Dette manuskript beskriver en generisk tilgang til skræddersyede design af mikrobielle dyrkning medier. Denne aktiveres af en iterativ arbejdsproces kombinere Kriging funderede eksperimenterende design og microbioreactor teknologi for tilstrækkelig dyrkning overførselshastighed, som støttes af lab robotteknologi til at øge pålidelighed og hastighed i flydende håndtering af medier forberedelse.
En kerneforretning inden for industriel bioteknologi ved hjælp af mikrobiel produktion cellefabrikker er den iterative proces af stamme engineering og optimering af bioproces betingelser. Et vigtigt aspekt er forbedringen af dyrkning medium at give et optimalt miljø for mikrobiel dannelsen af produktet af interesse. Det er godt accepteret, at medierne sammensætning dramatisk kan påvirke samlede bioproces ydeevne. Ernæring medium optimering er kendt for at forbedre rekombinante protein produktion med mikrobielle systemer og dermed, dette er en givende skridt i bioproces udvikling. Men meget ofte standard medier opskrifter er taget fra litteratur, da skræddersyet design af dyrkning medium er en kedelig opgave, der kræver microbioreactor teknologi for tilstrækkelig dyrkning overførselshastighed, hurtig produkt analytics og støtte af lab robotteknologi til aktiverer pålidelighed i flydende håndtering trin. Desuden er avancerede matematiske metoder nødvendige for rationel analysere måledata og effektivt designe parallelle eksperimenter såsom for at opnå optimal informationsindhold.
Den generiske karakter af præsenteres protokollen giver mulighed for nem tilpasning til forskellige lab udstyr, andre udtryk værter og target proteiner af interesse, samt yderligere bioproces parametre. Desuden kan andre optimering mål som protein produktion sats, specifikke udbytte eller produktkvalitet vælges passer til anvendelsesområdet for andre optimering undersøgelser. Den anvendte Kriging værktøjskasse (KriKit) er et generelt værktøj til Design af eksperimenter (DOE) det bidrager til forbedret holistisk bioproces optimering. Den støtter også multi objektive optimering, som kan være vigtige i at optimere både opstrøms og nedstrøms processer.
Moderne rekombinant genteknologi giver den omfattende brug af tekniske enzymer til forskellige applikationer i den farmaceutiske industri, dyrefoder, organisk kemi, og fødevareforarbejdning1,2,3. Produktion af tekniske enzymer i bulk mængder er et vigtigt emne for industriel bioteknologi og optimeret rekombinante protein produktion, og begge stamme og bioproces engineering er nødvendig. I generation af effektivt manipuleret produktionsstammer, forskellige genetiske biblioteker er tilgængelige, f.eks., for afbalanceret gen expression4 eller øget sekretion effektivitet5.
Corynebacterium glutamicum er en stor producent af aminosyrer på industriel skala6,7 og repræsenterer en attraktiv ikke-konventionelle udtryk vært for sekretoriske produktionen af rekombinante proteiner8 ,9. Både generelle sekretoriske (Sec) og twin-argininog translokation (Tat) pathway er til stede i C. glutamicum og blev med succes anvendt for rekombinante protein sekretion10. Omfattende erfaring i bioproces engineering aminosyre produktion i industriel skala samt evnen til at udskille proteiner til g/L beløb11 og stor robusthed vedrørende bioproces inhomogeneities fundet i stor skala, som udlæg til planteavl12,13, gøre C. glutamicum en lovende platform organisme for sekretoriske produktionen af heterolog proteiner i industriel skala.
Ernæring medium optimering er kendt for at forbedre rekombinante protein produktion med mikrobielle systemer14,15,16,17 og derfor justering i medium sammensætning er en givende skridt i bioproces udvikling med hensyn til optimal produktivitet18,19,20,21. Intens forskning om anvendelsen af mikrotiter plader (MTPs) for mikrobielle dyrkning22,23,24 banede vejen for udvikling og design af MTPs for mikrobiel dyrkning25 ,26 og udviklingen af MTP-baseret microbioreactor (MBR) systemer med online overvågning og miljømæssige styre27,28. MBRs aktiverer en betydelig stigning i eksperimentel dyrkning overførselshastighed. Desuden er MBR systemer stammer fra andre typer af bioreaktorer, f.eks., bubble kolonner eller omrørt tank reaktorer, tilgængelige for mikrobiel bioproces optimering29,30,31, 32.
