تجنبها باستخدام الخطط المتوسطة الأجل مع الهندسات مناسبة، بالاقتران مع الهز ترددات السليم وتهز أقطار، مثلاً، ساحة 96 أو 24 العميق تعمل جيدا لوحات 1,000 لفة في الدقيقة في رمي 3 مم أو 250 لفة في الدقيقة في رمي 25 مم، على التوالي. الأهم من ذلك، انخفضت معدلات نقل الأوكسجين القصوى القابلة للتحقيق، وانخفاض مصدر الكربون الرئيسية ينبغي أن تتركز. وكما ذكر أعلاه، لإجراء هذه الدراسة، استخدام الجلوكوز 10 غرام/لتر كان مناسبة لمنع تقييد الأكسجين لظروف زراعة العاملين؛ (2) أخذ عينات ثقافات الخطة المتوسطة الأجل لتقدير الكتلة الحيوية والمنتجات ينبغي تخفيض إلى الحد أدنى. في كل مرة تتم إزالة الخطة المتوسطة الأجل من الحاضنة الهز، نقل الأوكسجين سوف فورا الانهيار الذي قد ينتج عن الظروف غير المواتية زراعة؛ (3) وفي رأي المؤلفين، لا يوصي باستخدام القراء الخطة المتوسطة الأجل كزراعة الأجهزة كما لم توضع هذه الأجهزة لهذا الغرض. على سبيل المثال، ميكانيكا تهز بنيت لخلط عرضية من ميكروبلاتيس بعد إضافة الكاشف وهكذا، كثيرا ما تفتقر إلى متانة للمسافات الطويلة من دائم الهز المستمر لأيام. وعلاوة على ذلك، لا يمكن أن تتحقق مدخلات الطاقة الكافية اللازمة للزراعات الميكروبية في هؤلاء القراء. دمج قراءات الكثافة البصرية باختصار فترات زمنية يتطلب وقف حركة الهز، الناتجة في فترات متكررة للحد من الأكسجين. وعلاوة على ذلك، سوف تشوه التبخر في هذه النظم على مدى فترات طويلة من زراعة النتائج. لمزيد من التفاصيل حول هذا الموضوع المثير للدهشة المعقدة على استخدام الخطط المتوسطة الأجل للزراعات الميكروبية، ويحال القارئ إلى الأدب استشهد22،،من2324،25،26 ومراجع فيها.

    اعتبارات أخرى
    لتسريع خطوات التحسين متكررة، فإنه ينصح أن تختار بعناية الطريقة التحليلية لتحديد حجم المنتج. ينبغي أن تكون طرق سريعة وبسيطة المفضل على حساب الدقة والدقة، استراتيجية تصميم تجريبي تكراري تتسامح مع عدم دقة التجريبية. ومع ذلك، يجب التحقق من النتائج النهائية ضد أساليب القياس الكمي المنتج دقيقة ودقيقة بما فيه الكفاية التي قد تكون أكثر تعقيداً. وبصفة عامة، إجراء تقييم دقيق واتخاذ القرار حول إجراءات الدراسة تتطلب جهدا في بداية الدراسة، ولكن تدفع على المدى الطويل، بعد أن تم إنشاء الأساليب الروتينية.

    فإنه ينصح بشدة لتعريف تجربة مرجع الذي يتم مقارنة لتجارب جميع خلال التحسين. فيتم تطبيع تركيزات المكونات المتوسطة التطبيقية، فضلا عن قياس الناتج عن طريق قسمة قيم مرجعية. وبهذه الطريقة، كل تطبيق والقيمة المقاسة يمكن تفسيره x-إضعاف القيمة المرجعية. أن تأخذ في الاعتبار الاختلافات بين اللوحات، وخمس مرجع التجارب تجري على كل لوحة. يتم استخدام قيمة متوسط نتائج قياس للتطبيع.

