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JoVE Journal Bioengineering
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Bioengineering

自動 Microbioreactor 技術を用いた異種タンパク質生産の最適化のための汎用プロトコル

Published: December 15, 2017 doi: 10.3791/56234
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2,3, 1,2, 1,2,4
1IBG-1: Biotechnology, Forschungszentrum Jülich, 2Research Center Jülich, Bioeconomy Science Center (BioSC), 3Computational Systems Biotechnology (AVT.CSB), RWTH Aachen University, 4Institute for Biotechnology, RWTH Aachen University
* These authors contributed equally

Summary

本稿では、微生物培養メディアのオーダーメイド設計のための一般的なアプローチについて説明します。技術を組み合わせることクリギングを用いた実験設計および microbioreactor 十分な栽培スループット、信頼性や液体メディアをハンドリングの速度向上させる研究室ロボットによってサポートされている反復ワークフローを有効に準備。

Abstract

工業バイオ テクノロジー微生物生産セル工場を使用してのコア ・ ビジネスは歪みの反復的なプロセスとバイオ プロセス条件の最適化です。1 つの重要な側面は、興味の製品の微生物の形成に最適な環境を提供するために培地の改善です。メディア構成も大幅にバイオ プロセスの全体的なパフォーマンスに影響を与えることができますそれをも受け入れられています。栄養媒体の最適化は組換え蛋白質を改善するために知られている微生物システム、従って、この生産バイオ プロセス開発のやりがいのあるステップであります。ただし、非常に頻繁に標準的なメディアのレシピは文学から取得されます培地のオーダーメイド設計は microbioreactor 技術サポートと同様、十分な栽培スループット、高速製品分析を要求する面倒な作業なので液体で信頼性を有効にするのに実験室ロボットによってステップの処理。さらに、高度な数学的手法が合理的計測データを分析し、最適な情報量を達成するために並列実験を効率的に設計のため必要です。

提案するプロトコルの一般的な性質は異なる実験装置、他の式のホスト、およびさらにバイオ プロセス パラメーターと同様に、興味のターゲット蛋白質に簡単な適応のためことができます。また、他の最適化研究の範囲に合うようにタンパク質生産率、特定の収量や製品の品質のような他の最適化の目標を選択できます。応用クリギング ツールボックス (KriKit) は、一般的なツールの設計の実験 (DOE) 改良された総合的なバイオ プロセスの最適化に貢献します。また、上流と下流の両方のプロセスを最適化する上で重要なことができる多目的最適化をサポートしています。

Introduction

現代組換え遺伝子技術は製薬業界、飼料、有機化学、食品加工1,2,3で様々 な用途に技術的な酵素の広い使用をできます。一括大量に技術的な酵素の生産は工業バイオ テクノロジーと最適化された組換え蛋白質の生産のための主要なトピックおよび両方のひずみ、バイオ プロセス工学が必要があります。効率的に設計された生産菌株の世代の異なる遺伝的ライブラリが使用可能、例えば、バランスの取れた遺伝子式4または高められた分泌効率5。

コリネ型細菌のアミノ酸工業規模6、7の主要な生産者、組換えタンパク質8 の分泌生産のための魅力的な非従来型式ホストを表します ,9。両方の一般的な分泌 (Sec) とツイン アルギニン転座 (Tat) 経路c. 型に存在しており、組換えタンパク質分泌10は正しく適用されました。アミノ酸 g/L 量11と大規模は、バイオ プロセスの不均一性に関する素晴らしい保全性のタンパク質を分泌する能力と同様、工業的規模で生産に関するバイオ プロセス工学の豊富な経験耕作1213,,は、工業規模での異種の蛋白質の分泌生産のための有望なプラットフォーム生物C. 型を確認します。

栄養媒体の最適化は微生物システム14,15,16,17したがって、培地の調整と組換えタンパク質の生産を改善するために知られています。組成物は、バイオ プロセスにやりがいのあるステップに関して最適な生産性18,19,20,21の開発。微生物培養22,23,24のマイクロタイター プレート (MTPs) のアプリケーションの集中的な研究開発と微生物培養25 用 Mtp の設計のための道を開いた、制御27,2826と MTP ベース microbioreactor (MBR) システムのオンライン監視と環境の開発。Mbr は、試験栽培スループットの大幅な向上を有効にします。その上、原子炉、バイオリアクター、例えばバブル列または攪拌槽の他の種類に起因する MBR システムで微生物バイオ プロセス最適化29,30,31、利用 32。

一般に、最適化スタディの恩恵増加の実験的スループット、DOE の方法論、設計変数間の相互作用を評価や高次元探索空間の削減などとの組み合わせでさらにもっと強力になります。その結果、MBR システム、ラボの自動化と DOE の併用はバイオ テクノロジー8,16,33,34,35で強力な方法であると証明しています。

メディアの最適化のためのプロトコルは、最新のラボの自動化、オンライン処理の監視、クリギング ベースのデータ解析・実験デザインと MBR 技術を組み合わせることが提示されます。クリギング手法で実装されている MATLAB ツールボックス (「KriKit」) をダウンロードして使用することができます充電36の無料。アプリケーションの例としては、CgXII 最小培地の組成を最適化することによってc. 型と分泌型緑色蛍光タンパク質 (GFP) 生産の最大化が表示されます。GFP 抗体は、それは簡単に定量化することができ、MBR システム37,38,39の研究のためのモデル蛋白質として広く応用されて最適化目標として選ばれました。