I almindelighed, optimering undersøgelser drage fordel af øget eksperimentelle overførselshastighed, som bliver endnu mere magtfulde i kombination med DOE metoder, såsom at vurdere samspillet mellem design variabler eller reducere high-dimensionelle Søg rum. Derfor, den kombinerede brug af MBR systemer, lab automatisering og DOE har vist sig for at være en kraftfuld metode i bioteknologi8,16,33,34,35.
En protokol til media optimering præsenteres kombinerer state-of-the-art laboratorium automation, MBR teknologi med online proces overvågning og Kriging-baserede data analyse/eksperimentelle design. Kriging metode er gennemført i en MATLAB værktøjskasse (“KriKit”), som kan downloades og bruges gratis af afgift36. Som ansøgning eksempel, er maksimering af sekretoriske grønne fluorescent protein (NGL) produktion med C. glutamicum vist ved at optimere sammensætningen af CgXII minimal medium. Normal god landbrugspraksis titer blev valgt som optimering mål, som det kan kvantificeres nemt og det er almindeligt anvendt som model protein for studier på MBR systemer37,38,39.
De præsenterede rammer er opdelt i fire trin, som er illustreret i figur 1. Trinene er angivet med boks rammer og svarer til sektioner af protokollen. Det første skridt (figur 1A) er at definere projektets mål og fastlægge de nødvendige metoder. Kombinationen af DOE metoder, MBR teknologi og lab automation giver en øget eksperimentelle overførselshastighed, der kræver kraftig behandling af personoplysninger. Det andet trin (figur 1B) har til formål at afsløre følsomme design variabler (dvs., medium komponenter) med høj indflydelse på optimering mål. Dette fører til et begrænset antal design variabler. Det tredje trin (figur 1 c) består af en iterativ optimering for en mere detaljeret undersøgelse af den funktionelle relation mellem de resterende design variabler og mål af interesse. Hjælp af successivt udvidet data sæt, er Kriging tilgang anvendt til at forudsige det eksperimentelle resultat ikke målt steder. Iterativ cyklus stopper så snart Kriging model forudsiger en optimal eller plateau med tilstrækkelig nøjagtighed. Resultaterne verificeres i fjerde trin (fig. 1 d), begyndende med en yderligere følsomhedsanalyse omkring identificerede optimalt. Hvis i første omgang, ufølsom komponenter findes for at være ufølsom også i regionen optimalt, er det rimeligt at antage, at dette gælder under iterative optimering proceduren i det tredje trin. Bagefter, det anbefales at kontrollere optimering resultater ved anvendelse af ortogonale metoder, som en aktivitet assay eller SDS-Page.
Den generiske karakter af præsenteres protokollen giver mulighed for nem tilpasning til forskellige lab udstyr, andre udtryk værter og target proteiner af valg, samt yderligere bioproces variabler som pH værdi eller dyrkning temperatur.Derudover kan andre optimering mål som protein produktion sats, specifikke udbytte eller produktkvalitet vælges passer til anvendelsesområdet for andre optimering undersøgelser.
Figur 1 : Workflow af optimering undersøgelse. Fire ramme bokse svarer til sektioner af protokollen, “Opfatte den undersøgelse og Definition af metoder” (afsnit 1), “Følsomhedsanalyse” (afsnit 2), “Iterativ optimering” (afsnit 3) og “Validering” (afsnit 4). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Den generiske karakter af præsenteres protokollen tillader forskellige tilpasninger, f.eks.for at studere andre mikrobielle udtryk værter9,47,48,49,50, 51, eller at optimere andre egenskaber af target proteinet, ligesom glykosylering mønster eller disulphide obligationer. Protokollen skal muligvis også tilpasses til den tilgængelige lab udstyr. Integration af en MBR system giver mulighed for øget eksperimentelle overførselshastighed, som giver mulighed for store besparelser i tid. Dog, når du udskifter fuldt instrumenterede og kontrollerbar bioreaktorer af MBR systemer, skalerbarhed af resultater skal tages i betragtning8,37,52,53. Brugen af DOE metoder og matematisk modellering hjælper med at maksimere informationsindhold måleresultater, for så vidt angår de studerede objektive54 af effektiv eksperimentelle planlægning og model-baserede data fortolkning15.
