Detta manuskript beskrivs en allmän metod för skräddarsydda design av mikrobiell odling medier. Detta är aktiverat genom en iterativ arbetsflöde som kombinerar Kriging-baserade experimentell design och microbioreactor teknik för tillräcklig odling genomströmning, vilket stöds av lab robotics att öka tillförlitlighet och snabbhet i vätskehantering media beredning.
En kärnverksamhet i industriell bioteknik med mikrobiell produktion cell fabriker är iterativa processen av stam ingenjörskonst och optimering av bioprocess villkor. En viktig aspekt är förbättring av odling medium att ge en optimal miljö för mikrobiell bildandet av produkten av intresse. Det är väl accepterat att media sammansättning kan dramatiskt påverka bioprocess prestanda. Nutrition medium optimering är känt att förbättra rekombinant protein produktion med mikrobiella system och således, detta är en givande steg i bioprocess utveckling. Dock är mycket ofta standardmedia recept hämtade från litteraturen, eftersom skräddarsydda design av odling medium är en mödosam uppgift som kräver microbioreactor teknik för tillräcklig odling genomströmning, snabb produkt analytics, samt stöd av lab robotics aktivera tillförlitlighet i vätskehantering steg. Dessutom krävs avancerade matematiska metoder för att rationellt analysera mätdata och effektivt designa parallella experiment såsom för att uppnå optimal informationsinnehåll.
Generisk beskaffenhet presenteras protokollet möjliggör enkel anpassning till olika labbutrustning, andra uttryck värdar och målproteiner av intresse, liksom ytterligare bioprocess parametrar. Dessutom kan andra optimering mål som protein produktionstakt, viss avkastning eller produktkvalitet vara utvalda för att passa omfattningen av andra optimering studier. Verktygslådan för tillämpad Kriging (KriKit) är ett generellt verktyg för Design av experiment (DOE) som bidrar till förbättrad holistisk bioprocess optimering. Det stöder också flera mål optimering som kan vara viktiga i att optimera både uppströms och nedströms processer.
Modern rekombinant genteknik möjliggör en omfattande användning av tekniska enzymer för olika applikationer i läkemedelsindustrin, djurfoder, organisk kemi, och livsmedelsbearbetning1,2,3. Produktionen av tekniska enzymer i stora kvantiteter är ett stort ämne för industriell bioteknik och optimerad rekombinant proteinproduktion, och både stam och bioprocess teknik behövs. För generationen av effektivt konstruerade produktion stammar, det finns olika genetiska bibliotek, t.ex., för balanserad gene expression4 eller ökad utsöndring effektivitet5.
Corynebacterium glutamicum är en stor producent av aminosyror på industriell skala6,7 och utgör en attraktiv icke-konventionella uttryck värd för sekretoriska produktion av rekombinanta proteiner8 ,9. Både allmänna sekretoriska (Sec) och twin-arginin translokation (Tat) väg finns i C. glutamicum och tillämpades för rekombinant protein sekretion10. Lång erfarenhet av bioprocess engineering angående aminosyra produktion i industriell skala, liksom förmågan att utsöndra proteiner till redov belopp11 och stor robusthet om bioprocess inhomogeneities Funna i stor skala odlingar12,13, göra C. glutamicum en lovande organism som plattform för sekretoriska produktionen av heterologa proteiner i industriell skala.
Nutrition medium optimering är känt att förbättra rekombinant proteinproduktion med mikrobiella system14,15,16,17 och följaktligen justeringen av medium sammansättningen är ett givande steg i bioprocess utveckling med avseende på optimal produktivitet18,19,20,21. Intensiv forskning om tillämpningen av mikrotiter plattor (Mbps) för mikrobiell odling22,23,24 banade väg för utveckling och design av Mbps för mikrobiell odling25 ,26 och utvecklingen av MTP-baserade microbioreactor (MBR) system med online-övervakning och kontroll27,28. MBRs möjliggör en betydande ökning av experimentell odling genomströmning. Dessutom finns MBR system som härrör från andra typer av bioreaktorer, t.ex., bubbla kolumner eller stirred tank reaktorer, tillgängliga för mikrobiell bioprocess optimering29,30,31, 32.
I allmänhet gynnas optimering studier av ökad experimentella genomströmning, som blir ännu mer kraftfull i kombination med DOE metoder, såsom att bedöma samspelet mellan design variabler eller minska högdimensionella Sök utrymmen. Den kombinerade användningen av MBR system, lab automation och DOE har följaktligen visat sig vara en kraftfull metod i bioteknik8,16,33,34,35.
Ett protokoll för medier optimering presenteras kombinerar state-of-the-art lab automation, MBR teknik med online processövervakning och Kriging-baserade data analys/experimentell design. Kriging metoden är implementerad i en MATLAB verktygslåda (”KriKit”) som kan laddas ner och användas utan kostnad36. Som exempel på tillämpning exempel visas maximering av sekretoriska grönt fluorescerande protein (GFP) produktion med C. glutamicum genom att optimera sammansättningen av CgXII minimalmedium. GFP titer valdes som optimering målet eftersom det kan kvantifieras enkelt och det är allmänt tillämpas som modell protein för studier på MBR system37,38,39.