提示されたフレームワークは、図 1に示す 4 つの手順に分かれています。手順は、ボックス フレームで示されます、プロトコルのセクションに対応しています。プロジェクトの目標を定義し、必要な方法を決定するのには、まず (図 1 a) です。DOE の方法論、MBR 技術、およびラボの自動化の組み合わせにより、強力なデータ処理を要求する実験的スループットの増大です。(図 1 b) の 2 番目の手順は、最適化目的で高い影響力を持つ (すなわち、メディア コンポーネント) に配慮した設計変数の検出を目指しています。これは興味の設計変数の数が減少に します。(図 1) の 3 番目の手順では、残りの設計変数と興味の目的と機能の関係の詳細な調査のための反復的な最適化を装備されています。順次拡張データ セットを使用して、Kriging アプローチが未計測の位置で実験の結果を予測するために適用されます。反復的なサイクルは、クリギング モデル最適または高原を十分な精度で予測するとすぐに停止します。識別された最適の周りさらに感度分析から始まる第 4 ステップ (図 1) の結果を確認します。当初、非感受性コンポーネントがないことが判明機密も最適の領域で、これが 3 番目のステップで反復最適化処理中に真保持と仮定するが妥当です。その後、活性測定法や Sds-page などの直交法の適用による最適化の結果を確認する勧めします。

提案するプロトコルの一般的な性質により異なる実験装置、他の式のホスト、およびさらにバイオ プロセスと同様に、選択のターゲット蛋白質への簡単な適応の pH 値や栽培温度のような変数であります。さらに、タンパク生産率、特定の収量や製品の品質のような他の最適化目標を他の最適化研究の範囲に合わせて選択できます。

Figure 1
図 1: 最適化スタディのワークフロー 。4 フレーム ボックスは、プロトコルは、「妊娠の研究と定義の方法」(セクション 1)、「感度分析」(セクション 2)、「反復最適化」(セクション 3)、「検証」(セクション 4) のセクションに対応しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Protocol

1. 妊娠研究とメソッドの定義 (図 1: A パート)

注: 最適化の目的の定義: 必要なプロダクト形成の時間コースですか限られた時間間隔のみまたは固定時点のものですか?また、安定性、分析の定量化や培養時間の努力などの潜在的な問題を検討してください。最終的な蛋白質価する代わりに、バイオマスや栽培時間などの他の目的が考えられます。バイオマスは、空間時間収量によって、栽培時間を反映しながらバイオマス特定製品の歩留まりに反映されます。(最小) 製品の品質は、目標もあります。多目的最適化は、40他の所で説明したように、特定の状況で必要があります。本研究では栽培の 17 h 後 GFP 抗体価は最適化目的として選ばれました。GFP の蛍光は、簡素化モデル蛋白質の集中の決定本研究で利用できる機器を使用してオンラインに続くことができます。
メモ: 最適化するパラメーターの定義: CgXII 中41 16 個々 のコンポーネントで構成され、216 ≈ 65,000 実験と、完全実施要因実験でこれらのすべてを調査します。その結果、検索スペースは合理的かつ経験主導的に減少する必要があります。最適化対象のメディア コンポーネントの選択は、利用可能な専門的な知識や文献データでサポートできます。