    عموما لا يمكن ضمان أن المتوسطة المتقدمة أيضا الأمثل للسلالات الأخرى. بيد المتوسطة تحسين على الأرجح ستكون أيضا مناسبة لزراعة سلالات التعبير مع الاختلافات الوراثية الصغيرة، مثلاً، عند إنتاج إنزيم المتغيرات مع استبدال حمض أميني واحد تم الحصول عليها من الطفرات الدراسات ( على الرغم من أن الطفرات نقطة واحدة حتى قد وصف تأثير الأيض الخلوية وتعبير مغايرة الأداء55،56). وفي هذه الحالة، يمكن أن يكون البروتوكول قدم خطوة أولى، تليها البروتوكولات للتعبير الفائق عروض57. إذا كان يتم استخدام البروتوكول للتنمية المتوسطة مع الارتقاء اللاحقة للزراعات دفعة بنك الاحتياطي الفيدرالي، ينبغي التحقق من الوسيلة الأمثل للظروف البيولوجية المقابلة، استنساخ فحص الحملات في عبارة تحديد أعلى مختلفة فناني الأداء لمختلف استراتيجيات التغذية والزراعة وسائل الإعلام52،58. وعلاوة على ذلك، تساهم كريكيت أدخلت36 يمكن عموما البيولوجية كلي تحسين أمثلية.إلا في الآونة الأخيرة، تم تمديد قدرات أداة لدعم أيضا40من الأمثل متعدد الأهداف، التي يمكن أن تكون هامة للاستفادة المثلى من كل عمليات المنبع والمصب59،60.

    Disclosures

    الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

    Acknowledgments

    الأنشطة العلمية لمركز علوم الاقتصاد الأحيائي تم دعم مالي من وزارة الابتكار والعلوم والأبحاث في إطار BioSC NRW-ستراتيجيبروجيكت (رقم 313/323-400-002 13). يشكر المؤلفون وزارة الابتكار والعلم، والبحوث لشمال الراين-وستفاليا ومنطقة هاينريش هاينه جامعة دوسلدورف للحصول على منحة فريير لارس داخل الكتلة CLIB-خريج "التكنولوجيا الحيوية الصناعية". ووردت المزيد من التمويل من البرنامج ممنوع التمكينية "هلمهولتز ابتكار مختبرات" الألماني هلمهولتز الرابطة لدعم "الجرثومية البيولوجية مختبر – A هلمهولتز الابتكار المعمل".

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioLector m2p-labs G-BL-100
    Flowerplate m2p-labs MTP-48-BOH For cultivation in the BioLector device
    Sealing foil m2p-labs F-GP-10 Sterile sealing for Flowerplate
    MATLAB Mathworks 2016b
    KriKit Forschungszentrum Jülich n/a Freely available, MATLAB installation required
    Janus pipetting robot Perkin Elmer n/a Includes "WinPrep" software installation
    12-column deep well microplate E&K Scientific EK-2034 Container for medium stock solutions
    96 well microplates, transparent, F-bottom Greiner 655101 For Bradford protein assay
    µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom Greiner 655087 For flourescence measurement in cell-free supernatants
    Pipette Research plus multi-channel pipettes Eppendorf n/a Facilitates manual liquid handling with microplates
    TruPAG Precast Gels Sigma PCG2002 For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
    Bradford Reagent Sigma B6916
    C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP n/a n/a Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