Presenterade ramen är uppdelad i fyra steg, som illustreras i figur 1. Stegen indikeras av rutan bildrutor och motsvarar delar av protokollet. Det första steget (figur 1A) är att definiera projektmålen och bestämma de nödvändiga metoderna. Kombinationen av DOE metoder, MBR teknik och lab automation möjliggör en ökad experimentella genomströmning som kräver kraftfull databehandling. Det andra steget (figur 1B) syftar till att identifiera känsliga design variabler (dvsmedelstora komponenter) med hög påverkan på syftet optimering. Detta leder till ett minskat antal design variabler av intresse. Det tredje steget (figur 1 c) består av en iterativ optimering för en mer detaljerad undersökning av det funktionella sambandet mellan variablerna återstående design och målet av intresse. Metoden med Kriging används för att förutsäga den experimentella resultaten på ouppmätta platser och använder successivt utökade datauppsättningen. Den iterativa cykeln stannar så snart Kriging modellen förutspår en optimal eller platå med tillräcklig noggrannhet. I det fjärde steget (figur 1 d), börjar med en ytterligare känslighetsanalys runt den identifiera optimaln verifieras resultatet. Om inledningsvis okänsliga komponenter befinns vara okänsliga också i regionen optimalt, är det rimligt att anta att detta gäller under det iterativa optimering förfarandet i det tredje steget. Efteråt, det rekommenderas att kontrollera optimering resultatet av tillämpningen av ortogonala metoder, som en aktivitet assay eller SDS-Page.
Generisk beskaffenhet presenteras protokollet möjliggör enkel anpassning till olika labbutrustning, andra uttryck värdar och målproteiner för val, liksom ytterligare bioprocess variabler som pH värde eller odling temperatur.Dessutom kan andra optimering mål som protein produktionstakt, viss avkastning eller produktkvalitet vara utvalda för att passa omfattningen av andra optimering studier.
Figur 1 : Arbetsflöde för optimering studie. Rutorna fyra ram motsvarar delar av protokollet, ”att bli gravid den studien och Definition av metoder” (avsnitt 1), ”känslighetsanalys” (avsnitt 2), ”iterativ optimering” (avsnitt 3) och ”validering” (avsnitt 4). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Den generiska typen av presenterade protokollet tillåter olika anpassningar, t.ex., för att studera andra mikrobiella uttryck värdar9,47,48,49,50, 51, eller att optimera andra egenskaper hos målproteinet, som glycosylation mönster eller disulphide obligationer. Protokollet kan också behöva anpassas till de tillgängliga labbutrustning. Integreringen av en MBR-systemet gör öka experimentella genomströmning, vilket möjliggör stora besparingar i tid. Dock när du byter fullt instrumenterade och kontrollerbar bioreaktorer av MBR systems, måste skalbarhet av resultaten anses8,37,52,53. Användning av DOE metoder och matematisk modellering hjälper till att maximera mätdata med avseende på den studera objektiva54 datainnehåll genom effektiv experimentell planering och modell-baserade data tolkning15.
Ändringar till metoden
Bredvid flera syften och utbyggbart robotic vätskehanterande system som det som används i denna studie, bör det nämnas att det finns flera mindre vätskehanterande system kommersiellt tillgängliga som är kapabel att utföra denna uppgift och kan placeras inuti laminärt flöde arbete bänkar. Om ingen automatiserad pipettering system är tillgängliga, kan olika medier kompositioner enligt DOE planen också förverkligas genom manuell pipettering med enstaka eller flera kanaler pipetter. Eftersom manuell beredning är mer felbenägna och kommer kräva mycket fokuserat arbete för ganska lång tid, rekommenderas att förbereda ett lägre antal olika medier kompositioner.
Beroende på funktionerna i det sysselsatta MBR-systemet, kommer att motsvarande odling protokollet variera. Till exempel om ingen online mätning av biomassa bildandet är tillgänglig, kan det räcka att mäta biomassa koncentration efter avslutad tillväxt experimentet. I kombination med online-övervakning av pH och löst syre, som implementeras i flera MBR system, tillväxt mättnaden kan fastställas säkert. I princip kan de tillväxt-experiment genomföras i Mbps ensam placeras inuti skakar inkubatorer, utan användning av en MBR-systemet. I det här fallet korrekt odling villkor måste säkerställas: (1) syre-begränsad odlingar kan undvikas genom att använda Mbps med lämplig geometrier, i kombination med ordentlig skakar frekvenser och skakar diametrar, t.ex., torget 96 eller 24 djup plattor med drivs vid 1000 rpm på 3 mm throw eller vid 250 rpm på 25 mm throw, respektive. Ännu viktigare, ju lägre uppnås maximal syre överföringshastighet, desto lägre den huvudsakliga kolkälla bör koncentreras. Som nämnts ovan, för denna studie, var användningen av 10 g/L glukos lämplig för att förhindra att syre begränsning för de sysselsatta odling villkor; (2) provtagning av MTP kulturerna för biomassa och produkten kvantifiering bör minskas till ett minimum. Varje gång MTP tas bort från skakningar inkubatorn, syretransporten kommer omedelbart breaken-down som kan resultera i unfavorable odling villkor; (3) enligt författarna rekommenderas inte användning av MTP läsare som odling enheter som dessa enheter inte har utvecklats för detta ändamål. Till exempel skakningar mekanik byggdes för tillfällig blandning av mikroplattor efter reagens tillägg och således saknar ofta robusthet för långa serier av kontinuerlig skakningar varar i dagar. Dessutom kan inte tillräcklig ineffekt behövs för mikrobiell odlingar realiseras i dessa läsare. Integrationen av Absorbansavläsningar kort tidsintervall kräver stopp av skakningar rörelse, vilket resulterar i upprepade perioder av syre begränsning. Dessutom kommer avdunstning i sådana system över lång odling perioder snedvrida resultaten. För mer information om överraskande komplexa ämnet på att använda Mbps för mikrobiell odlingar, hänvisas till den citerade litteraturen22,23,24,25,26 och referenser däri.