  1. どの培地成分濃度を変化しない必要がありますを決定します。CgXII メディアの最適化、次のコンポーネントは、修正される選ばれました。
    1. ブドウ糖 10 g/l. で固定であります。この最適化は、多くのブドウ糖がバイオマスを分泌より GFP を得られますので簡単です。目的は非直感的な中くらい効果を明らかにすることでした。
    2. 3-(N morpholino) 42 g/l. で固定である propanesulfonic 酸 (モップ)これは、バッチ培養中に十分なバッファー容量を提供し、代謝されています。
      注: この最終濃度でモップの添加により追加、他の原液の別のボリュームにも pH 7 の開始値 pH 7 ではないです。しかし、pH 値の開始に任意の偏差を除外する培地成分の最大値と最小のボリュームで在庫のすべてのソリューションを追加する場所の pH をチェックしなければなりません。
    3. KH2PO4と K2HPO4は、1 g/L で固定されます。これらはまたバッファキャパシティを提供、リン酸ソースとして機能します。
    4. 尿素 5 g/l. で固定であります。これは、基肥窒素ソースと pH 安定剤、N 制限を防ぐために十分な提供しています。
    5. 0.2 mg のビオチンを固定/l. c. 型ATCC13032 はビオチンの栄養です。
    6. プロトカテキュ酸 (PCA) は 30 mg/l. に固定します。それは、鉄キレート剤として機能します。
    7. イソプロピル-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) は、100 μ M で固定されます。それは、 gfp遺伝子の発現を誘導します。
  2. ハイとローの初期感度上映メディア成分濃度を選択します。ここでは、メディア コンポーネントの 3 つの典型的なグループからのコンポーネントが選ばれました。各コンポーネントの調査低および高濃度は次のとおりです。
    1. 標準的な窒素源: (NH4)2SO4 (8-32 g/L);窒素源の変化は、バイオマス固有 GFP シグナル8の最適化のために有望であると報じられました。
    2. 微量元素: FeSO4 ∙ 7 H2O (4-16 mg/L)、MnSO4 ∙ H2O (4-16 mg/L)、ZnSO4 ∙ 7 H2O (0.4 1.6 mg/L)、CuSO4 ∙ 5 H2O (125 501 μ g/L)、NiCl2 ∙ 6 H2O (8-32 μ g/L) と CoCl2 ∙ 6 H2O (52 208 μ g/L)。微量元素の組成は、CgXII 中41の最初の出版物から継承されます。さらに、ナ2MoO4 ∙ H2O (26 104 μ g/L) と H3ボー CgXII 中42の公開されているバリアントで使用されている3 (20-80 μ g/L) が微量成分として含まれていた。
    3. マクロ要素: MgSO4 ∙ 7 H2O (0.2 0.4 g/L)、CaCl2 ∙ 2 H2O (5.3 21.2 mg/L)。これらは異なる培地背景と CgR0949 Tat 信号ペプチドc. 型ひずみ R を用いて別研究14、分泌の GFP の生産を高めるために他の 2価陽イオンの間で見つかりました。
  3. 材料およびプロシージャが定義の準備
    注: 定義し、詳細なレベルでの実験の方法を修正する勧めします。この標準化によって、異なる結果は、本質的な生物学的変動や異なる培地成分にさかのぼることができます。
    注: メディア在庫ソリューション: すべての個々 の貯蔵液の準備メディア コンポーネントを調査します。すべてのコンポーネントに対して異なるボリュームの希釈のために非常に集中して株式を準備します。これは、設計計画によると、最高のボリュームですべて在庫ソリューションを組み合わせた後、最終的な栽培ボリューム、 cf.項「中原液ピペッティング リストの世代」ステップ 1.3.3 を超えることはできませんこれを意味します。高濃度溶液の添加など非常に低ボリュームの場合 < 最終的な栽培量の 1/100thはそれに応じて原液を希釈します。たとえば、本研究ではすることは不可能未満 10 μ L 分注量が定義されました。通常、トレース要素ソリューション、として、高濃縮 1,000fold 培地で最終の標準濃度に関して。参照レシピで濃度に関して (X 倍) の倍数としてメディア コンポーネントを集中すると便利です。これにより小数桁数の実行不可能なピペッティング ボリュームが回避されます。CgXII 媒体のすべての貯蔵液の詳細なレシピは、補足文書で与えられます。
    1. ワーキング ・ セル ・ バンク (WCB)
      注: 各成長実験 1 つ WCB 因数が使用されます。もっと因数が必要な場合使用 100 mL 脳心臓注入 (BHI) 1,000 mL 困惑中はフラスコを振るまたは複数のシェイク フラスコは、グリセロール溶液添加前にプールを接種します。
      1. 組換え発現ひずみC. 型pCGPhoDBsGFP43 (37 g/L BHI 粉、寒天 20 g/L、25 mg/L カナマイシン) 寒天培地プレート上のシングル コロニーを準備します。メッキ来ることができるいずれかの新鮮な変換や凍結因数から。
単一のコロニーの外観まで, 30 ° C でこれは、通常 1 〜 2 日かかります。
  • 植民地素材シェーカー フラスコ培養 (25 mg/L カナマイシン、500 mL 困惑してフラスコ、250 rpm、揺れ直径 25 mm、30 ° C で 50 mL BHI 培地) を接種し、, 一晩 (約 16 h)。
  • 500 g/L 滅菌グリセロールの解決の 1 つのボリュームの結果細胞懸濁液の 1 つのボリュームを結合し、滅菌凍結保存バイアル 2 mL 因数で配布します。-80 ° C でストア
  • MBR 栽培プロトコル
    注: これで雇われた BioLector MBR システムの研究では, 散乱光 (バイオマス) GFP 蛍光、強度の測定は、一定のゲイン値が割り当てられている必要があります。高いほどのゲインが高いほどの光信号を増幅すると;これはまた、任意の単位 (a.u.) での散乱光や蛍光を測定する理由です。バイオマスと一緒に適切な周波数を振動・充填プロセスの後の段階でより高いバイオマス濃度で酸素制限を避けるために量の予備実験で GFP 検出の適切な値を決定します。雇われた栽培条件 ("Flowerplates"、すなわち、お花 48 ウェル Mtp、1,200 rpm の周波数を振動充填量 1,000 μ l、主な炭素源としてブドウ糖を 10 g/L) 確保酸素無制限耕作。他のボリュームを充填し、48 ウェル Mtp の花の形の周波数を振動の組み合わせから生じる最大酸素転送レート、サプライヤーからデータシートがあります。また、セカンダリ基板 (例えば窒素、微量元素) の少量のため個々 の文化の成長欠陥が発生します。したがって、耕作の終わりにバイオマス濃度をチェックします。本研究ではそのような成長の影響は認められなかった。
    1. MBR システム (「BioLector」) の栽培プロトコル次ように定義します。
    2. フィルター セット 1: バイオマス 14 を得る。フィルター セット 2: pH、利得がプリセットです。フィルター セット 3: pO2、ゲインはプリセットです。4: GFP、80 を得る。
    3. 振動周波数: 1,200 rpm。
    4. 気温: 30 ° c
    5. サイクル時間: 15 分。
    6. 実験時間: マニュアル (栽培は停止せずに自動的に)。
  • 中型原液ピペッティング一覧の生成
    注: あらゆる液体搬送ロボット システムはピペッティング操作を外部ファイルから読み取ることが可能です。基本的には、必要最小限の情報は、データ転送量と試薬ソースの位置だけでなく、ロボット デッキと実験器具内にある特定のキャビティの実験器具の位置によって表されるそれぞれの目的地。ただし、異なる液体処理システムの異なる構文を考慮しなければなりません。図 2は、本研究で採用のピペッティング システムのファイル構造の例を示します。