Ændringer til metoden
Ved siden af multi-purpose og udvidelige robot flydende håndteringssystemer som den, der anvendes i denne undersøgelse, bør det nævnes at der er flere mindre væske håndteringssystemer kommercielt tilgængelige som er i stand til at udføre denne opgave og kan placeres inde i af laminar flow arbejde bænke. Hvis ingen automatiserede pipettering system er tilgængelig, kan forskellige medier kompositioner planmæssigt DOE også realiseres ved manuel pipettering ved hjælp af enkelt og/eller multi-kanal pipetter. Da den manuelle forberedelse er mere fejlbehæftet og vil kræve meget fokuseret arbejde i ganske lang tid, anbefales det at forberede et lavere antal forskellige medier kompositioner.
Afhængigt af den erhvervsdrivende MBR system egenskaber vil tilsvarende dyrkning protokollen variere. For eksempel, hvis nogen online måling af biomasse dannelse er tilgængelig, kan det være tilstrækkeligt at måle biomasse koncentration efter afslutningen af vækst eksperiment. I kombination med online overvågning af pH og oploest ilt, som er gennemført i flere MBR systemer, vækst mætning kan bestemmes sikkert. I princippet kan vækst eksperimenter foretages i MTPs alene placeret inde ryster væksthuse, uden brug af en MBR system. I dette tilfælde korrekt dyrkning betingelser skal sikres: (1) ilt-limited udlæg til planteavl kan undgås ved hjælp af MTPs med passende geometrier, i kombination med ordentlig ryster frekvenser og ryster diametre, fx, pladsen 96 eller 24 dyb godt plader drives ved 1000 rpm på 3 mm kaste eller på 250 rpm på 25 mm kast, henholdsvis. Vigtigere, jo lavere overførselshastighed kan opnås maksimal ilt, jo lavere vigtigste CO2-kilde skal være koncentreret. Som nævnt ovenfor, for denne undersøgelse, var anvendelse af 10 g/L glucose egnet til at forhindre ilt begrænsning for de erhvervsdrivende dyrkning betingelser; (2) prøveudtagningen MTP kulturer for biomasse og produkt kvantificering bør reduceres til et minimum. Hver gang MTP er fjernet fra ryster rugemaskine ilt overførsel vil straks opdeling som kan resultere i ugunstige dyrkning betingelser; (3) i udtalelsen fra forfatterne, er brugen af MTP læsere som dyrkning enheder anbefales ikke som disse enheder ikke er udviklet til dette formål. For eksempel, ryster mekanik blev bygget for lejlighedsvise blanding af mikroplader efter reagens tilsætning og ofte mangler derfor, robusthed for langture af kontinuerlig ryster varig for dage. Derudover kan ikke tilstrækkelig power input, der kræves for mikrobiel udlæg til planteavl realiseres i disse læsere. Integrationen af absorbansaflæsningerne i korte tidsintervaller kræver standsning af de rystende bevægelse, resulterer i gentagne perioder af ilt begrænsning. Derudover vil fordampning i sådanne systemer over lange dyrkning perioder fordreje resultater. For flere detaljer om den overraskende kompleks emne på ved hjælp af MTPs for mikrobiel udlæg til planteavl, henvises læseren til at de citerede litteratur22,23,24,25,26 og referencer heri.
Yderligere overvejelser
At speed-up iterativ optimering trin anbefales det at omhyggeligt vælge analysemetode for produkt kvantificering. Hurtige og enkle metoder bør foretrækkes på bekostning af præcision og nøjagtighed, da iterative eksperimentelle design strategi tolererer eksperimentelle unøjagtighed. Dog skal de endelige resultater kontrolleres mod tilstrækkeligt præcise og nøjagtige produkt kvantificering metoder, der kan være mere kompliceret. I almindelighed, omhyggelig vurdering og beslutningstagning om undersøgelse procedurer kræver indsats i begyndelsen af undersøgelsen, men betale i det lange løb efter rutinemetoder har opstillet.