    DOWNLOAD MATERIALS LIST

    References

    1. Choi, J. -M., Han, S. -S., Kim, H. -S. Industrial applications of enzyme biocatalysis: Current status and future aspects. Biotechnol Adv. 33, (7), 1443-1454 (2015).
    2. Li, S., Yang, X., Yang, S., Zhu, M., Wang, X. Technology Prospecting on Enzymes: Application, Marketing and Engineering. Comput Struct Biotechnol J. 2, (3), (2012).
    3. Adrio, J. L., Demain, A. L. Microbial enzymes: tools for biotechnological processes. Biomolecules. 4, (1), 117-139 (2014).
    4. Yim, S. S., An, S. J., Kang, M., Lee, J., Jeong, K. J. Isolation of fully synthetic promoters for high-level gene expression in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 110, (11), 2959-2969 (2013).
    5. Hemmerich, J., et al. Use of a Sec signal peptide library from Bacillus subtilis.for the optimization of cutinase secretion in Corynebacterium glutamicum. Microb Cell Fact. 15, (1), 208 (2016).
    6. Wendisch, V. F. Microbial production of amino acids and derived chemicals: synthetic biology approaches to strain development. Curr Opin Biotechnol. 30, 51-58 (2014).
    7. Lee, J. -Y., Na, Y. -A., Kim, E., Lee, H. -S., Kim, P. The Actinobacterium Corynebacterium glutamicum, an Industrial Workhorse. J Microbiol Biotechnol. 26, (5), 807-822 (2016).
    8. Rohe, P., Venkanna, D., Kleine, B., Freudl, R., Oldiges, M. An automated workflow for enhancing microbial bioprocess optimization on a novel microbioreactor platform. Microb Cell Fact. 11, (1), 144 (2012).
    9. Liu, X., et al. Expression of recombinant protein using Corynebacterium glutamicum.: progress, challenges and applications. Crit Rev Biotechnol. 36, (4), 652-664 (2016).
    10. Freudl, R. Corynebacterium glutamicum as a Platform Organism for the Secretory Production of Heterologous Proteins. Corynebacterium glutamicum: From systems biology to biotechnological applications. Burkovski, A. Caister Academic Press. Norfolk, UK. 161-177 (2015).
    11. Yim, S. S., et al. Development of a new platform for secretory production of recombinant proteins in Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Bioeng. 113, (1), 163-172 (2015).
    12. Limberg, M. H., et al. Metabolic profile of 1,5-diaminopentane producing Corynebacterium glutamicum under scale-down conditions: Blueprint for robustness to bioreactor inhomogeneities. Biotechnol Bioeng. 114, (3), 560-575 (2016).
    13. Käβ, F. Assessment of robustness against dissolved oxygen/substrate oscillations for C. glutamicum DM1933 in two-compartment bioreactor. Bioprocess Biosyst Eng. 37, (6), 1151-1162 (2014).
    14. Teramoto, H., Watanabe, K., Suzuki, N., Inui, M., Yukawa, H. High yield secretion of heterologous proteins in Corynebacterium glutamicum.using its own Tat-type signal sequence. Appl Microbiol Biotechnol. 91, (3), 677-687 (2011).
    15. Freier, L., Hemmerich, J., Schöler, K., Wiechert, W., Oldiges, M., von Lieres, E. Framework for Kriging-based iterative experimental analysis and design: Optimization of secretory protein production in Corynebacterium glutamicum. Eng Life Sci. 16, (6), 538-549 (2016).
    16. Huber, R., Roth, S., Rahmen, N., Büchs, J. Utilizing high-throughput experimentation to enhance specific productivity of an E. coli. T7 expression system by phosphate limitation. BMC Biotechnol. 11, (1), 22 (2011).
    17. Kottmeier, K., Müller, C., Huber, R., Büchs, J. Increased product formation induced by a directed secondary substrate limitation in a batch Hansenula polymorpha culture. Appl Microbiol Biotechnol. 86, (1), 93-101 (2010).
    18. Kennedy, M. J., Krouse, D. Strategies for improving fermentation medium performance: A review. J Ind Microbiol Biotechnol. 23, (6), 456-475 (1999).
    19. Kleman, G. L., Strohl, W. R. Developments in high cell density and high productivity microbial fermentation. Curr Opin Biotechnol. 5, (2), 180-186 (1994).
    20. Jones, R., Gadd, G. Ionic nutrition of yeast: Physiological mechanisms involved and implications for biotechnology. Enzy Microb Technol. 12, (6), 402-418 (1990).
    21. Zhang, J., Greasham, R. Chemically defined media for commercial fermentations. Appl Microbiol Biotechnol. 51, (4), 407-421 (1999).
    22. Kensy, F., et al. Oxygen transfer phenomena in 48-well microtiter plates: Determination by optical monitoring of sulfite oxidation and verification by real-time measurement during microbial growth. Biotechnol Bioeng. 89, (6), 698-708 (2005).