    1. 4 種類の原液がよく各栽培に戻します。
      1. メディア コンポーネントのソリューションを株式 (「変異株」) を変化させます。
      2. 株の上の別の累積的なボリュームを補うために水。
      3. 固定されているすべてのコンポーネントを含む原液の (「残り在庫」)。この原液を含む別の株式から構成できるコンポーネントは、例えば、異なる温度に保存または別の方法で滅菌します。
      4. 接種は、最後のコンポーネントとして追加し細胞の定着を避けるために追加の直前に作業テーブル上に置く必要があります。
    2. 栽培あたりによるとすべてのメディア コンポーネントに転送するために、ボリュームを計算します。
      Equation 1
      すなわち、この特定のコンポーネントが省略された場合に、追加する特定の変異株多分ボリュームがゼロします。
    3. 適当な数字のVは私すべての計算のボリュームを修正します。ボリュームの手順でピペッティング ボリューム単位は小さすぎていけません。必要な場合は、変異株の濃度を調整します。例えば、ここに最小限のピペッティング ボリュームとして定義されて 10 μ L、5 μ L として定義された最小限のインクリメント。一般に、これらのボリュームは、実験精度と駅15,44の処理に使用される液体の正確さに基づいて定義する必要があります。
    4. 次のようにすべての井戸の固定部品を含む残り在庫の量を計算します。
      Equation 2
      どこ変化株式の最大累積量Equation 3が使用されます。その結果、次のとして残り在庫固定コンポーネントの必要な濃度を計算します。
      Equation 4
      それに応じて残りの在庫を準備します。
    5. 栽培あたりも、次のように追加する水の量を計算します。
      Equation 5
    6. 栽培も、あたり追加された次の順序で追加するすべてのボリュームのリスト: VH2O、VRestStockV私、VInok。図 2の例に示すように、駅を処理液の仕様に従ってピペッティング リストを書式します。
  • 種子培養、自動メディア準備、主な文化の開始
    1. 液体ハンドリング ロボットのためのプロトコルを作成します。「ヤヌス」システムは、対応する「WinPREP」ソフトウェアで実装例プロトコルは図 3および図 4を参照してください。プロトコルは、次の側面を考慮する必要があります。
      1. メディアの準備する前に滅菌の住居のための十分なランタイムが含まれます。
      2. 初期の過剰な洗浄やすべての分注チップの洗浄、チューブがあります。
      3. 在庫ソリューションの適切な実験器具のコンテナーを選択します。ここでは、12 列でディープ ウェル プレートは、よく列に並列配置で浸すことができるすべての 8 つのピペッティング ヒントとして変異株ストレージに適しています。これは、メディアの準備が大幅にスピードアップします。貯水池として 15 mL や 50 mL の試薬チューブを使用している場合のみ 1 つのピペット チップを一度にそれにつけてもいい。
    • 水と残り在庫のような他の株式は、これらの貯蔵液は合計で高いボリュームを必要とに 100 mL 谷を使用します。
  • 在庫ソリューションごとに廃棄物処理量、高さピペッティング オフセット等を補うために十分な容量を提供します。
  • 種子培養法の直前に、この手順が実施されることを確認、接種手順の前にユーザー プロンプトを挿入します。
  • 適切な容器、例えば、滅菌 15 mL および 50 mL の試験管に使用するまで滅菌方法とストアで在庫のすべてのソリューションを準備します。
  • 70% のエタノールと層流フードでその後乾燥を拭くなど、作業テーブルに原液保存するためディープ ウェル プレートを滅菌します。
  • 25 mg/L、WCB から 1 つの因数とカナマイシンを含む 50 mL BHI 培地に接種して種子の培養を開始します。MBR 栽培前に指数関数的に成長のための十分な量の種子文化から新鮮な重要な接種を準備します。
  • ロボットの作業テーブルにすべての必要な実験器具を配置し、対応する実験器具で原液を注ぐ。
  • 種子培養の開始に間に合う最後のステップ (接種) が達されるようにメディア制作のロボットのワークフローを開始します。ロボットのワークフローの合計実行時間は、以前に評価する必要があります。ここでは、合計実行時間は約 1.5 時間だった。
  • 約 2 h、光学濃度 (OD600) によって成長を監視するため、それぞれの時間から種子培養をサンプリングします。約 5 時間後文化は 3-4 OD600に達すると、主な文化を接種する使用されます。
  • 液体ハンドラー ワーク テーブル上種子培養を置き、メディアの準備のプロトコルを続行します。接種後栽培 MTP をシールします。
  • BioLector デバイスで MTP のシールの栽培しあらかじめ定義された耕作プロトコルを起動します。
  • 必要に応じて、バイオ セーフティ規則に従って残り原液を処分でロボット作業テーブルから文化をシードします。再使用可能な器具をきれいにし液体ハンドラー除染プロトコルを起動します。
  • 製品数量と生データ分析のための前処理
    1. 17 h ランタイム後主な文化を停止します。
    2. BioLector MBR デバイスから製造元のマニュアルによると BioLection のソフトウェア パッケージを使用して、接続されているコンピューターに測定データを転送します。
    3. 使用、「データ管理 → データ変換」便利なスプレッドシート形式に raw データを変換する MBR システムに付属している「BioLection」ソフトウェア パッケージの機能。17 h 参照栽培井戸と平均からの信号は、GFP の識別に最も近いタイムスタンプ列からすべての栽培井戸の GFP 信号データをコピーします。平均基準信号すべて残り GFP シグナルを正規化します。
    4. 追加のメソッドを使用して (必要な場合) GFP 抗体価を数値化します。
      1. すべて栽培井戸から prelabeled 反応チューブに細胞懸濁液を転送し、ベンチトップ遠心分離機を使用して最大速度で 10 分間遠心分離後細胞上清を取得します。
      2. 各細胞上清 200 μ L に透明底黒 96 ウェル MTP 転送し、488/520 で GFP 特異蛍光を読み取る適切なマイクロ プレート リーダーを使用して nm。1.5.3 のステップのように、参照の耕作からの平均信号のすべての井戸から gfp を正規化します。
        注: 異なる測定装置の絶対の GFP 蛍光信号を比較できません。したがって、すべての主要な耕作から 5 参照系統は内部標準として機能します。GFP 抗体価の改善は、内部標準に関連して表現できます。さまざまな実験や GFP 定量化方法 (次の 2 つの手順を参照してください) からの結果の比較が可能になります。
      3. 標準プロトコル、例えば、ブラッドフォードまたは BCA アッセイと細胞上清の蛋白質内容を決定します。ステップ 2 からの結果と組み合わせて、タンパク質特異 GFP 抗体価の定量が可能です。
        注: 蛍光測定、このマイクロ プレートから直接サンプルを使用します。マルチ チャンネル ピペットの使用大きくステップの処理に必要な液体が容易になります。
      4. SDS ページの可視化を行う細胞培養上清の GFP 分泌の増加により、増加蛋白質内容のほとんどを確認する標準プロトコルを次します。
        注: SDS ページはより高いサンプル負荷、特に前述の方法よりも骨の折れるです。確認のため、中規模および最終的な参照から細胞上清の SDS ページ最適化培地栽培15を実行するための十分な頻繁です。