Ytterligare överväganden
Speed-up iterativ optimering steg, är det klokt att noga välja den analytiska metoden för produkten kvantifiering. Snabba och enkla metoder att föredra på bekostnad av precision och noggrannhet, som strategin iterativ experimentell design tål experimentella felaktighet. Dock måste de slutliga resultaten verifieras mot tillräckligt precisa och korrekta produkten kvantifiering metoder som kan vara mer komplicerat. I allmänhet noggrann utvärdering och beslutsfattande om studien förfaranden kräver ansträngning i början av studien, men betalar på sikt, efter rutinmetoder har fastställts.
Det rekommenderas starkt att definiera ett referens-experiment som jämförs till alla experiment under optimeringen. Det vill säga är den tillämpad medium komponent koncentrationer samt uppmätta utdata normaliserade via divideras med referensvärden. På så sätt varje tillämpas och uppmätta värdet kan tolkas som x-luckan av referensvärdet. För att ta in i konto variationer mellan plattorna, utförs fem referens experiment på varje tallrik. Medelvärdet för de uppmätta resultatet används för normalisering.
Det kan generellt inte garanteras att det utveckla mediet är också optimal för andra stammar. Det förbättra mediet kommer troligen också dock lämpliga för odling uttrycket stammar med små genetiska skillnader, t.ex., när producerar enzymet varianter med enda aminosyra substitutioner erhållits från mutagenes studier ( även om ens enda punktmutationer har beskrivits att effekt cellulär metabolism och heterologa uttryck prestanda55,56). I detta fall kan presenteras protokollet vara ett första steg, följt av protokoll för hög genomströmning uttryck filmvisningar57. Om protokollet används för medium utveckling med efterföljande skala upp till fed-batch odlingar, bör optimerad medium kontrolleras för motsvarande bioprocess villkor, som klon screening kampanjer på den hur provtagningsutrustningen skall identifieras olika topp Artister för olika utfodring strategier och odling media52,58. Dessutom kan den introducerade KriKit36 generellt bidra till förbättrad holistisk bioprocess optimering.Nyligen utvidgades verktyg förmåga att också stödja flera mål optimering40, som kan vara viktiga för att optimera både uppströms och nedströms processer59,60.
The authors have nothing to disclose.
Den vetenskapliga verksamheten på bioekonomi Science Center stöddes ekonomiskt av ministeriet för Innovation, vetenskap och forskning inom ramen för den NRW-Strategieprojekt BioSC (nr 313/323-400-002 13). Författarna vill tacka de ministeriet för Innovation, vetenskap, och forskning av norr Rhine-Westphalia och Heinrich Heine universitetet Düsseldorf för ett stipendium till Lars Freier inom CLIB-examen kluster industriell bioteknik. Ytterligare finansiering mottogs från programmet aktivera Spaces ”Helmholtz Innovation Labs” tyska Helmholtz Association att stödja den ”mikrobiell Bioprocess Lab – A Helmholtz Innovation Lab”.
BioLector | m2p-labs | G-BL-100 | |
Flowerplate | m2p-labs | MTP-48-BOH | For cultivation in the BioLector device |
Sealing foil | m2p-labs | F-GP-10 | Sterile sealing for Flowerplate |
MATLAB | Mathworks | 2016b | |
KriKit | Forschungszentrum Jülich | n/a | Freely available, MATLAB installation required |
Janus pipetting robot | Perkin Elmer | n/a | Includes "WinPrep" software installation |
12-column deep well microplate | E&K Scientific | EK-2034 | Container for medium stock solutions |
96 well microplates, transparent, F-bottom | Greiner | 655101 | For Bradford protein assay |
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom | Greiner | 655087 | For flourescence measurement in cell-free supernatants |
Pipette Research plus multi-channel pipettes | Eppendorf | n/a | Facilitates manual liquid handling with microplates |
TruPAG Precast Gels | Sigma | PCG2002 | For SDS-Page analysis of cell-free supernantants |
Bradford Reagent | Sigma | B6916 | |
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP | n/a | n/a | Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007) |