    23. Hermann, R., Lehmann, M., Büchs, J. Characterization of gas-liquid mass transfer phenomena in microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 81, (2), 178-186 (2002).
    24. Duetz, W. A. Microtiter plates as mini-bioreactors: Miniaturization of fermentation methods. Trends Microbiol. 15, (10), 469-475 (2007).
    25. Funke, M., Diederichs, S., Kensy, F., Müller, C., Büchs, J. The baffled microtiter plate: Increased oxygen transfer and improved online monitoring in small scale fermentations. Biotechnol Bioeng. 103, (6), 1118-1128 (2009).
    26. Lattermann, C., Funke, M., Hansen, S., Diederichs, S., Büchs, J. Cross-section perimeter is a suitable parameter to describe the effects of different baffle geometries in shaken microtiter plates. J Biol Eng. 8, 18 (2014).
    27. Samorski, M., Müller-Newen, G., Büchs, J. Quasi-continuous combined scattered light and fluorescence measurements: A novel measurement technique for shaken microtiter plates. Biotechnol Bioeng. 92, (1), 61-68 (2005).
    28. Kensy, F., Zang, E., Faulhammer, C., Tan, R. -K., Büchs, J. Validation of a high-throughput fermentation system based on online monitoring of biomass and fluorescence in continuously shaken microtiter plates. Microb Cell Fact. 8, (1), 31 (2009).
    29. Puskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. Development, parallelization, and automation of a gas-inducing milliliter-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng. 89, (5), 512-523 (2005).
    30. Bareither, R., Pollard, D. A review of advanced small-scale parallel bioreactor technology for accelerated process development: Current state and future need. Biotechnol Prog. 27, (1), 2-14 (2011).
    31. Hortsch, R., Stratmann, A., Weuster-Botz, D. New milliliter-scale stirred tank bioreactors for the cultivation of mycelium forming microorganisms. Biotechnol Bioeng. 106, (3), 443-451 (2010).
    32. Isett, K., George, H., Herber, W., Amanullah, A. Twenty-four-well plate miniature bioreactor high-throughput system: Assessment for microbial cultivations. Biotechnol Bioeng. 98, (5), 1017-1028 (2007).
    33. Motta Dos Santos, L. F., Coutte, F., Ravallec, R., Dhulster, P., Tournier-Couturier, L., Jacques, P. An improvement of surfactin production by B. subtilis BBG131 using design of experiments in microbioreactors and continuous process in bubbleless membrane bioreactor. Bioresour Technol. 218, 944-952 (2016).
    34. Islam, R. S., Tisi, D., Levy, M. S., Lye, G. J. Framework for the Rapid Optimization of Soluble Protein Expression in Escherichia coli Combining Microscale Experiments and Statistical Experimental Design. Biotechnol Prog. 23, (4), 785-793 (2007).
    35. Huber, R., et al. Robo-Lector: A novel platform for automated high-throughput cultivations in microtiter plates with high information content. Microb Cell Fact. 8, (1), 42 (2009).
    36. Freier, L., von Lieres, E. Kriging toolKit (KriKit). Available from: https://github.com/modsim/KriKit (2017).
    37. Kensy, F., Engelbrecht, C., Büchs, J. Scale-up from microtiter plate to laboratory fermenter: evaluation by online monitoring techniques of growth and protein expression in Escherichia coli.and Hansenula polymorpha fermentations. Microb Cell Fact. 8, (1), 68 (2009).
    38. Lu, C., Bentley, W. E., Rao, G. A high-throughput approach to promoter study using green fluorescent protein. Biotechnol Prog. 20, (6), 1634-1640 (2004).
    39. Zanzotto, A., Boccazzi, P., Gorret, N., van Dyk, T. K., Sinskey, A. J., Jensen, K. F. In situ measurement of bioluminescence and fluorescence in an integrated microbioreactor. Biotechnol Bioeng. 93, (1), 40-47 (2006).
    40. Freier, L., von Lieres, E. Multi-Objective Global Optimization (MOGO): Algorithm and Case Study in Gradient Elution Chromatography. Biotechnol J. (2016).
    41. Keilhauer, C., Eggeling, L., Sahm, H. Isoleucine synthesis in Corynebacterium glutamicum.: molecular analysis of the ilvB-ilvN-ilvC operon. J Bacteriol. 175, (17), 5595-5603 (1993).
    42. Weuster-Botz, D., Kelle, R., Frantzen, M., Wandrey, C. Substrate Controlled Fed-Batch Production of L-Lysine with Corynebacterium glutamicum. Biotechnol Prog. 13, (4), 387-393 (1997).