    • 2. 感度解析 (図 1: 一部 B)。

    注: この部分の目的は目的に重要な影響を及ぼす重要な要因を識別するためにです。

    1. メディア コンポーネントの初期濃度範囲を選択します。培地成分が参照する必要があります選択した濃度範囲内うそをつきます。
    2. 適切な DOE を選択します。そのような設計は、文学、例えば、統計的手法 (www.itl.nist.gov/div898/handbook/pri/section3/pri3347.htm で入手可能) の NIST/SEMATECH e 手引から見つけることが。選ばれたデザインは関心のメディア コンポーネントの数によって異なります (ここで 11) と実行実験数 (ここで 32)。特定の例をし興味の目的に 11 のコンポーネントのいずれかの濃度を増加させる効果の推定を許可する 32 の実験結果「2IV11-6」のデザインが選ばれました。具体的には、主な効果はない対因子相互作用混同します。彼らはより高い順序の相互作用と混同することができますは、しかし、ほとんどない重要な。
    3. 残りの井戸を使用して (ここで 16) プロセスの再現性を評価するために参照媒体の複数の複製を実行するため。複製は、ポジショニング エフェクトを発見する板の上に均等に分けてください。参照実験から測定された出力の平均値は、正規化されます。つまり、感度分析の各測定の出力は、参照の出力の平均値で除算されます。
    4. メインの計算と組み合わせ効果が適切な統計ソフトウェアを使用可能な場合。実験の古典的なデザインは、45の多項式近似に基づいています。例えば、多項式の係数の推定の MATLAB 関数 mvregress を使用できます。
    Mvregress 関数は、統計と機械学習ツールボックスの一部です。
  • T検定を用いて目的に関連のある各種メディア効果を識別します。例では、NH4+には有意な負の効果を示し Ca2 +と Mg2 +最強の肯定的な効果 (図 5)。その中心値から特定のコンポーネントの濃度を増加させるときに係数が GFP シグナルの平均の相対的な変化を表します GFP シグナルが正常化したのでEquation 7、最大値。
  • 関連する効果なし固定コンポーネントは、最適化の間、基準値にされます。

    • 3. 反復最適化 (図 1: C)

    注: KriKit 解釈の統計的データ分析36使用された MATLAB ツール。KriKit では、データ駆動型クリギング モデルを構築することができます。このクリギング モデルは、メディア コンポーネントと目的の機能の関係を予測します。また、予測の不確実性についても説明します。高い不確実性には、ノイズの多いデータおよび/または不十分なデータ密度を示します。

    1. DOE
      注: 新しい実験が繰り返しに基づいて設計されて、以前の実行の結果。
      1. 最初のイテレーションでは、目的の特定メディア コンポーネントの詳細な調査のための新しい実験をデザインします。セクション 2 から実験結果は、関連する効果なし成分濃度がそれぞれの基準値に修正今、反復最適化 (セクション 3) に転送できません。その結果、感度解析と最適化反復実験は比較されていません。
      2. それ以外の場合に示す図 1フレーム「反復最適化」スキームに従ってください。潜在的な最適な定義された濃度範囲の内側にある、新しい実験は、予想される改善40,46を使用して設計されています。予想される改善に基づく実験的なデザインは、KriKit ツールボックスに統合されています。最適な境界上にある、する場合は、濃度範囲を展開します。
    2. セクション 2 で定義されている実験方法に従って設計されたサンプル点で実験を実行します。
    3. 統計解析
      1. 現在を含むすべてのイテレーションから結合されたデータを用いたクリギング モデルを構築します。
      2. KriKit (2/3 D 補間、映画分析、プロット等をスクリーニング) の包括的なツールを使用して可視化によるモデルの出力を調べます。
    4. 最適な領域を十分な精度で推定された場合は、最適化を停止します。ない場合は、ステップ 3.1 を続行します。
      注:図 6試験学習のための最適化反復を示します。濃度範囲を高原が見つかりました (イテレーション 1-6) まで引き続いて増築。7 番目のイテレーションより詳細に境界を探索に使われました。

    4. 結果の検証 (図 1: D 部)

    注: 反復最適化が終わったら、最初の仮定の妥当性をチェックする必要があります。

    1. 感度解析 (セクション 2) 最適な培地組成のやり直し。つまり、図 1 (C パート) で検討した成分の濃度は、それぞれの最適値に固定されます。その他の成分濃度は適切なエネルギー省によるとさまざまです。
      注: 両方の上映で同様の結果は、調査の成分の濃度は、他の成分の効果を変更しないことを示します。スクリーニングは、B 部から結果に有意な差を示している場合, コンポーネントのプールに変更された効果を持つコンポーネントを追加するか、C の部分を繰り返す必要があります。
    2. 間接測定 (例えば、製品濃度の指標として蛍光)、場合において直交計測手法 (例えば活性、ブラッドフォード、BCA タンパク質定量、sds-page) 変更を確認するには参照媒体と最適化された中型15からの結果を比較することによって興味の目的。

    Representative Results

    分泌された GFP の価を最大化するために導入されたプロトコルが適用されました。具体的には、GFP 抗体栽培の 17 h は最適化目的として選ばれた後。GFP のオンライン蛍光検出は、シンプルな製品数量を許可しました。ただし、GFP 参照栽培からデータ信号の正規化は、再現性と結果の比較可能性を確保するために不可欠です。メディア コンポーネントの事前選択は、セクション 1 で説明したように理性的な基礎で実行されました。第 1 節の指示に従って実験を行なった: ぬれた実験室プロシージャのパラメーターは、一貫性と再現性を確保する全体の研究用に定義されました。

    セクション 2 で説明した、最初のスクリーニングはさらより詳細な研究のための最適化の目的に重大な影響を示す適切なコンポーネントを識別するために行った。MTP ベース MBR システムでは、48 実験は並列で実行することができます。11-6小数 1 MTP (48) 並列実験の最大可能な数やメディア コンポーネント (11) は 2IVの総数を考慮して適切な選択を設計します。この実験的なデザイン 32 実験と調査のメディア コンポーネントのそれぞれの主な効果の推定を可能しています。残り栽培井戸 (16) は、再現性と位置の効果を評価するために参照媒体実験の複数のレプリケートに使用されました。一度は、各実験を実施 (ないレプリケートします)、参照実験 (5 レプリケートします) を除いて。