Det anbefales stærkt at definere en reference eksperiment, der er i forhold til alle eksperimenter under optimeringen. Det vil sige, er den anvendte medium komponent koncentrationer samt målte output normaliseret via dividere med referenceværdier. På denne måde, hver gælder og målte værdi kan fortolkes som x-fold af referenceværdien. For at tage til variationer mellem pladerne, udføres fem reference forsøg på hver plade. Middelværdien af de målte udfald bruges til normalisering.
Det kan generelt ikke garanteres, at den udviklede medium er også optimal til andre stammer. Dog vil forbedret medium højst sandsynligt også være passende til at dyrke udtryk stammer med små genetiske forskelle, f.eks., når producerer enzym varianter med enkelt aminosyre udskiftninger opnået fra mutagenese undersøgelser ( Selvom endnu enkelt punkt mutationer har betegnet effekt cellulære metabolisme og Heterolog ekspression ydeevne55,56). I dette tilfælde kan den præsenteres protokol være et første skridt, efterfulgt af protokoller for høj overførselshastighed udtryk screeninger57. Hvis protokollen bruges til mellemstore udvikling med efterfølgende opskalering til fed-batch udlæg til planteavl, bør optimeret medium efterprøves i forhold til de tilsvarende bioproces, som klon screening kampagner på individuel identificeret forskellige top kunstnere til forskellige fodringsstrategier og dyrkning media52,58. Derudover kan de indførte KriKit36 generelt bidrage til forbedret holistisk bioproces optimering.For nylig blev værktøj evner udvides også understøtter multi objektive optimering40, hvilket kan være vigtigt for at optimere både opstrøms og nedstrøms processer59,60.
The authors have nothing to disclose.
De videnskabelige aktiviteter af Bioeconomy Science Center blev økonomisk støttet af Ministeriet for Innovation, videnskab og forskning som led i NRW-Strategieprojekt BioSC (nr. 313/323-400-002 13). Forfatterne takke Ministeriet for Innovation, videnskab, og forskning i Nordrhein-Westfalen og Heinrich Heine Universitet Düsseldorf for et stipendium til Lars Freier inden for CLIB-kandidat klynge industriel bioteknologi. Yderligere finansiering blev modtaget fra aktivering rum Program “Helmholtz Innovation Labs” af tyske Helmholtz Association til at støtte den “mikrobiel bioproces Lab – A Helmholtz Innovation Lab”.
BioLector | m2p-labs | G-BL-100 | |
Flowerplate | m2p-labs | MTP-48-BOH | For cultivation in the BioLector device |
Sealing foil | m2p-labs | F-GP-10 | Sterile sealing for Flowerplate |
MATLAB | Mathworks | 2016b | |
KriKit | Forschungszentrum Jülich | n/a | Freely available, MATLAB installation required |
Janus pipetting robot | Perkin Elmer | n/a | Includes "WinPrep" software installation |
12-column deep well microplate | E&K Scientific | EK-2034 | Container for medium stock solutions |
96 well microplates, transparent, F-bottom | Greiner | 655101 | For Bradford protein assay |
µclear 96 well microplates, black body, transparent F-bottom | Greiner | 655087 | For flourescence measurement in cell-free supernatants |
Pipette Research plus multi-channel pipettes | Eppendorf | n/a | Facilitates manual liquid handling with microplates |
TruPAG Precast Gels | Sigma | PCG2002 | For SDS-Page analysis of cell-free supernantants |
Bradford Reagent | Sigma | B6916 | |
C. glutamicum pCGPhoDBs-GFP | n/a | n/a | Carries pEKEx2 plasmid with fusion of GFP gene and PhoD signal peptide from B.subtilis as expression insert. Plasmid provides kanamycin resistance. Described and published by Meissner et al. Appl Microbiol Biotechnol 76 (3), 633–42 (2007) |