    43. Meissner, D., Vollstedt, A., van Dijl, J. M., Freudl, R. Comparative analysis of twin-arginine (Tat)-dependent protein secretion of a heterologous model protein (GFP) in three different Gram-positive bacteria. Appl Microbiol Biotechnol. 76, (3), 633-642 (2007).
    44. Morschett, H., Wiechert, W., Oldiges, M. Automation of a Nile red staining assay enables high throughput quantification of microalgal lipid production. Microb Cell Fact. 15, 34 (2016).
    45. Fisher, R. A. The design of experiments. Oliver & Boyd. Edinburgh. (1935).
    46. Morschett, H., Freier, L., Rohde, J., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. A framework for accelerated phototrophic bioprocess development: Integration of parallelized microscale cultivation, laboratory automation and Kriging-assisted experimental design. Biotechnol Biofuels. 10, 26 (2017).
    47. Le Loir, Y., et al. Protein secretion in Lactococcus lactis: An efficient way to increase the overall heterologous protein production. Microb Cell Fact. 4, (1), 2 (2005).
    48. Anné, J., Vrancken, K., van Mellaert, L., van Impe, J., Bernaerts, K. Protein secretion biotechnology in Gram-positive bacteria with special emphasis on Streptomyces lividans. Biochim Biophys Acta. 1843, (8), 1750-1761 (2014).
    49. Gupta, S. K., Shukla, P. Advanced technologies for improved expression of recombinant proteins in bacteria: perspectives and applications. Crit Rev Biotechnol. 36, (6), 1089-1098 (2016).
    50. Fu, L. L., Xu, Z. R., Li, W. F., Shuai, J. B., Lu, P., Hu, C. X. Protein secretion pathways in Bacillus subtilis: implication for optimization of heterologous protein secretion. Biotechnol Adv. 25, (1), 1-12 (2007).
    51. Yoon, S., Kim, S., Kim, J. Secretory Production of Recombinant Proteins in Escherichia coli. Rec Pat Biotechnol. 4, (1), 23-29 (2010).
    52. Hemmerich, J., et al. Comprehensive clone screening and evaluation of fed-batch strategies in a microbioreactor and lab scale stirred tank bioreactor system: application on Pichia pastoris producing Rhizopus oryzae lipase. Microb Cell Fact. 13, (1), 36 (2014).
    53. Glazyrina, J., Krause, M., Junne, S., Glauche, F., Strom, D., Neubauer, P. Glucose-limited high cell density cultivations from small to pilot plant scale using an enzyme-controlled glucose delivery system. New Biotechnol. 29, (2), 235-242 (2012).
    54. Gernaey, K. V., et al. Monitoring and control of microbioreactors: An expert opinion on development needs. Biotechnol J. 7, (10), 1308-1314 (2012).
    55. Rahmen, N., Fulton, A., Ihling, N., Magni, M., Jaeger, K. -E., Büchs, J. Exchange of single amino acids at different positions of a recombinant protein affects metabolic burden in Escherichia coli. Microb Cell Fact. 14, 10 (2015).
    56. Rahmen, N., et al. A particular silent codon exchange in a recombinant gene greatly influences host cell metabolic activity. Microb Cell Fact. 14, 156 (2015).
    57. Saez, N. J., Nozach, H., Blemont, M., Vincentelli, R. High throughput quantitative expression screening and purification applied to recombinant disulfide-rich venom proteins produced in E. coli. J Vis Exp. (89), e51464 (2014).
    58. Scheidle, M., et al. High-throughput screening of Hansenula polymorpha clones in the batch compared with the controlled-release fed-batch mode on a small scale. FEMS Yeast Res. 10, (1), 83-92 (2010).
    59. Baumann, P., Bluthardt, N., Renner, S., Burghardt, H., Osberghaus, A., Hubbuch, J. Integrated development of up- and downstream processes supported by the Cherry-Tag™ for real-time tracking of stability and solubility of proteins. J Biotechnol. 200, 27-37 (2015).
    60. Baumann, P., Hahn, T., Hubbuch, J. High-throughput micro-scale cultivations and chromatography modeling: Powerful tools for integrated process development. Biotechnol Bioeng. 112, (10), 2123-2133 (2015).
    بروتوكول عام للاستفادة المثلى إنتاج البروتين مغايرة باستخدام تقنية ميكروبيوريكتور الآلي
    Play Video
    PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

    Cite this Article

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).More

    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

    Less
    Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
    View Video

    Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

    Waiting X
    Simple Hit Counter