    表 1は、スクリーニング分析の結果をまとめたものです。考慮した濃度範囲でメディア コンポーネントの大半の変化は目的の顕著な効果と表示されませんでした。コンポーネント NH4+は、Ca2 +と Mg2 +が最強の肯定的な傾向を示す中の強い負の効果を示しています。Mg2 +の効果は、現在の濃度範囲の重要ではありませんが、広い濃度範囲のかもしれません。その結果、NH4+メディアから省略して Ca2 +と Mg2 +の実験での効果を検討することになった。

    セクション 3 では、Ca2 +と Mg2 +の濃度を変えながら GFP 蛍光信号を最大化するために使用されている反復最適化手順について説明します。イテレーション 1、NH4+を省略することができる仮説がテストされました。Ca2 +と Mg2 +の濃度範囲は、スクリーニング分析から採用されました。NH4+の最小の濃度がゼロに設定された、最大濃度は、スクリーニング試験から採用されました。次の実験では、成分濃度が 27 実験の結果、定義濃度範囲内 3 グリッド x 3 x 3 に分散されています。参照中の 5 つの複製が含まれてすべての耕作中に役立った内部標準として、MTP にポジショニング エフェクトが発生していないことを確認します。残りの 16 の井戸の NH4+、Ca2 +Mg2 +濃度特定範囲内ランダムに分散。

    図 5Aは、最初のイテレーションの結果を可視化します。軸ラベルは、元の参照の培地に使用する成分濃度を参照してください x の Ref によって示される。青い面を表すクリギング補 KriKit ソフトウェアを使用して計算されました。各表面は NH4+の相対的な濃度レベルに関連付けられている (ダークブルー: 0 Ref、格子縞 x: 1 Ref、ライトブルー x: 2 Ref x)。この視覚的な表現では、NH4+を省略に有利だと明らかにします。補間サーフェスは、濃度の増加とのすべての飛行機上昇として Mg2 + Ca2 +、肯定的な効果も表示されます。

    イテレーション 1 の結果に基づき、決定された最大濃度の倍増によって濃度範囲の Ca2 +と Mg2 +を展開し、図 5を参照してください実験デザイン ウィンドウの右上隅にシフトB。 この範囲内濃度 6 x 6 のグリッドに分布していた。最適なクリギング内挿結果につながる完全な集中の範囲で均等に分布をこうなります。図 5結合されたデータに基づくクリギング補間プロットBショーは両方のイテレーション (赤い点と黄色の正方形) で測定。両方、Ca2 +と Mg2 +、その濃度の増加の肯定的な効果を続けます。したがって、プロシージャは最大濃度の倍増によって繰り返された、したがって、実験的デザイン ウィンドウの右上隅の境界を探るに移されました。

    図 6Aは残りの最適化手順の概要を示します。イテレーション 3 まで収集したデータセットの解析では、Mg2 +、すなわち、最適濃度範囲の Mg2 +の肯定的な効果の制限を識別を明らかにしました。したがって Ca2 + (イテレーション 4) のみの濃度範囲をさらに拡大しました。この手順が 2 回繰り返された (イテレーション 5 および 6) GFP 信号の飽和が発見されるまで。この飽和は、セルに利用されている Ca2 +、施用濃度の Ca 塩の沈殿物によって説明されています。

    実験結果は、常にノイズによる摂動、結果クリギング内挿が不規則な表示され、目視検査が誤った結論につながる可能性があります。しかし、飽和の gfp のメディア コンポーネントの最適な濃度範囲は KriKit にも実装されている統計的z -テストで確実に識別できます。Z検定は直接、クリギング法、すなわち予測値および予測の不確実性によって提供される組み込みの統計情報を使用します。図 6Bは、識別された高原として決定され視覚化された KriKit ツールボックスの使用を示しています。KriKit ツールボックスは、自由に利用できる36でその機能を使用する方法を説明する詳細なチュートリアルが付属しています。

    2 つ以上の関連するコンポーネントがある場合 3 D の可視化が限界に達した。KriKit 映画や「プロット スクリーニング」などの他のいくつかの可能な視覚的表現方法を提供します。定義された濃度範囲内最適な潜在的な場合は、新しい実験自動的に予想される改善40,46を使用して設計されています。予想される改善に基づく実験的なデザインは、KriKit ツールボックスに統合されています。詳細な情報は、ソフトウェアのマニュアルで見つけることが。

    前述のパーツ D で反復手順の後結果の検証が行われました。最初の仮定の妥当性は、最適な培地成分を使用して追加の感度解析を実行することによって調べた。関心のすべての初期のメディア コンポーネントが変化したが、Ca2 +と Mg2 +が最適な濃度レベルに設定されました。本研究では、最適な濃度でEquation 8= 32 Ref x とEquation 9= 6.8 x Ref が選ばれました。検証審査の結果を表 2に示します。スクリーニング (cf. 表 1)、NH 初期の感度と同様に4+まだ、負の影響と残りの効果はまだごくわずか。

    容易なアクセスのため栽培懸濁液から GFP 蛍光信号はすべての実験中に細胞外の GFP 抗体を定量化に使用されました。検証のために、GFP 蛍光だった他の測定値に対して検証されます。GFP が Tat 経路を介した分泌されているため蛍光信号内と GFP の細胞外の間で区別できません。したがって、耕作参照媒質と最適化された媒質を使用し再現されました。ブラッドフォードの試金、(半) し, 定量化したタンパク質含有細胞培養上清から蛍光測定、ほか-GFP の質的 SDS ページ15で可視化しました。すべての結果として得られる測定信号が最適化されたメディア参照媒体と比較し、検証と耕作の約 2 倍、分泌性能最適化された媒体の約 100% 向上。その結果、栽培の懸濁液の GFP 特定の蛍光、最適化目的、すなわち、細胞外の GFP 抗体価の適当な測定基準が考えられます。

    Figure 2
    図 2: 感度解析のボリューム ピペッティング リストからスクリーン ショットします。最初の列内のエントリは、1 つの行のすべてのボリュームに固有識別子を割り当てるこの識別子は、MTP もターゲットの栽培 MTP参考: 図 4C液体ハンドラーの作業テーブルの数です。残りの列は、戻ことにさまざまなソリューション (「Sln-01」「Sln - 15」) のボリュームをエンコードします。1 つの行の累積的なボリュームは最終的な栽培も対応する量に対応します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 3
    図 3: コントロール ソフトウェア「WinPREP」の処理液からのスクリーン ショットします。左: 行の命令コマンド、各原液に戻されるため転送コマンドを含みます。接種追加最後のコマンドの前にユーザー プロンプトが種子培養、ジャストイン タイム テーブルに配置されますように挿入されます。右: 変異株 (12 列のような井戸を用いた 2 つのディープ ウェル プレート)、試薬槽メディア準備ターゲット栽培 MTP や菌、水残りストック ソース実験器具を含む、作業の概略図。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 4
    図 4: 在庫ソリューションのピペッティングのセットアップの詳細なスクリーン ショット集。(A) Fe 株式のピペッティングのコマンドをラップします。ソース実験器具とよくソース内によって示される作業テーブルの読み取りフレームと対応するディープ ウェル プレートの赤い列。先の実験器具や内先井戸は、青枠と MTP ターゲット栽培の青井戸によってマークされます。(B) このステップ (Fe 原液) のピペッティング ボリュームの割り当ての詳細な例ビュー。就航空港数は 48 行がピペッティングのリストから読み取られます。原液がピペッティングのリスト [4] 列にある Fe のすべての先の井戸のディスペンス ボリューム。識別子と図 2参照、転送されずにボリュームないピペッティングのリストの最初の列が含まれることに注意してください。(C) も番号宛先の詳細について。ボリュームの対応する分注リストの行 #1 で書かれては、#1 としてマークされたウェルに戻されます。井戸 #01、08 #、#41 #48 は栽培自体 MTP には印刷も英数字の符号化のための井戸 F08 F01、A08 A01 に対応しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 5
    図 5: 最初のイテレーションからの結果を詳しく説明します。(A) クリギング内挿はイテレーション 1 の実験データに基づきます。赤い点は、データのセットを示します。比較のためすべての 3 つの補間サーフェスは 1 つのプロットの重ね合わせ (ダークブルー: 0 Ref、格子縞 x: 1 Ref、ライトブルー x: 2 Ref x)。結果を別の表現は15を他の場所で見つけることができます。(B) 実験に基づくクリギング内挿はイテレーション 1 (赤い点) と 2 (黄色い正方形) のイテレーションで実行されます。この図に示したデータの部分は、以前に発行された15をされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    Figure 6
    図 6: 繰り返し収集した最適化の結果の描写。(A) 最終クリギング予測モデルします。Z統計に基づいて最適な領域 (赤) (B) の統計的同定-テスト、KriKit によって提供されます。ボックスは、反復的な設計の連続する手順との実験の実行を示します。この図に示したデータの部分は、以前に発行された15をされています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

    コンポーネント 正規化係数の平均値
    Fe2 + -0.08
    Mn2 + -0.05
    Zn2 + -0.21
    Cu2 + -0.21
    NH4+ -2.04
    Ni2 + -0.11
    Co2 + -0.10
    MoO42- 0.03
    ボー33- 0.06
    Ca2 + 1.00
    Mg2 + 0.45

    表 1: 感度解析の結果。最大値中央値からそれぞれのメディア コンポーネントの濃度を増加させるときの平均の効果を表す係数。最適な実験設計のためとしては標準的な文献で発見され、標準偏差を表すを使用ここでは、直接参照実験のレプリケーションによる実験の変化。係数の値は、最大値 (0.0422 コンポーネント Ca2 +) によって正規化されました。正規化と絶対係数標準偏差はそれぞれ 0.54 と 0.0226 です。

    コンポーネント 正規化係数の平均値
    Fe2 + -1.00
    Mn2 + 1.00
    Zn2 + -3.48
    Cu2 + -0.52
    NH4+ -15.95
    Ni2 + 0.69
    Co2 + -0.51
    MoO42- -0.45
    ボー33- -1.11

    表 2: 最終的な感度分析の結果。最大値中央値からそれぞれのメディア コンポーネントの濃度を増加させるときの平均の効果を表す係数。最適な実験的デザインが使用された、標準偏差のみ最適化された培地成分を用いた実験的変動に依存します。実験の変化は参照媒体を用いた変動と比較して若干増加します。係数の値は、最大値 (0.0106 コンポーネント Mn2 +) によって正規化されました。正規化と絶対係数標準偏差は、それぞれ 3.63 と 0.0385、です。

    Discussion

    提案するプロトコルの一般的な性質により、さまざまな adaption、例えば、留学その他微生物式ホスト9,47,48,49,50,51、またはターゲット蛋白質の糖鎖修飾パターンまたは二硫化物結束のようなその他のプロパティを最適化します。プロトコルは利用可能な実験装置に適合させる必要もあります。MBR システムの統合により、時間の節約を可能にする実験的スループットの向上します。ただし、MBR システムによって完全に計測し制御可能なバイオリアクターを交換する際の結果スケーラビリティ見なす必要があります8,37,52,53。DOE の方法論と数学的モデリングの使用は、効率的な実験計画およびモデル ・ ベースのデータ解釈1554研究目的に関する測定データの情報量を最大化するのに役立ちます。

    メソッドへの変更
    多目的利用や拡張可能なロボットの液体処理本研究で使用されるのようなシステム、横に特筆すべきはいくつかの小さい液体処理システム市販このタスクを実行することができる、内部に配置することができますがあります。層流仕事のベンチ。自動分注装置が使用できない場合 DOE 計画に従って異なるメディアの組成も手動ピペッティング単一またはマルチ チャンネル ピペットの使用によって実現できます。マニュアルの準備がよりエラーが発生しやすいが、かなり長い時間の高度に集中作業が必要になりますので様々 なメディア作品の数を減らすを準備することをお勧めします。

    採用の MBR システムの機能によって対応する栽培プロトコルが異なります。例えば、バイオマスの形成のオンライン測定が利用できない場合、成長実験が完了した後バイオマス濃度を測定するための十分な場合があります。オンライン監視との組み合わせでの pH と溶存酸素は、いくつかの MBR システムで実装されている安全で成長彩度を定めることができます。原則として、インキュベーター、MBR システムを使用せずに収納しただけで Mtp の成長実験を実施できます。この場合、適切な栽培条件を持って確保する: (1) 酸素限定栽培は適切な振動周波数と振動直径、例えば、96 または深い 24 の正方形との組み合わせでの適切なジオメトリを Mtp を使用して避けることができます。ウェル プレートはそれぞれ 1,000 rpm を 3 mm または 25 mm スローで 250 rpm で運営しています。重要なより低い達成可能な最大酸素転送速度、低い主要な炭素源する必要があります集中。ブドウ糖 10 g/L の使用だった採用の栽培条件の酸素制限を防ぐために適切な前述のように、本研究では、(MTP 文化バイオマスと製品の定量化のためのサンプリング 2) は必要最小限にとどめます。MTP は揺れインキュベーターから削除されるたびに酸素の移動はすぐにブレーク ダウン不利な栽培条件で可能性があります。(3) での著者の意見、これらのデバイスがこの目的のために開発されなかったと MTP 読者栽培装置としての使用は推奨されません。たとえば、振動力学試薬添加後マイクロ プレートの時折ミキシングのため造られた、したがって、日間連続揺れ続くロングランの堅牢性に欠けます。さらに、微生物の耕作のために必要十分な力の入力は、これらの読者に認識できません。光学濃度の測定値の統合短い時間間隔は酸素制限の繰り返された周期の揺れの動きの停止必要です。さらに、長い栽培期間にわたってこのようなシステムで蒸発は結果を歪曲します。文献22,23,24,25,26 Mtp を使用して微生物の耕作のための驚くほど複雑なトピックの詳細については、リーダーは呼ばれますとそこを参照します。

    他の考慮事項
    高速化反復最適化の手順には、製品の定量分析法を慎重に選択することをお勧めします。速くて簡単な方法は、反復実験的なデザイン戦略を許容実験誤差と精度と正確さを犠牲にして優先されるべき。しかし、最終的な結果より複雑になる可能性が十分に精密で正確な製品数量化に対して検証する必要があります。一般に、慎重な評価と意思決定研究手続きについての研究では、初めに努力を必要とするが、ルーチン メソッドを確立した後、長期的に支払います。

    最適化中にすべての実験を比較する参照実験を定義するを強くお勧めします。つまり、測定出力と同様、適用中の成分濃度基準値で割ることによって正規化されます。このように、それぞれの適用し、測定値が基準値の x 倍として解釈できます。プレート間にアカウントのバリエーションを考慮するには、5 つの参照実験は各プレートで行われます。測定結果の平均値は、正規化されます。

    それすることができます一般的には保証されません開発中も他の系統に最適であること。ただし、改良培地最ももする可能性が突然変異誘発の研究 (から得られる単一のアミノ酸置換による酵素バリアントを生産するとき小さい遺伝の相違、例えば、式系統の育成に適したただし、1 つの点突然変異に記載されている効果細胞の代謝と異種発現性能55,56)。この場合、提案するプロトコルは、高スループット式上映57のプロトコルに続いて、最初のステップをすることができます。対応するバイオ プロセス条件の最適化されたメディアを検証するスクリーニング、マイクロ スケールでのキャンペーンのクローン識別異なるトップ以降フェッド バッチ培養スケール アップと媒体開発のプロトコルを使用する場合異なる餌戦略と栽培メディア52,58の実行者。さらに、導入された KriKit36は一般的に改善された総合的なバイオ プロセスの最適化に貢献できます。ごく最近、ツールの能力は両方のアップ ストリームおよびダウン ストリーム プロセス59,60の最適化のために重要となる40多目的最適化をサポートする拡張されました。

    Disclosures

    著者が明らかに何もありません。

    Acknowledgments

    なると見込まれて科学センターの科学的な活動は省の革新、科学、研究によって NRW Strategieprojekt BioSC (第 313/323-400-002 13) の枠組みの中で財政的に支えられました。著者は、省イノベーション ・科学と研究のノルトライン = ヴェストファーレン州・ ラース Freier 舍大学院クラスター産業バイオ テクノロジー内への奨学金のハインリッヒ ・ ハイネ大学デュッセルドルフにありがとうございます。さらなる資金提供を有効スペース プログラム ドイツ ヘルムホルツ協会、"微生物バイオ プロセス研究室-A ヘルムホルツ ・ イノベーション ・ ラボ」をサポートするための「ヘルムホルツ革新ラボ」から受信しました。

    Materials

    Name Company Catalog Number Comments
    BioLector m2p-labs G-BL-100
    Flowerplate m2p-labs MTP-48-BOH For cultivation in the BioLector device
    Sealing foil m2p-labs F-GP-10 Sterile sealing for Flowerplate
    MATLAB Mathworks 2016b
    KriKit Forschungszentrum Jülich n/a Freely available, MATLAB installation required
    Janus pipetting robot Perkin Elmer n/a Includes "WinPrep" software installation
    12-column deep well microplate E&K Scientific EK-2034 Container for medium stock solutions
    96 well microplates, transparent, F-bottom Greiner 655101 For Bradford protein assay
    µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom Greiner 655087 For flourescence measurement in cell-free supernatants
    Pipette Research plus multi-channel pipettes Eppendorf n/a Facilitates manual liquid handling with microplates
    TruPAG Precast Gels Sigma PCG2002 For SDS-Page analysis of cell-free supernantants
    Bradford Reagent Sigma B6916
    C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP n/a n/a Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007)

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    Hemmerich, J., Freier, L., Wiechert, W., von Lieres, E., Oldiges, M. Generic Protocol for Optimization of Heterologous Protein Production Using Automated Microbioreactor Technology. J. Vis. Exp. (130), e56234, doi:10.3791/56234 (2017).

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